2-2-1 前言
近年來，毛細管電泳因其具有高效、快速且可用於微量樣品分析的優 點，在生物與化學分析領域上大放異彩，發展十分迅速，將毛細管電泳應 用於中藥的分析，也已有很多論文發表，1998 年本實驗室黃明星學長成功 開發了桂枝藥材小分子成分之 HPLC 及 MEKC 分析方法[89]，本文嘗試以 毛細管電泳來分析桂皮中單寧成份，並藉此比較 HPLC 和 CE 在桂皮單寧 分析上的優缺點及適用性。
桂皮單寧的藥效和成分說明如本章之前 2-1-1 所述。第一節的高效能 液相層析法已成功分離桂皮中的七種指標成分，但所費時間冗長（60 分 鐘），故希望能開發更快速有效的方法。由該節之敘述中可得知桂皮單寧 成分之結構以苯酚居多，在高 pH 值環境下很容易解離成陰離子，但因分 子量大相對帶電量偏低，故考慮以微膠粒電動毛細管電泳（MEKC）分析 這些成分。
2-2-2 實驗部分
2-2-2-1 實驗藥品
1. 桂皮的指標成 1-7 為大仁技術學院林大禎博士提供。
2. 內 標 準 品 bezoic acid 購 自 Acros (New Jersey, USA) ； sodium borate(Na2B4O7) 購 自 Acros (New Jersey, USA) ； 界 面 活 性 劑 sodium cholate (SC)、sodium dodecylsulfate (SDS)購自Sigma (St. Louis, MO, USA)；磷酸購自Acros (New Jersey, USA)。
3. 異丙醇(isopropyl alcohol)、甲醇(Methanol)、氰甲烷(Acetonitrile)購自 Merck(Darmatadt,Germany)。
4. 配 置 樣 品 及 流 動 相 的 去 離 子 水 (deionized water) 取 自 於 Milli-Q System(Millipore, Bedford,MA,USA)。
2-2-2-2 實驗儀器
1. 毛細管電泳系統：Spectra PHORESIS 1000
管柱：70 cm× 75 μm I.D.uncoated (J&W Scientific, USA)，管柱長度70 cm，有效長度62 cm。
偵測器：on-line UV detector 210 nm 數據積分處理系統：OS/2 system
PHORESIS 1000 v1.05b PC1000
2. 酸鹼度計(pH meter)：SP 2000(Suntex Instruments Co.,LTD) 3. 高速離心計：Hettich Universal D-7200 10 mL× 12
4. 超音波震盪器：Elma Transsonic Digital
2-2-2-3 最佳分析條件
3.在每次樣品分析前，去離子水3分鐘(30℃)，0.1 M NaOH 3分鐘(30℃) 及緩衝溶液4分鐘(25℃)。
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2-2-2-4 緩衝溶液的選擇
(1)不同硼酸鈉濃度的探討
配製含 20mM SC 及一系列不同濃度的硼酸鈉溶液（15、20、25、30 和 35 mM），並以 10% H3PO4調 pH 值至 7.00，再加入小量異丙醇（7%），
配製成系列緩衝溶液，以探討硼酸鈉濃度對桂皮單寧成分分離的影響，各 緩衝溶液重覆操作三次。
(2)不同pH值的探討
在 20mM SC 及 25mM 硼酸鈉溶液中，加入不等量的 10% H3PO4使 pH 值分別為 6.50、7.00、7.50、8.00 和 8.50，再加入異丙醇（7%），配製成 系列緩衝溶液，以探討不同 pH 值對桂皮單寧成分分離的影響，各緩衝溶 液重覆操作三次。
(3)不同種類有機修飾劑的探討
在20mM SC及25mM硼酸鈉溶液中，以10% H3PO4調pH值至7.00，分 別加入異丙醇、甲醇、氰甲烷，依7%、15%不同比例，配製成系列緩衝溶 液，以探討不同種類有機修飾劑對桂皮單寧成分分離的影響，各緩衝溶液 重覆操作三次。
(4)不同比例有機修飾劑的探討
在 20mM SC 及 25mM 硼酸鈉溶液中，以 10% H3PO4調 pH 值至 7.00，
再加異丙醇，依 10%、7%、5%、3.5%、2.5%和 0%不同比例（V/V），配 製成系列緩衝溶液，以探討不同比例有機修飾劑對桂皮單寧成分分離的影 響，各緩衝溶液重覆操作三次。
(5)不同 SC 濃度的探討
