第一章 緒論
1.2 植物之形態發生
生物體於發育及再生過程中，其細胞及組織經由分化，使得其器官或形 態結構發生改變。然而植物之形態發生除可由有性之繁殖觀察到外，亦可 從無性繁殖之方法窺其演變。一般而言，培植體（explants）在植物生長調 節劑誘導下，即可直間或間接誘導癒傷組織或體胚形成，再改變生長調節 劑種類，繼續誘導類原球體（protocorm-like body；PLB）或植株之形成。
然而體胚在早期生長時，即以雙極性之特性，於相反方向生長，而分化形 成莖端與根端（Haccius, 1978）。體胚與合子胚之型態發生是極為相似
（Zimmerman. 1993），其胚之演化，先從分化成二分體開始，再繼續分裂 成四分體、八分體，在進入球型胚。之後再轉變成心形胚（heart embryo），
魚雷胚（torpedo embryo），最後再發育為成熟之合子胚（Dodeman et al., 1997）。而體胚與合子胚其最大之不同僅在於—合子胚乃經受精而成，但體 胚則無經受精之過程。由於體胚形成，乃將體細胞經由逆分化過程後，再 誘導再分化。其發育途徑又可分為直接誘導及間接誘導，但少數植物可進 行中間型體胚發生（intermediate somatic embryogenesis）或重複型
體胚發生（repetitive somatic embryogenesis）之途徑。
1.3 蘭花繁殖技術之演化及試管內形態發生
早期蘭花以分株繁殖為主，其母株會於基部或是花梗形成側芽或小苗，
再進行切離，與母株分開，以達繁殖之目的。但因分株之數量有限，故無 法大量繁殖，以致造成特有品種具有天價之情形，更無法廣泛應用於花卉 市場。爾後，無菌發芽成為蘭花繁殖之方法，其乃將蘭花種子播種於含營 養成分之培養基，於無菌環境內進行生長及繁殖。但因種子本身還是有性 繁殖而得來，原有之優良性狀仍無法保留，故演化成以組織培養之無性微 體繁殖來取代之。其乃拜現代科技所賜，利用無菌培養，於培養基內添加 植物生長調節劑，取蘭花之器官組織（如：根、莖、葉），以誘導其形成癒 傷組織，或直接誘導體胚之形成，以進一步再誘導植株之形成。而這樣的 繁殖方式，儼然已成為現今植物學繁殖之主要方法。
蘭花組織培養之歷史可追溯於 60 年代，法國人莫瑞爾以莖頂進行組織培 養，而誘導類原球體形成，進而獲得再生植株（Morel, 1960），而這也開啟 蘭花組織培養之新方向。在組織培養的應用下，多種蘭科植物如：素心蘭
（Cymbidium）、蝴蝶 蘭（Phalaenoposis）、石斛蘭（Dendrobium）、香蘭（Vanilla planifolia）及巴菲爾鞋蘭（Paphiopedilum）等得以被大量地進行微體繁殖 的研究，且如雨後春筍般刊登在專業期刊（Arditt and Ernst,1993；Chen et
al.,2002）。另外，素心蘭可經由根莖進行微體繁殖（Hasegawa and Goi, 1987；Shimasaki and Uemoto, 1991；Chang and Chang, 1998）。經由癒傷組 織形成體胚或類原球體後，再進行繁殖的有：蝴蝶蘭（Ishii et al., 1998）、
石斛蘭（Jonojit et al., 2007）、素心蘭（Chang and Chang, 1998 )、文心蘭
（Oncidium）（Chen and Chang, 2000）及巴菲特蘭（Hong et al., 2008）。經 由類原球體產生而進行繁殖的有：瓢唇蘭（Catasetum）（Kraus and Moterio, 1989）、朵麗蝶蘭（Doritaenopsis）（Tokuhara and Mii, 1993）、萬代蘭（Venda）
（Tanaka et al., 1975）、蝴蝶蘭（Rosmah et.al., 2006）及紫蘭（Spathoglottis plicata）（Teng et al., 1997）。亦可利用葉子作為培植體（explants），直接誘 導體胚形成的有：文心蘭（Chen et al, 1999）、石斛蘭（Chung et al., 2007）
及蝴蝶蘭（Kuo et al.,2005；Chen and Chang, 2006；Gow et al., 2008）。然而，
蝴 蝶 蘭 亦 可 利 用 原 生 質 體 ， 來 做 為 達 到 無 性 微 體 繁 殖 之 目 的
（Tokuhara and Mii, 2001；Shrestha et al., 2007）。
1.4 蘭科植物形態發生之影響因子
在蘭花形態發生之過程中，植物生長調節劑扮演著極為重要之角色。常 用的生長調節劑可分為抑制體胚形成，但可促進生長的植物生長素（auxin）
