2-2-3-1.1緩衝溶液的條件選擇
(1)不同硼酸鈉濃度的探討
為了探討硼酸鹽濃度對桂皮單寧成分分離的影響，在 20 mM SC 中，
加入硼酸鈉配製 15、20、25、30 和 35 mM 等不同濃度的硼酸鈉溶液，並 以 10% H3PO4調 pH 值至 7.00，再加入異丙醇（7%），配置成一系列緩衝 溶液，分析結果如圖 2-2-1。
硼酸鈉濃度增加，會使離子強度增加，電流變大，增加 EOF 速度，減 少各成分的遷移時間；此外，當硼酸鈉濃度由 15mM 增加到 35mM 時，電 流強度會由 58μA 增加到 86μA 。
各成分的離子強度不同，往後遷移的速度亦不同，所以會造成分析物 與未知物間有所重疊；不同硼酸鈉濃度下，分析物間的解析度，整理如表 2-2-1；1/2、3/4的解析度，隨硼酸鈉濃度增加而減少，但5/6和6/7的解析 度，隨硼酸鈉濃度增加也增加，綜合比較之下，以硼酸鈉濃度為 25mM 時 的解析度最佳。
表 2-2-1 不同硼酸鈉濃度對解析度的影響 濃度 15 mM 20 mM 25 mM 30 mM 35 mM 電流(μA) 58 62 68 75 86
1/2 1.11 1.10 1.12 0.89 0.57 4/3 1.27 1.28 1.27 0.93 0.67 5/6 0 0 1.45 1.46 1.67 6/7 0 0 2.02 2.72 2.60
(2)不同pH值的探討
為了探討不同 pH 值對分析成分的影響，在 20Mm SC 及 25mM 硼酸 鈉中，分別以 10 % H3PO4調 pH 值至 6.50、7.00、7.50、8.00 和 8.50，再
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加入異丙醇（7%），配置一系列的緩衝溶液。圖 2-2-2 為不同酸鹼值下，
各成分的遷移時間圖。
採不同的無機酸配製 pH 值會影響單寧成分的分離，用 HCl 調配 pH 值時化合物 1~7解析度較差，改用 10%的 H3PO4配製 pH 值就可使桂皮之 單寧成分有效分離。
緩衝溶液的酸鹼值會影響醇基的解離，造成不同的淌度，並產生不同 的分離效果。由圖 2-2-2 來看，隨著 pH 值增加，EOF 延後，會導致所有 化合物的遷移時間往後延。
遷移時間延後，理論上各成分應該可以分離，但因各成分淌度不同，
往後遷移速度亦有不同，會造成解析度的差異。下表 2-2-2 可以發現，當 pH 值高於 7.50，1/2、4/3、5/6無法分離，pH=6.50 的 5/6、6/7解析度不理 想；綜合比較之下，以 pH=7.00 為最佳分析條件的酸鹼值。
表 2-2-2 不同 pH 值對解析度的影響 pH 值 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50
1/2 1.12 1.12 0 0 0 4/3 1.14 1.27 0 0 0 5/6 0.53 1.45 1.59 1.11 0 6/7 0.71 2.02 1.82 1.60 0.73
(3) 不同種類有機修飾劑的探討
為了探討不同有機修飾劑對成分分離的影響，在 20mM SC 及 25mM 硼酸鈉中，以 10%的 H3PO4調 pH 值至 7.00，再與異丙醇、氰甲烷和甲醇，
依 7%和 15%等不同比例，配成一系列的緩衝溶液，以探討有機修飾劑對 桂皮單寧成分分離的影響；各分析成分在不同比例的有機修飾劑下。有機 修飾劑比例越高，各成分遷移時間越往後延，反而不易分離，由下表 2-2-3
可知當氰甲烷和甲醇比例越高時，雖然 1/2、3/4 解析度非常好但 5/6、6/7 卻無法分離。所以綜合比較之下，還是以異丙醇比例為 7%時最佳。
表 2-2-3 不同有機修飾劑對解析度的影響
Rs 異丙醇 異丙醇 氰甲烷 氰甲烷 甲醇 甲醇
7.0% 10% 7.0% 15% 7.0% 15%
1/2 1.12 0 1.21 2.04 1.12 1.45 4/3 1.21 0 1.53 2.01 1.33 1.32
5/6 1.45 1.12 0 0 0 0
6/7 2.02 2.00 0 0 0 0
