第四章 實驗結果
第一節 桑黃乙酸乙酯層對人類主動脈平滑肌細胞毒性及存活
性及存活率之影響
首先利用 MTT assay 測試桑黃乙酸乙酯層（PLEA）對人類主 動脈平滑肌細胞存活率是否有影響。由於 MTT 可被細胞粒線體中的 琥珀酸去氫酶（Succinate dehydrogenase）還原形成藍紫色的 formazan，
經波長 570 nm 測得的吸光值與活細胞數呈正比，因此可用來偵測細 胞的存活率。本實驗對人類主動脈平滑肌細胞 （HASMCs）給予不 同濃度的 PLEA 培養 24 小時進行細胞存活率實驗，結果由 Figure 3 顯示。在 24 小時給予低劑量 PLEA （6.25 μg/mL），細胞存活 率與控制組無顯著差異（94.9 ± 1.2 %，p＞0.05），若給予高劑量 PLEA
（100 μg/ mL），細胞存活率則為 82.9 ± 2.2 %（p＜0.05）。可得知 HASMCs 給予 PLEA 後，細胞的存活率會隨藥物濃度增加而減少，
故 PLEA 對 於 HASMC 的 生長 具 有 抑制 作 用。 藥 物劑 量 在 50 μg/mL 以下，並未對細胞產生明顯毒殺作用（存活率 > 85 %），因 此後續實驗就以 50 μg/mL 以下的濃度（0、 6.25、12.5、25、和 50 μg/mL）進行人類主動脈平滑肌細胞增生與移行的探討。
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第二節 桑黃乙酸乙酯層對 TNF-α 刺激人類主動脈
平滑肌細胞表現 MMP-9 活性之影響
當血管平滑肌細胞移行時，會伴隨著分泌大量的蛋白質水解酶來 分解細胞外基質（Extracellular matrix, ECM），這些蛋白質水解酶其 中又以 MMPs 為代表，故本實驗利用 Gelatin zymography 來觀察不 同濃度（0、 6.25、12.5、25、和 50 μg/mL）的桑黃乙酸乙酯層（PLEA）
對於人類主動脈平滑肌細胞（HASMCs）在 TNF-α 刺激下所表現 MMP-9 活性的影響。由 Figure 4 的實驗結果顯示，HASMCs 在 100 ng/mL 的 TNF-α 誘導下，MMP-9 活性為控制組的 109.5 ± 2.0 %
（p＞0.05）；給予低劑量 PLEA（6.25 μg/mL）不會顯著影響 MMP-9 之分泌（為控制組的 101.0 ± 4.8 %，p＞0.05），而給予高劑量 PLEA (50 μg/ mL) 則有 82.9 ± 2.2 %（p＜0.001）的抑制效果。由以上結果 發現隨著 PLEA 的濃度增加，對於 HASMCs 在 TNF-α 誘導下具有 抑制效果，呈現劑量依存性的關係。至於在 MMP-2 方面，我們發 現酵素活性很弱，不易定量，並且與對照組相比較，皆無顯著差異。
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（Chemo-attractant），並將 HASMCs 與不同濃度的 PLEA （0、1.56、
3.13、6.25、和 12.5 μg/mL）放置於 transwell 上層，而兩層之間則
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μg/mL劑量下，具有顯著差異 。由以上結果 發現，PLEA 可抑制 HASMCs 在 TNF-α 誘導下細胞移行的能力，並呈現劑量依存性的 關係。
44 作為化學趨化物（chemo-attractant），並將 HASMC 與不同濃度的 PLEA（0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、和 50 μg/mL）放置於 transwell 上層，而與遷移實驗不同的地方為兩層之間除了具有 8 μm 孔洞的濾
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控制組的 92.9 ± 4.4 %（p＜0.01），而當濃度增加至 50 μg/mL 時，
侵襲細胞的比例下降為 61.3 ± 1.3 % （p＜0.001）。由以上結果可知，
PLEA 對於 HASMCs 在 TNF-α 誘導下侵襲的能力具有劑量相關性 的抑制效果。
