Chapter 3. Determining ploidy and DNA content in mulberry
第三章 桑樹倍數體及 DNA 含量之鑑定
3.1 摘要
桑樹形態變異大，但部份品系之外觀大於其化品系且不稔，疑為多倍體。為 瞭解臺灣桑樹（Morus spp.）種原之倍體數，自苗栗區農業改良場，選出 26 個桑 樹品種（系），取其幼葉製備細胞核懸浮液，以流式細胞儀進行分析。各樣本基 因體以雞紅血球細胞核（CEN, 2.5 pg）為對照標準品，計算 DNA 含量。結果可大 致分為兩類，山桑（M. bombycis）、白桑（M. alba）、魯桑（M. latifolia）、島桑
（M. australis）、臺灣桑（M. formosensis）及廣東桑（M. atropurpurea）之 DNA 含量為0.61-0.71 pg/2C，屬於二倍體。而 70C007（M. laevigata）為三倍體，DNA 含量為1.06 pg/2C。特別的是，67C001（M. australis）觀察到基因組各為 0.63 pg/2C 的二倍體和0.98 pg/2C 的三倍體株，形態上的差異係因倍體數不同造成。二倍體 與三倍體品種（系）在葉寬、葉柄寬及節間長等營養性狀有顯著差異。本試驗結 果可提供後續育種及其他研究之參考。
關鍵字：染色體數、多倍體、形態性狀、節間長
3.2 前言
桑樹（Morus spp.）為臺灣極具經濟價值的多年生木本，葉可飼蠶，果實供鮮 食及加工之用，近年來陸續發現其根、枝條、葉片及果實中具機能性成份（王, 2003;
陳等人, 2004; Asano et al., 1994），使得桑樹及衍生產業備受矚目。桑樹多為雌雄 異株，行異花授粉，形態變異大，但部份品種（系）之葉、枝條或果實等性狀皆 大於其他品種（系），且不稔或結實不良，疑有多倍體品種（系）存在（張, 2006）。
多倍體常在外觀形態、細胞組織及染色體等層次明顯不同，外觀上，多倍體 桑樹葉片及枝條等性狀大於二倍體，細胞層次中，多倍體的體細胞與花粉母細胞 較二倍體者大（關和押金, 1963），保衛細胞之葉綠體數量亦會隨倍體數增加而增 加（Sujathamma et al., 2002）。染色體計數為確定物種倍體數的主要方式，Tahara
（1910）確認桑之染色體基數 x = 14，現已知大部份桑樹為 2 倍體，但亦有 3、4、
6、8 倍體之品種（系）（儲和孫, 1986;大澤, 1916; 関, 1959; Janaki-Ammal, 1948），
黑桑（M. nigra L.）中有 22 倍體品種（系）之記錄（2n = 308）（吳, 1964），可 知桑屬植物的倍體數變化頗大，而分類於同種的桑樹品種（系），倍體數可能不 一致（儲和孫, 1986）。
傳統染色體觀測係使用植物根尖及頂芽等細胞分裂旺盛的植物細胞為材料，
計算體細胞分裂中期之染色體數目。近年發展出流式細胞儀技術，可在流體狀態 計數顆粒（細胞或核）的數目或其螢光染色之強度。將懸浮細胞核以螢光染劑（如 Propidium iodide 等）染色，偵測細胞核顆粒通過雷射光束後所被激發出螢光強度，
由偵測器收集螢光訊號，經轉換成電子訊號後，利用軟體分析訊號，即可快速鑑 定樣本DNA 含量（Greilhuber, 1983; Michaelson et al., 1991）。染色體數目與細胞 核DNA 含量有密切的正相關（Black and Beckman, 1983; Costich et al., 1993），可 用於鑑定植物中的倍體數（De Laat et al., 1987; Costich et al., 1993; Ozias-Akins et
al., 1994; Lin et al., 2001; Meng et al., 2002）。