(4)不同比例有機修飾劑的探討
為了探討有機修飾劑對分析成分的影響，在 20mM SC 及 25mM 硼酸 鈉中，以 10%的 H3PO4調 pH 值至 7.00，再加異丙醇，依 0%、2.5%、3.5%、
5%、7%和 10%等不同比例，配成一系列的緩衝溶液，以探討有機修飾劑 濃度對桂皮單寧成分分離的影響；各分析成分在不同比例的有機修飾劑 下，遷移時間的變化，整理如圖 2-2-3。
添加有機修飾劑會增加緩衝溶液的黏滯性[90]及降低偶電層的 zeta 勢，因而降低了 EOF 速度，使遷移時間往後面延遲出現；由下表 2-2-4 當 異丙醇的比例由 0%增加到 5%時，成分 6/7 仍無法分離，增加到 7％各成 分的解析度均大於 1，但比例增加到 10%時，成分1/2、3/4反而無法分開；
綜合以上探討，以異丙醇 7%之比例為最佳分析條件。
表 2-2-4 不同異丙醇比例對解析度的影響
Rs 0 % 2.5 % 3.5 % 5.0 % 7.0 % 10 % 1/2 1.20 1.16 1.14 1.12 1.12 0 4/3 1.23 1.22 1.22 1.21 1.21 0 5/6 0 0 0.74 0.82 1.45 1.12
6/7 0 0 0 0 2.02 2.00
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(5)不同SC濃度的探討
為了探討 SC 濃度對桂皮單寧成分分離的影響，在 25 mM 硼酸鈉中，
加入 SC 配製 20、25、30 和 35 mM 等不同濃度的 SC 溶液，並以 10% H3PO4
調 pH 值至 7.00，再加入異丙醇（7%），配置成一系列緩衝溶液，分析結 果如圖 2-2-4。
本實驗曾嘗試以 SDS 進行分析，發現無法分離 1、2、3 和 4 四種成分，
因此仍以 SC 進行 MEKC 分析。
SC 為一種膽酸鹽，其 CMC（臨界微膠粒濃度）為 14.0 mM [91]，從 圖亦可看出 SC 濃度為 10 mM 時，根本無法分離 5、6 和 7 三種成分，也 無法分離 1、2、3 和 4，這是因為要形成微膠粒，界面活性劑濃度必須在 CMC 以上方可進行 MEKC 的分離。由圖可看出幾乎所有成分的遷移時間 皆隨 SC 濃度增加而增加。各成分在不同 SC 濃度下的解析度列於表 2-2-5，
SC 濃度增加至 20 mM 時，即有不錯的分離效果，當濃度增加至 35 mM 時，
除了分析時間加長，對於分離效果幫助不大，因此採取 20 mM 之 SC 進行 分析。
不同異丙醇比例對 SC 濃度對解析度之影響，由表 2-2-6 可看出 SC 濃 度越大對1/2、3/4之解析度越好，但對5/6、6/7之解析度則越差；而異丙 醇的比例越小對5/6、6/7解析度越好，但對 1/2、3/4之解析度越差，綜合 比較之後取決於 7%異丙醇和 20 mM SC 為最佳分析條件。
表 2-2-5 不同 SC 濃度對解析度之影響 Rs 10 mM 20 mM 25mM 30 mM 35 mM 1/2 0.64 1.12 1.11 1.14 1.20 4/3 0.50 1.21 1.20 1.18 1.22 5/6 0 1.45 0.65 0 0
6/7 0 2.02 0 0 0
表 2-2-6 不同異丙醇比例對 SC 濃度與解析度之影響
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8 10 12 14 16 18 20
15 20 25 30 35
Sodium Borate conc.(mM)
Migration time (min)
1 2 3 4 5 6 7
圖 2-2-1 硼酸鹽濃度與遷移時間的關係
13 14 15 16 17 18 19 20
6.5 7 7.5 8 8.5
pH value
Migration time (min)
1 2 3 4 5 6 7
圖 2-2-2 pH 值與遷移時間的關係
59
12 13 14 15 16 17 18 19
0 2.5 3.5 5 7 10
isopropanol cono.(%)