及可促進體胚形成，或能誘導開花的細胞分裂素 （cytokinin）兩種。當然 其他種類，如：吉貝素（gibberellin） 或其他物質，如：椰子水、香蕉泥、
馬鈴薯泥，甚至一些化學物質，如：AgNO
3
、CoCl2
、水楊酸….等等，皆 會影響蘭花的形態發生。例如，在文心蘭的研究中，培養基添加 ancymidol、paclobutrazol 及 ACC，皆會促使體胚之形成 （Chen and Chang, 2003 ；Chen and Chang, 2003）。除此之外，培養基之成分及比例（如：無機鹽、碳源及 氮源）、培植體之部位與擺放方向，及光照時間長短，皆會影響其形態發生 之結果。例如：添加蔗糖 10 g/l，即能誘導形態發生之要求；文心蘭葉片尖 端，軸面朝上擺放及黑暗培養者，體胚形成率皆較高（Chen and Chang, 2002）。
1.5 植物開花機制之探討
在高等植物中，被子植物之合子胚發育後，會進行植物營養生長期
（vegetative phase），再生長多年後，植株成熟，即會進入所謂的開花期
（flowering phase）（Goldberg et al. 1994）。在該時期即可進行有性生殖，以 繁衍下一代。而近年來，縮短植物幼年期，一直被植物生物學及作物育種 當做重要之課題（Chia et al. 1999; Chang and Hsing 1980; Jung and Müller 2009）。而試管內提前開花之突變與方法，已被研究多年，但其機轉仍然不 明，特別是在非模式植物的研究。
在開花的研究中，早在 1930 年，Mikhail Chailakhyan 就已提出開花素
（frorigen）之存在（Taiz & Zeiger, 2006, p. 660），這些年來，植物學家深
深相信其能誘導開花。但經過多年的研究，仍無法明確地找到開花的刺激 物質。而近年研究中指出，開花素可能是一些植物賀爾蒙，如：吉貝素、
細胞分裂素、乙烯、RNA（mRNA 或 miRNA）、蛋白質…等。
然 而 ， 誘 導 開 花 之 原 理 被 分 類 成 四 途 徑 。 第 一 類 、 光 周 期 性 途 徑
（autonomous and vernalization pathway）：其涉及葉子數目（如：煙草葉數 目需長至22片才會開花），低溫處理（如：許多植物需經冬天低溫處理，
才能抽花芽而開花）。該二者作用皆會降低FLC基因 (具SOC1基因抑制作 用)的表現，使得植物進入開花期。第三類、碳水化合物（蔗糖）途徑
（carbohydrate, or sucrose pathway）：其可增加LFY基因之表現，竟而誘導 開花，但切確機轉仍不明。第四類、荷爾蒙路徑（hormones pathway）：其
最被研究透徹的是吉貝素，但皆僅於生物模式植物（阿拉伯芥）的研究。
其藉由GAMYB基因之參與（Woodger et, al, 2003），而促進LFY基因之表 現。另外，近年研究指出，吉貝素非敏感RNA（GA insensitive RNA；GAI RNA）扮演著長距離運移，而傳送至頂生組織，刺激FT 蛋白之生成，竟 而引發一連串基因的表現，而使得花朵形成（Huang et. al., 2009）。
1.6 蘭花產業及市場之現況
當台灣農業發展及產值日趨式微之時，唯見蘭花科技產業於逆境中不斷 成長，無論是產量或品質皆為逐年增加。因此，蘭花成為台灣最重要的經 濟花卉之一，每年有近二百億的產值，故蘭花生物科技又被認為新十大建 設之重要產業。近年來，由於更多開發中國家經濟及生活水平大幅提升，
對於生活藝術及品質要求更高，連帶使得全球花卉市場蓬勃發展。目前台 灣生產之花卉不僅可滿足國內市場，且在國際市場的需求增加之下，使得 台灣的外銷花卉市場更具有發展空間。2010 年 2 月出刊的專業花卉雜誌
「Flora Culture International」報導，由於國際 金融海嘯的衝擊，在荷蘭花卉 拍賣市場統計中，2009 年全球花卉產值下滑 5%，而台灣去年外銷花卉總 金額 1 億 1,070 萬美元，蘭花占 78%，於逆境中成長。在此更顯示，台灣 優良的蘭花生物科技廣受國際市場的接受與肯定。
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CO gene FT mRNA FT protein
FT /FD
FT protein
本圖修改自Taiz, L. and Zeiger, E. (2006) Plant Physiology. 4
th
ed圖1.1、開花分子訊息傳導之示意圖
第二章、霍山石斛之試管內形態發生