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MMP-2 比例便降低至 79.5 ± 8.4 %（p＜0.01），而 TIMP-2 增為 104.2 ± 3.1 %（p＜0.05）。由以上結果可知，HASMCs 在 TNF-α 誘 導下，隨著 PLEA 的濃度增加，TIMP-2 的蛋白表現也有增加的趨 勢；同時也發現 PLEA 的濃度增加，亦可抑制 MMP-2 的蛋白表現 量，具有劑量依存性的關係。
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12.5、25、和 50 μg/mL）的桑黃乙酸乙酯層（PLEA）及 100 ng/mL 的 TNF-α 刺 激 HASMCs 24 小 時 後 ， 以 西 方 點 墨 分 析 法 觀 察
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HASMCs 在 TNF-α 誘導下，隨著 PLEA 的濃度增加，TIMP-1 的 蛋白表現量也有增加的趨勢；同時也發現 PLEA 的濃度增加，亦可 抑制 MMP-9 的蛋白表現量，具有劑量依存性的關係。
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第七節 桑黃乙酸乙酯層對 TNF-α 刺激人類主動脈
平滑肌細胞分泌 FAK 蛋白質表現量之影響
FAK 為 MAPK pathway 的上游，本實驗主要探討桑黃乙酸乙酯 層 對 TNF-α 刺 激 人 類 主 動 脈 平 滑 肌 細 胞 （ HASMCs ） 表 現 phospho-FAK（分子量 125 kDa） 蛋白質表現量的情形。以不同濃度
（0、 6.25、12.5、25、和 50 μg/mL）的桑黃乙酸乙酯層（PLEA）
及 100 ng/mL的 TNF-α 刺激 HASMCs 24 小時後，利用西方墨點法 來偵測 phospho-FAK 蛋白質表現量的變化。
由 Figure 9 的實驗結果顯示，HASMCs 在 TNF-α 誘導下，
phospho-FAK 的表現增為控制組的 108.3 ± 1.2 %（p＞0.05）；而 PLEA 的濃度為 6.25 μg/mL 時，phospho-FAK 的表現無顯著影響
（為控制組的 100.8 ± 3.0 %，p＞0.05）；當濃度增加至 50 μg/mL 時，
phospho-FAK 比例降低至 66.0 ± 0.7 % （p＜0.001）。由結果可知，
HASMCs 在 TNF-α 誘導下，對於原態的 FAK 無顯著影響，但對於 phospho-FAK 則是隨著 PLEA 的濃度增加，有顯著抑制的效果，具 有劑量依存性的關係。
51 TNF-α 誘導下 phospho-ERK、phospho-JNK 及 phospho-p38 的表現 分別增為控制組的 109.6 ± 3.6 % （p＜0.01）、112.4 ± 1.4 % （p＜
0.05） 及 115.1 ± 7.3 % （p＜0.05）；在 PLEA 的濃度為 6.25 μg/mL 時，phospho-ERK、phospho-JNK 及 phospho-p38 的表現皆無顯著影 響（分別為控制組的 106.9 ± 0.3 % ，p＞0.05、105.0 ± 1.7 %，p＞0.05 及 103.0 ± 0.6 %，p＞0.05），而當濃度增加至 50 μg/mL 時，比例 便分別降低為 99.2 ± 0.4 % （p＜0.01）、 90.5 ± 0.4 % （p＜0.01）
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及 85.75 ± 0.45% （p＜0.01）。由結果可知 HASMCs 在 TNF-α 誘 導 下 ， 對 於 原 態 的 ERK 、 JNK 及 p38 無 顯 著 影 響 ， 但 對 phospho-ERK、phospho-JNK 及 phospho-p38 則有顯著抑制的效果，
具有劑量依存性的關係。
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第九節 桑黃乙酸乙酯層對 TNF-α 刺激人類主動脈
平滑肌細胞分泌 IκB 蛋白質表現量之影響