Migration time (min)
1 2 3 4 5 6 7
圖 2-2-3 異丙醇比例（v/v）與遷移時間的關係
圖 2-2-4 SC 濃度與遷移時間的關係
13 14 15 16 17 18 19 20
10 20 25 30 35
SC cono.(mM)
Migration time (min)
1 2 3 4 5 6 7
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2-2-3-2 檢量線之製作
依實驗部分 2-2-2-5 所述，以吸收峰面積與內標準品面積之比值（y）
與各成分濃度（x，mg/mL）之關係，作圖得檢量線如下：
表 2-2-7 桂皮各單寧成分在最佳條件下的檢量線 y=ax+b
線性範圍 Slope Intercept R2 Compound
(µg/mL) a b 1 (+) – catechin 7.1 – 71.0 10.064 +0.497 0.9994 2 (-) – epicatechin 24.0 – 72.0 83.041 -1.419 0.9996 3 Procyanidin B-1 8.0 – 82.0 4.929 +0.199 0.9991 4 Procyanidin B-2 24.0 – 72.0 53.289 -0.736 0.9992 5 Arecatannin A1 46.5 – 148 18.282 -0.678 0.9991 6 Cinnantannin B2 22.0 – 60.8 1.029 +0.009 0.9991 7 Cinnantannin C2 10.7 – 74.4 1.092 +0.114 0.9994
＊y=peak-area ratio,x=conc.(mg/mL)
2-2-3-3 分析條件之適宜性之評估
(1)再現性(reproducibility)
以最佳分析條件對各成分1-7進行定量，同一天內連續重覆注射六次 (intraday)及不同天總計重覆六次(interday)，記錄其面積比（面積/內標準品 面積）及遷移時間，計算其相對標準偏差。同一天的滯留時間相對標準偏 差可在1.12 – 1.95%，不同天的滯留時間相對標準偏差可在2.20 – 3.18%之 間。
同一天的面積比相對標準偏差在1.85 – 2.91%之間，不同天的面積比 相對標準偏差在1.38 – 2.98%之間。
表 2-2-8 桂皮單寧分析條件之再現性 signal/noise = 3/1以下，記錄此時的濃度及注入量。結果如表2-2-9。表中亦 附上最佳分析條件時的理論板數。 injection volume=2.5 µL/sec，injection time=3 sec
column diameter=75µm
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2-2-3-4 桂皮藥材定量結果
取市售桂皮藥材三批（n=3）萃取液進行定量，每一樣品重覆注射3次，
求各成分含量之平均值，結果如表2-2-10。層析圖譜如圖2-2-5。
表 2-2-10 桂皮藥材單寧成分之定量結果（n=3）
化合物 代碼 mean±SD
（mg/g）
(+) – catechin 1 - (-) – epicatechin 2 - Procyanidin B-1 3 0.011 ± 0.008
Procyanidin B-2 4 0.552 ± 0.006 Arecatannin A1 5 15.91 ± 0.008 Cinnantannin B2 6 13.69 ± 0.015 Cinnantannin C2 7 29.76 ± 0.008 Total 59.92 ± 0022
(-為低於偵測極限)
圖 2-2-5 桂皮單寧之電泳層析圖 (A)標準品 (B)藥材
（成分結構圖，如圖 2-1-3 pp.20-21）
B
A
B
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圖 2-2-6 桂皮單寧之電泳層析圖 (A)添加 SC (B)添加 SDS
（成分結構圖，如圖2-1-3 pp.20-21）