鰻魚生長和卵巢發育過程中其肝臟和肌肉組織中PPARs、PTEN、RXR與脂肪代謝基因表現之研究

全文

(1)國立高雄大學生物科技研究所碩士論文. 霍山石斛試管內形態發生及提前開花之誘導 Induction of in vitro morphogenesis and early flowering of Dendrobium huoshanense. 研究生：李伯倫撰指導教授：陳彥澄博士. 中華民國一百年七月.

(2) 致謝. 重返校園，拾起書本，對一個歷經社會職場近 20 年，且不惑之年的青年而言，除了努力之外，更需要勇氣。看著同學一個比一個年輕，口口稱呼我李叔叔，就覺得自己除了要自我勉勵外，更需要關心年紀輕的同學。本身從藥學跨入植物學的領域，多虧陳老師傾囊相授相關知識外，其豐富的學識與經驗，引領著我走向新視野，並完成碩士的研究，進而鼓勵我繼續努力向上，考取台灣大學生物科技所博士班。在這求學的過程，同學傳給了我年輕的氣息，也給了我反璞歸真的心境。在這過程當中，除了學校豐富的知識資源灌溉了我外，父母的支持與體諒，更是我前進的一大動力。除此之外，完成這本論文也要感謝台大李金龍教授與本校王恆隆老師給與的精闢建議與指教，故得以順利完稿。回想過去的人生，雖然豐富而多采，但也少了生命原有的自然色，唯有暫時放下厚重殼，換上新裝，再次爬上葡萄樹，才能再次嘗到生命的甜美。最後，僅提一首詩來共勉之，期望人生得以平靜且更加豐碩。. 人生何須上青天，一攬秀水入懷間；輕身引曲遊曉霧，但見牧人臥牛眠。牧荷卯辛年于高大晚春. 李伯倫於高雄大學生物科技研究所 2011/8/8 i.

(3) 縮寫表. 2,4-D. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. 2iP. N6-(2-isopentenyl) -adenine. BA. 6-benzylaminopurine / 6-benzyladenine. IBA. indole-3-butyric acid. NAA. 1-naphthaleneacetic acid. MS. Murashige and Skoog medium. PGRs. plant growth regulators. TDZ. thidiazuron. ii.

(4) 目錄頁次致謝……………………………………………………………………………..i 縮寫表…………………………………………………………………………ii 目錄…………………………………………………………………………iii 表目錄..………………………………………………………………………..vi 圖目錄……………………………………………………………………….vii. 中文摘要…………………………………………………………………….. 1 英文摘要…………………………………………………………………….. 3. 第一章緒論...................................................................................................5 1.1 蘭花之分布及植物學特性…………………………………………..5 1.2 植物之形態發生……………………………………………………..6 1.3 蘭花繁殖技術之進展及試管內形態發生…………………………….7 1.4 蘭科植物形態發生之影響因子……………………………………….8 1.5 植物開花機制之探討 …………………………………………………9 1.6 蘭花產業及市場現況 ………………………………………...………11 第二章霍山石斛之試管內形態發生………………………………………..13 iii.

(5) 2.1 前人研究及試驗目的 ………………………………………………...13 2.2 材料與方法………………………………………………………...…..14 2.2.1 試驗材料……………………………………………………………..14 2.2.2 基礎培養基…………………………………………………………..14 2.2.3 植物生長調節劑 ……………………………………………………14 2.2.4 霍山石斛癒傷組織之誘導…………………………………………..15 2.2.5 霍山石斛癒傷組織之試管內形態發生……………………………..15 2.2.6 霍山石斛多倍體之誘導……………………………………………..15 2.2.7 霍山石斛發根之試驗………………………………………………..16 2.2.8 統計方法……………………………………………………………..16 2.3 結果…………………………………………………………………….16 2.3.1 霍山石斛癒傷組織之誘導…………………………………………..16 2.3.2 霍山石斛癒傷組織之試管內形態發生……………………………..17 2.3.3 霍山石斛多倍體之誘導……..…………………………………17 2.3.4 霍山石斛發根之試驗………………………………………………..18 2.4 討論…………………………………………………………………….18. 第三章霍山石斛試管內提前開花之研究…………………………………..30 3.1 前人研究及試驗目的………………………………………………….30. iv.