IκB 為 MAPK pathway 的上游，本實驗主要探討桑黃乙酸乙酯 層 對 TNF-α 刺 激 人 類 主 動 脈 平 滑 肌 細 胞 （ HASMCs ） 表 現 phospho-IκB 蛋白質表現量的情形。以不同濃度（0、 6.25、12.5、
25、和 50 μg/mL） 的桑黃乙酸乙酯層（PLEA）及 100 ng/mL 的 TNF-α 刺激 HASMCs 24 小時後，利用西方墨點法來偵測蛋白質表 現量的變化。
由 Figure 13 的實驗結果顯示，HASMCs 在 TNF-α 誘導下，
phospho-IκB 的表現增為控制組的 123.8 ± 3.6 %（p＜0.001）；而 PLEA 的濃度為 6.25 μg/mL 時，phospho-IκB 的表現為控制組的 117.0 ± 3.3 %（p＜0.01）；當濃度增加至 50 μg/mL 時，phospho-IκB 比例便降低至 89.4 ± 1.6 %（p＜0.001）。由結果可知，HASMCs 在 TNF-α 誘導下，對於原態的 IκB 無顯著影響，但對於 phospho- IκB 則是隨著 PLEA 的濃度增加，有顯著抑制的效果，具有劑量依存性 的關係。
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第十節 Inotilone 對人類主動脈平滑肌細胞存活率
之影響
首先利用 MTT assay 測試 Inotilone 對人類人類主動脈平滑肌 細胞存活率是否有影響。由於 MTT 可被細胞粒線體中的琥珀酸去氫 酶（Succinate dehydrogenase）還原形成藍紫色的 formazan，經波長 570 nm 測得的吸光值與活細胞數呈正比，因此可用來偵測細胞的存 活率。本實驗對人類主動脈平滑肌細胞（HASMC）給予不同濃度（0、
6.25、12.5、25、50、和 100 μM）的 Inotilone 培養 24 小時進行細 胞存活率實驗，結果由 Figure 14 顯示。在 24 小時給予低劑量 Inotilone （6.25 μM），細胞存活率為控制組的 93.8 ± 3.0 % （p＜
0.05），若給予高劑量 Inotilone (100 μM)，細胞存活率則下降至 81.9
± 2.7 %（p＜0.001）。可清楚得知 HASMCs 給予 Inotilone 後，細 胞的存活率會隨藥物濃度增加而減少，故 Inotilone 對於 HASMCs 的生長具有抑制作用。藥物劑量在 50 μM 以下，並未對細胞產生明 顯毒殺作用（存活率 > 85 %），因此後續實驗以 50 μM 以下的濃度
（0、 6.25、12.5、25、和 50 μM）進行人類主動脈平滑肌細胞增生 與移行的探討。
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第十一節 Inotilone 對 TNF-α 刺激人類主動脈平
滑肌細胞表現 MMP-9 活性之影響
當血管平滑肌細胞移行時，會伴隨著分泌大量的蛋白質水解酶來 分解細胞外基質（extracellular matrix, ECM），這些蛋白質水解酶其中 又以 MMPs 為代表，故本實驗利用 Gelatin zymography 來觀察不同 濃度的 Inotilone 對於人類主動脈平滑肌細胞（HASMCs）在 TNF-α 刺激下所表現 MMP-9 活性的影響。
由 Figure 15 實驗結果顯示， HASMC 在100 ng/mL 的 TNF-α 誘導下，MMP-9 活性量增為控制組的 121.5 ± 5.7 %（p＜0.05）；給 予低劑量 Inotilone（6.25 μM）對於抑制 MMP-9 分泌無顯著影響（為 控制組的 117.9 ± 4.8 %，p＞0.05），而給予高劑量 Inotilone (50 μM) 則有 62.1 ± 1.5 % （p＜0.001）的抑制效果。由以上結果發現，
HASMCs 在 TNF-α 誘導下，隨著 Inotilone 的濃度增加，具有抑制 效果，呈現劑量依存性的關係。至於在 MMP-2 方面，我們發現酵 素活性很弱，不易定量，並且與對照組相比較，無顯著差異。
56 培養液放置於 transwell 下層作為化學趨化物（chemo-attractant），並 將 HASMCs 與不同濃度的 Inotilone （0、 6.25、12.5、25、和 50 μM）