臺灣桑樹之種類繁多，但有關其染色體數之研究闕如，本試驗以流式細胞分
析技術鑑別26 個桑樹品種（系）之 DNA 含量，並以新一の瀨（2n = 28）為桑樹 之標準品種（系），估算倍體數，與形態資料進行對照，俾供育種工作參考。
3.3 材料與方法
3.3.1 試驗樣本的擇定
試驗材料取自苗栗區農業改良場，擇用品種（系）參考舊有分類系統（張, 2006），自臺灣桑樹七大系統，各種（species）挑選 1 至 3 個品種、雜交種 6 種及未鑑定桑3 種，共 26 個品種（表 3.1）。每品種（系）皆有 1~3 株重複，
每重複取二片新葉分析。狀況一致的葉片樣本可獲得一致的結果，預試驗中，
取用最大展開葉、甫展開的新葉及尚包覆在芽上約三公分長的新葉。觀察到三 公分長的新葉倍體數的狀況並不穩定，不適用以估算，而最大展開葉的葉片雖 可讀到明顯的訊號峰，但是其訊號峰波幅較寬，而雜訊較多，Yamanouchi 等 (2008)亦有觀察到類似情況。故以甫展開的新葉作為分析，可得到明顯且波幅 較集中的訊號峰。取得樣品，置於4℃下保存並在 5 日內分析完畢。
3.3.2 細胞懸浮液製備
細胞懸浮液之製備參考Galbraith 等人（1983）。取樣時，每片新葉小心避 開主葉脈及側葉脈，選擇葉片中段、面積約0.79 cm2之葉圓片，加入1 mL G-buffer (45 mM MgCl2‧6H2O, 30 mM sodium citrate, 20 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonate, 1 % Triton-X 100,及使用前方加入之 0.5 %
2-mercaptoethanol)，以刮鬍刀片將葉片組織切碎，使細胞核懸浮於 G-buffer 中。
細胞核懸浮液以30 μm 孔徑之尼龍濾網過濾後置於冰浴槽中備用。
3.3.2 基因體估算之標準液製備
於 1 mL G-buffer 中加入一滴雞紅血球細胞（chicken erythrocyte nuclei, CEN, genome size = 2.5 pg，BioSure）即完成。
3.3.3 樣品液及標準液之染色、配製
桑樹樣品的細胞懸浮液及標準品各加入propidium iodide (50 μg/mL)及 RNase (10 μg/mL)，於 4℃下處理約 1 小時後，即進行混合及分析。
所有桑樹品種（系）樣品之細胞懸浮液各取240 μL，與 30 μL 雞紅血球標 準品混合，作為估算各品種（系）基因體大小之樣品，即可進行分析。
3.3.4 流式細胞儀的分析設定
細胞核懸浮樣品係以Epics Elite ESP 流式細胞儀（Beckman Coulter Electronics, Hialeah, Florida）分析，儀器之備有 15 mV 之 488 nm 氬離子雷射光 束，樣品上機後，收集600-640 nm 之螢光（PMT4），並調整激發之電壓，將 樣品之訊號集中在channel 的第二至第八格 。每一組樣品混合液皆讀取 10000 個以上的懸浮核，且樣品結果的變異係數需小於百分之五。讀取後的結果以 WinMDI 2.9 (Flow Cytometry Core Facility, Scripps Research Institute;
http://facs.scripps.edu/software.html) 編輯分析。
3.3.5 基因體及倍數體估算
桑樹基因體大小以下列公式估算：樣本的 DNA 含量 (pg/2C) = 2.500 pg/2C
× 樣本螢光訊號的波峰值 ÷ CEN 螢光訊號的波峰值。
新一の瀨(M. alba)已知 2n = 2X = 28，故作為估算桑樹倍體數的參考品種