斛鹼（Dendrobine），石斛能鹼（Nobiline），石斛因鹼（Dendrine），石斛次 鹼 （ Nobilonine ）， 6- 羥 基 石 斛 新 鹼 （ 6-Oxydendroxine ）， 氮 氧 石 斛 鹼 kinetin來誘導類原球體形成（Fu et al., 2004）；近年也有以甘露醇加入 kinetin，於前冷處理(cold pretreatment)後，大量誘導類原球體形成之報導（Luo et al., 2009）。另外，也有以莖節作為培植體，添加NAA及kinetin來
誘導PLB之形成（Wang et al., 2004）。但在繁殖的過程中，為更有效得到 優良的類原球體，因此更多研究發表指出，可在培養基內加入水楊酸，於 懸浮培養下，可獲得比控制組多1.63倍之類原球體（Wang et al., 2009）；
另外，也有研究指出，碳源及氮源之比例亦會影響類原球體之形成（Zha et
霍山石斛（Dendrobium huoshanense）的實生苗（購自百谷草藥用植物園，
台灣南投）。
2.2.2 基礎培養基
試驗選用改良式 1/2 MS（Murashige and Skoog, 1962）鹽類（含維他命），
添加 20 g/l 蔗糖，1 g/l 蛋白腖，4 g/l 水晶洋菜作為基礎培養。在加入水晶 洋菜前，培養基先調整 pH 至 5.2 ± 0.01。
本試驗選用之生長調節劑包括：植物生長素2,4-D、NAA、IBA 及細胞
2.2.7 霍山石斛發根之試驗
試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平 均值的差異分析。 mg/l TDZ（*1）及1 mg/l 2,4-D＋1 mg/l TDZ（*2）之處理組，根尖於誘導 初期呈現膨脹隆起之現象（圖2-1-a），而該現象隨著時間增加，膨脹情形
數字為試管數
另外，莖節培植體於暗環境誘導方面，發現無添加生長調節劑（*2），
0.1 mg/l TDZ （*2）、0.5 mg/l TDZ（*1）、0.5 mg/l TDZ（*3）、1 mg/l TDZ
（*3）、1 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）、1 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）、 1 mg/l 2,4-D＋0.5 mg/l TDZ（*1）)、1 mg/l 2,4-D＋0.5 mg/l TDZ（*1）、1 mg/l 2,4-D＋1 mg/l TDZ （*1）及2 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）等八個處理 有長出芽體（圖2-2-a）。另外，1 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）及2 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）等二個處理，有長出類似癒傷組織之物質（圖
較低，故有部分類原球體繼續發育（圖2-4-a）。不過，試驗後期，也僅見
el al.
, 2011）、葉子（Chung et al., 2005, 2007）、芽端（Jonojit et al., 2007）誘導類原球體或癒傷組織之成功案例。但本實驗材料霍山石斛之繁殖試 驗，又以另一種方式呈現，且其表現之結果，似乎又大為不同。
在葉培植體方面，無任何處理組能被有效地誘導類原球體或癒傷組織的 形成，這可推論其葉子的逆分化能力不佳，以至於其對植物生長調節劑無
任何反應。然而在根尖培植體方面，發現於含有1 mg/l 2,4-D的處理下，有 三處理組能產生癒傷組織，其餘處理組之根尖皆生長不佳、褐化，導致癒 傷組織無法有效被誘導。上述的結果，在其他石斛蘭（Khosravi et al.,2008）
與蘭花（Chen and Chang, 2000）也被觀察到。這些癒傷組織在經繼代後，
發現僅有一組（無加入TDZ者），其繼代之癒傷組織增殖率明顯高過其他 算是一種繁殖的好方法（Shiau et al., 2005）。另外，該實驗長出之類似癒 傷組織之物質，經以相同培養基繼代後，觀察到其生長情形不佳，且最後
理七日後，全數白化。而 5 mg/l 及 10 mg/l 處理者，因其濃度較低，故有類 原球體尚呈現具活性的綠色。但經繼代培養後，最後也僅見 10 mg/l 處理組 有一根試管長成幼苗。至於大類原球體組，雖然以秋水仙素處理之時間較 長，但因類原球體較大，所承受的毒性耐受相對較佳，類原球體存活率普
理七日後，全數白化。而 5 mg/l 及 10 mg/l 處理者，因其濃度較低，故有類 原球體尚呈現具活性的綠色。但經繼代培養後，最後也僅見 10 mg/l 處理組 有一根試管長成幼苗。至於大類原球體組，雖然以秋水仙素處理之時間較 長，但因類原球體較大，所承受的毒性耐受相對較佳，類原球體存活率普