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Inotilone 可抑制 HASMCs 在 TNF-α 誘導下細胞移行的能力，並呈 現劑量依存性的關係。
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（chemo-attractant），並將 HASMCs 與不同濃度的 Inotilone （0、
6.25、12.5、25、和 50 μM）放置於 transwell 上層，而與遷移實驗
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比例降低為控制組的 98.5 ± 2.1 % （p＜0.01），而當濃度增加至 50 μM 時，侵襲細胞的比例便降低至 77.0 ± 0.9 % （p＜0.001）。由以 上結果可知，Inotilone 對於人類主動脈平滑肌細胞在 TNF-α 誘導下，
細胞侵襲能力具有劑量相關性的抑制效果。
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第十六節 Inotilone 對 TNF-α 刺激人類主動脈平
滑肌細胞分泌 FAK 蛋白質表現量之影響
FAK 為 MAPK pathway 的上游，本實驗主要探討 Inotilone 對 TNF-α 刺激人類主動脈平滑肌細胞（HASMCs）表現 phospho-FAK 蛋白質表現量的情形。以不同濃度（0、 6.25、12.5、25、和 50 μM）
的 Inotilone 及 100 ng/mL 的 TNF-α 刺激 HASMCs 24 小時後，利 用西方墨點法來偵測蛋白質表現量的變化。
由 Figure 20 的實驗結果顯示，HASMCs 在 TNF-α 誘導下，
phospho-FAK 的表現增為控制組的 120.7 ± 1.0 %（p＜0.001）；而 Inotilone 的濃度為 6.25 μM 時，phospho-FAK 的表現下降為控制組 的 96.0 ± 0.8 % （p＜0.001）；當濃度增加至 50 μM 時，phospho-FAK 比例便降低至 90.0 ± 3.5 %（p＜0.001）。由結果可知，HASMCs 在 TNF-α 誘導下，對於原態的 FAK 無顯著影響，但對於 phospho-FAK 則是隨著 Inotilone 的濃度增加，有顯著抑制的效果，具有劑量依存 性的關係。
63 phospho-ERK、phospho-JNK 及 phospho-p38 的表現分別增加為控制 組的 140.3 ± 6.0 % （p＜0.001）、111.6 ± 5.2 % （p＜0.001） 及 110.18 phospho-ERK、phospho-JNK 及 phospho-p38 則有顯著抑制的效果，
具有劑量依存性的關係。
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第十八節 Inotilone 對 TNF-α 刺激人類主動脈平
滑肌細胞分泌 IκB 蛋白質表現量之影響
IκB 為 MAPK Pathway 的上游，本實驗主要探討 Inotilone 對
TNF-α 刺激人類主動脈平滑肌細胞（HASMCs）表現 phospho-IκB 蛋 白質表現量的情形。以不同濃度（0、 6.25、12.5、25、和 50 μM）
的 Inotilone 及 100 ng/mL 的 TNF-α 刺激 HASMCs 24 小時後，利 用西方墨點法來偵測蛋白質表現量的變化。
由 Figure 26 的實驗結果顯示，HASMCs 在 TNF-α 誘導下，
phospho-IκB 的表現增為控制組的 107.4 ± 1.5 % （p＞0.05）；而 Inotilone 的濃度為 6.25 μM 時，phospho-IκB 的表現無顯著影響（為 控制組的 99.3 ± 1.6 %，p＞0.05）；當濃度增加至 50 μM 時，
phospho-IκB 比例便降低至 76.5 ± 8.1 % （p＜0.001）。由結果可知，
HASMCs 在 TNF-α 誘導下，對於原態的 IκB 無顯著影響，但對於 phospho- IκB 則是隨著 Inotilone 的濃度增加，有顯著抑制的效果，
具有劑量依存性的關係。
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