（系）。先求各品種（系）與新一の瀨DNA 含量之相對比例後，再計算其倍 體數。相對比例 = 樣本平均 DNA 含量 (pg/2C) ÷ 新一の瀨的 DNA 含量
(pg/2C)；倍體數 = 2 × 相對比例。
3.3.6 統計分析
各種之DNA 含量以 COSTAT ver. 6.2（CoHort Software, USA）進行最小顯 著差異分析（Least significant difeerence, LSD），分析各種間是否有顯著差異
（P≦0.05）。
3.3.7 性狀評估
為瞭解倍數體及性狀表現的關係，調查26 個品種（系）的葉長、葉寬、葉 柄長、葉柄寬、葉片厚度、節間長、休眠需冷量等七個營養性狀，依據倍體數 的結果，區分為二倍體品種（系）及三倍體品種（系），以t 檢測（Singh and Chaudhary, 1985）分析倍體數間性狀差異。
3.4 結果
3.4.1 基因體大小及倍體數分析
以CEN（2.500 pg）估算出白桑‘新一の瀨’（Morus alba, 2n = 2X）之 DNA 含 量為0.655 pg/2C，再以 CEN 估算其餘品種（系）之 DNA 含量，估算結果另與‘新 一の瀨’之 DNA 含量進行比較，推算其餘品種（系）之倍體數。參試品種（系）
可分為兩類（表3.1），一為長果桑‘70C006’（圖 3.1(A)）及島桑‘67C001-B’，DNA 含量各為1.06 pg/2C 及 0.98 pg/2C，推測為三倍體。其餘品種（系）之 DNA 含量 約0.61- 0.71 pg/2C，推測為二倍體，包含山桑‘劍持’，島桑‘67C001-A’、‘58C307’、
‘台桑 1 號’， 臺灣桑‘58C398’、‘58C495’、‘67C002’，廣東桑‘46C019’、‘46C020’、
‘苗栗 1 號’，白桑‘改良鼠返’、‘新一の瀨’（圖 3.1(A)）、‘枝垂桑’，魯桑‘厚葉綠’、
‘雲龍桑’、‘湖喜’，雜交桑‘台桑 2 號’、‘台桑 3 號’、‘68H22021’、‘68H22033’、
‘74H2006’、‘74H2047’及未鑑定桑‘93C203’、‘94C001’、‘白果桑’。
將歸於同種之品種（系）DNA 含量數值，經平均後進行統計分析（表 3.1），
魯桑及山桑平均DNA 含量各為 0.670 pg/2C 及 0.660 pg/2C，略大於其他種的 0.632
~ 0.647 pg/2C，魯桑、山桑與臺灣桑有顯著差異外，其餘種間差異不大。雜交桑
‘74H2006’、‘74H2047’的雜交親本為‘46C019’與‘台桑 3 號’，子代的 DNA 含量介於 兩親本間。此外，‘68H22021’、‘68H22033’亦為 46C019 的雜交子代，基因體大小與 親本之間無顯著差異。
表3.1、26 個桑樹品種（系）之倍數性、花性、收集來源、平均細胞核 DNA 含量
Table 3.1. The ploidy, species, sexuality, origins, mean DNA content and relative ratio
of 26 Morus spp. accessions.
種
(Kairyonezumigaeshi) ♂ 日本 0.679
新一の瀨 (Shinichinose) ♀ 日本 0.655
*Nuclear DNA contents of 26 Morus spp. determined by flow cytometerof propidium iodide stained nuclei , using CEN as a standard.
*Means of diploid species with the same letter are not significantly different at P≦
0.05.
