西方點墨法（Western blotting）

1. 樣品的配置

將 HASMCs 種於 10 cm² Dish，在 37 ℃，5 % CO2 培養箱培養 24 小時。待細胞貼附後，給予不同濃度的桑黃乙酸乙酯層、 inotilone 與 100 ng/ml TNF-α 培養 24 小時。待培養時間一到，取出 dish，

依照不同濃度組別，經 Trypsin-EDTA 處理的細胞懸浮液移到 15 mL 離心管，以 1,500 rpm，離心 5 分鐘。倒掉上清液，將細胞打散 後再加入 2 mL 的 PBS 離心（1,250 rpm，5 分鐘）。倒掉上清液，

將細胞 Pellet 打散後，加入 150 μL 的 RIPA buffer 和 15 μL 的 proteinase inhibitor，置於冰上作用 30 分鐘，以超高速離心機（4 ℃，

15000 rpm，15 分鐘）離心，離心後取出上清液收集，此上清液即為 細胞蛋白質。

2. 蛋白質標準品配製

根據 Bradford 建立之方法測量蛋白質溶液的濃度，在波長 595 nm 測得的吸光值，換算樣品蛋白質濃度，以一系列已知濃度的 BSA

（bovine serum albumin）做成之 standard curve 換算蛋白質濃度。

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的趨勢線方程式，即可求得實際各濃度樣品的蛋白質濃度。求出濃度 後，依照所需的體積，將樣品與 5X protein loading dye 混合，以 95

℃ 水浴加熱變性 5 分鐘，置於冰上冷卻 10 分鐘後離心，即為蛋白 質萃取樣品。

4.

(1) 原理：

SDS 為一種介面活性劑且本身帶有負電荷，其可與蛋白質結 合使得蛋白質變性並且由負極朝向正極來移動；分子量較大的蛋 白質因移動較慢的關係，相對較靠近負極的位置，而分子量較小 的蛋白質則移動較快，因此較為靠近正極的位置，利用蛋白分子 量的不同移動速率不同而將蛋白質分離。

(2) 10 % SDS-PAGE 製備

首先把 glass plate sandwiches 裝置好，配置 1.5 mm 厚度的 10 % SDS-PAGE，膠分上下兩層，依照下面表格（Table 3）依序 配製 10 % 下層膠 （separation gel）和 4 % 上層膠（stacking gel）：

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(3) Running buffer（10 X）製備

30 g Tris-base、144 g glycine、4 g SDS 加 ddH2O 至 1 L。使用時，

取 100 mL 10 X Running buffer，加入 900 mL ddH₂O 即可。

(4) Transfer buffer（10 X）製備

30 g Tris-base、144 g glycine 加水至 1 L 使用時，取 100 mL 10 X Transfer buffer ， 加 入 200 mL methanol ， 再 加 入 700 mL 的 ddH2O。

(5) PBST

1000 mL PBS 加入 1 mL Tween-20。

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依上述 10 % SDS-PAGE 配方造膠，將造好的膠放入含 running buffer 的電泳設備裡，將標示分子量的 marker 和各個濃度的 sample 注入膠體孔槽，先以 65 V 進行電泳，待 loading dye 通過 stacking gel，

將電壓調成 100 V 繼續進行電泳。

5. 蛋白質轉印：

將轉漬夾黑色面向下放，依序將海綿墊、濾紙、膠片、PVDF 膜

（polyvinylidene fluoride）、濾紙、海棉墊放入轉漬夾，避免氣泡產生，

轉漬夾裝置完成後，放入裝有 transfer buffer 之轉漬裝置中，轉漬裝 置外以冰枕保持系統維持低溫狀態，以 100 V，300 mA 轉漬 1 小時。

轉漬結束後取出 PVDF 膜浸泡於 5 % 脫脂牛奶中進行 blocking，

於室溫震盪 1 小時，以阻斷非特異性結合。之後，以 PBST 緩衝液 清洗 PVDF 膜 3 次，每次 5 分鐘。

6. 一級抗體（primary antibody）與二級抗體（secondary antibody）

加入稀釋之一級抗體置於 4 ℃ 隔夜反應後，再以 PBST 清洗 PVDF 膜 3 次，每次 5 分鐘。接著加入稀釋過的二級抗體反應 2 小 時，以 PBST 緩衝液清洗 3 次，每次 5 分鐘。隨後加入 enhanced chemiluminescence（ECL）進行呈色反應，以 LAS4000 進行拍照。

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