配製含 25mM 硼酸鈉濃度及加入 SC 配製分別為 20、25、30 和 35 mM 等不同濃度的 SC 溶液，並以 10% H3PO4調 pH 值至 7.00，再加異丙醇
（7%），配製成系列緩衝溶液，以探討不同 SC 濃度對桂皮單寧成分分離 的影響，各緩衝溶液重覆操作三次。
2-2-2-5 配製標準品溶液及製作檢量線
稱取7.8 mg 的benzoic acid 以70%甲醇配成25 mL溶液，做為內標準品 溶液(IS)。
分別稱取 (+) – catechin (1) 3.1 mg， (-) – epicatechin (2) 3.2 mg，
Procyanidin B-1 (3) 3.5 mg， Procyanidin B-2 (4) 3.2 mg，Arecatannin A1 (5) 3.1 mg，Cinnantannin B2 (6) 1.1 mg， Cinnantannin C2 (7) 3.2 mg，溶 於 70%甲醇，分別配成 10 mL 標準品母液 1-7 【I】。
分別以吸量管取標準母液【I】中(+) – catechin (1)6.0mL、Procyanidin B-1 (3) 6.0 mL為標準母液【II】，分別取標準母液【II】5.0、3.0、2.0、1.0、
0.5 mL之標準品於量瓶中，各加入1.0 mL之內標準品溶液，再以70%甲醇 配成10 mL溶液。
分別以吸量管取標準母液【I】中(-) – epicatechin (2)4.0mL、Procyanidin B-2 (4) 4.0 mL、Arecatannin A1(5) 8.0 mL為標準母液【III】，分別取標準 母液【III】4.5、3.5、3.0、2.5、1.5、0.5 mL之標準品於量瓶中，各加入1.0 mL之內標準品溶液，再以70%甲醇配成10 mL溶液。
分 別 以 吸 量 管 取 標 準 母 液 【I】 中 Cinnantannin B2 (6) 8.0 mL Cinnantannin C2 (7) 4.0mL為標準母液【IV】，分別取標準母液【IV】5.0、
3.0、2.0、1.0、0.5 mL之標準品於量瓶中，各加入1.0 mL之內標準品溶液，
再以70%甲醇配成10 mL溶液。
各濃度的標準品1-7，分別在210 nm波長下，以2-2-2-3之最佳分析條 件，各濃度重覆三次注射，取其平均值作檢量線。
2-2-2-6 分析條件之適宜性的評估
(1)再現性(Reproducibility)
取標準母液【II】1.0 mL、標準母液【III】1.0 mL及標準母液【IV】
1.0 mL於量瓶中，加入1.0 mL之內標準品溶液，以70%甲醇水溶液稀釋至
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10mL，作為檢液。同一天內重覆六次 ( intraday )，不同天總計重覆六次 ( interday ) 。
(2)回收率(Recovery)
精稱桂皮粉末 1.2 g，以70%甲醇10 mL作為萃取溶劑，超音波震盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至10 mL，取5mL於10mL量瓶，
加入0.5 mL標準母液【II】、0.5 mL標準母液【III】及0.5 mL標準母液【IV】， 再加入1.0 mL之內標準品溶液，以70%甲醇水溶液稀釋至10 mL經 0.45μm 濾膜過濾，作為檢液。以2-2-2-3之最佳分析條件重覆三次分析，取其平均 值，計算回收率。
(3)偵測極限
將各檢量線之最低濃度檢測液，逐步稀釋，每次稀釋一倍，注入分析，
直至S/N < 3/1為止，計算其偵測極限。
2-2-2-7 藥材之定量分析
精稱桂皮粉末 1.3 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，經 0.45 μm 濾膜過濾，作為檢液。以 2-2-2-3 之最佳分析條件重覆三次分析，取 其平均值。
2-2-3 結果與討論
2-2-3-1 最佳分析條件之選擇
以本實驗室在 2001 年用於分析桂枝的 MEKC 條件為基礎，進行桂枝 分析方法開發[89]，該論文用 30mM SDS(sodium dodecyl sulfate)、18 mM 硼酸鈉和 12.5%的異丙醇作為緩衝溶液。結果發現該分析條件並無法將 1-4 分離，但添加 SDS 的多寡對各成分之遷移時間確有很大的影響，SDS 濃度 越高，遷移時間越往後移；用 SC(sodium cholate)取代 SDS，能成功的將桂