♂
♂
3.4.2 性狀評估
三倍體桑樹之部份形態，如葉長、葉寬、葉柄長、葉柄寬、葉片厚度及節間 長大於二倍體品種（系），但葉片長度比值、葉長、葉柄長、休眠需冷量並無差 異。將性狀與不同倍體數進行t 檢測，其中葉寬、葉柄寬及節間長等三個性狀，在 不同倍體間有顯著差異（表3.2）。
3.5 討論
3.5.1 種內及種間的 DNA 含量變異
細胞的基因組DNA 含量相當穩定，種內個體間差異不大（Dounce, 1955;
Greilhuber, 1998），常用於估算屬內物種之倍體性。Ohri 和 Kumar（1986）以顯 微密度測量法（Microdensitometry）測得二倍體白桑（Morus alba）之 DNA 含量 為1.7 pg/2C，而本試驗使用之二倍體白桑品種（系），平均DNA 含量為 0.647pg/2C，
與前人研究測得結果不同。顯微密度測量法係以Feulgen 等染劑染細胞核，並與已 知DNA 含量的標準品，以目測的方式進行比較並估算樣本 DNA 含量，而流式細 胞儀技術則使用偵測器，收集已染色的細胞核所發散的螢光訊號，再經一定程序 轉換為電子訊號，因分析方法不同而造成不同的結果。
同品種（系）內DNA 含量相當一致，但種內不同品種（系）間卻略有差異。
桑樹常以高壓、扦插等方式行無性繁殖，品種（系）DNA 含量為均質，而種內不 同品種（系）間的變異，除了是操作手法或儀器所造成的變異，亦可能是受環境 影響，或由染色體的多態性，如異染色質、非整倍體等因數造成的結果（Greilhuber, 1998; Laurie and Bennett, 1985; Rayburn et al., 1985）。
DNA 含量為種的特徵，特別是同倍體數但細胞核型不同的種，可由 DNA 含 量進行區別(Costich et al., 1993; Ozias-Akins et al., 1994)，本試驗僅可明確區分出不 同倍數體的桑樹品種（系），如三倍體之67C001-B 及二倍體之 67C001-A。同倍 體數者，如二倍體桑樹之DNA 含量，除在山桑、魯桑與臺灣桑有統計上的顯著差
(A) 新一の瀨（M. alba）
(B)70C006 (M. laevigata)
圖3.1、相對螢光強度與細胞核數目之頻度分佈度
Fig. 3.1. Frequency distribution histograms plotting the number of nuclei as a function
of their relative fluorescence intensity.註一、雞血細胞（2.500 pg）作為校正標準品，以估算 DNA 含量。樣品：(A)新一 の瀨（二倍體）(B)70C006（三倍體）。核 DNA 含量係自桑樹幼葉分離之 懸浮核溶液，經Propidium iodine 染色後，以流式細胞儀分析。
CEN is the calibration standard. Specimen: (A) diploid Shinichinose and (B) triploid 70C006. Nuclear DNA content analyzed by flow cytometry, using nuclei isolated from mulberry young leaves and stained with propidium iodide.
N um be r of n uc le i N um be r of n uc le i
Relative fluorescence intensity
70C006 2C = 1.053 pg
(342) CEN
(807) 2C = 0.680 pg
2n = 2X = 18
(235) CEN
2C = 2.500 pg (864)
Relative fluorescence intensity
表3.2 二倍體及三倍體桑樹品種（系）之營養性狀表現差異
Table 3.2. Difference between diploid(2X) and triploid(3x) mulberry on vegetative
traits. Ploidy grouping was based on flow cytometry.*Data were obtained for plants grown for one consecutive crop cycle (2008) at Miaoli District Agricultural Research and Extension Station(MDARES), Taiwan.
*The t test was of the difference between means.
*NS, *, ** Nonsignificant of significant difference between means at P 0.05, 0.01, ≦ respectively.
異外，其餘種間差異並不大。因桑樹染色體較小，第一對染色體為2 μm，其餘在 1 μm 以下（大澤, 1916; 儲和孫, 1986），無法透過 DNA 含量得知更多的染色體資 料，如數目及大小，Meng 等人（2002）亦認為以流式細胞儀可估算物種倍數性，
但無法確認具小染色體的物種是否為整倍體、染色體核型是否一致，需要以核型
但無法確認具小染色體的物種是否為整倍體、染色體核型是否一致，需要以核型