(6) 3.2 材料與方法…………………………………………………………….31 3.2.1 試驗材料……………………………………………………………..31 3.2.2 基礎培養基…………………………………………………………..32 3.2.3 植物生長調節劑……………………………………………………..32 3.2.4 霍山石斛試管內誘導提前開花之處理 ……………………………32 3.2.5 開花階段之辨識 ……………………………………………………32 3.2.6 統計方法……………………………………………………………33 3.3 結果…………………………………………………………………...33 3.3.1 無添加 NAA 誘導提前開花之反應………………………………..33 3.3.2 添加 NAA 誘導提前開花之反應…………………………………..33 3.4 討論……………………………………………………………………34. 第四章參考文獻…………………………………………………………….42. v.

(7) 表目錄. 頁次. 表2-1. TDZ及2,4-D對霍山石斛根尖培植體癒傷組織形成之影響 ……..21. 表2-2. TDZ及2,4-D對霍山石斛莖節培植體誘導之影響…………………22. 表2-3. 植物生長調節劑對霍山石斛癒傷組織誘導體胚形成之影響 ……23. 表2-4. NAA及IBA對霍山石斛發根及植株生長之影響…………………..24. 表3-1. 在無添加NAA下，TDZ、BA、2iP及kinetin對霍山石斛試管內開花之影響…………………………………………………………37. 表 3-2. 在添加 0.5 mg/l NAA 下，TDZ、BA、2iP 及 kinetin 對霍山石斛試管內開花之影響…………………………………………………38. vi.

(8) 圖目錄. 頁次. 圖 1-1. 開花分子訊息傳導之意示圖……………………………………….12. 圖 2-1. 霍山石斛根尖誘導癒傷組織之情形及繼代生長狀況……………25. 圖 2-2. 霍山石斛莖節形態發生之觀察及組織繼代之生長狀況…………26. 圖 2-3. 霍山石斛癒傷組織試管內形態發生及器官發生之誘導情形……27. 圖 2-4. 霍山石斛多倍體之誘導之過程……………………………………28. 圖 2-5. 霍山石斛發根試驗之過程及其生長情形…………………………..29. 圖 3-1. 霍山石斛開花階段之辨識 …………………………………………39. 圖 3-2. 試管內提前開花試驗之花朵形態發生……………………………40. 圖 3-3. 試管內提前開花之花朵外型變異………………………………….41. vii.

(9) 霍山石斛試管內形態發生及提前開花之誘導指導教授：陳彥澄博士國立高雄大學生物科技研究所學生：李伯倫國立高雄大學生物科技研究所摘要本論文之研究分二個部份，第一部分為霍山石斛之試管內形態發生，其材料為試管內之實生苗，切取根尖、莖節及葉等作為培植體，於含有不同比例植物生長調節劑之培養基，進行癒傷組織之誘導，以做為更進一步之試驗之材料。試驗所用之基礎培養基為 1/2 MS 添加 20 g/l 蔗糖、1 g/l 蛋白腖及 4 g/l 水晶洋菜。試驗之設計，乃另外添加不同濃度比例之植物生長素 2,4-D 及細胞分裂素 TDZ，以進行形態發生之誘導。經誘導結果，僅根尖於 2,4-D 1 mg/l 下，可以成功誘導產生癒傷組織。而所獲得之癒傷組織以同樣之培養基繼代後，發現在無任何 TDZ 存在下，癒傷組織呈現鮮黃色，並得以繼續生長。而這些癒傷組織經由改放置於含 NAA 另外添加 TDZ 或 BA 培養基後，陸續被誘導而形成類原球體。另外，在霍山石斛發根之實驗中，以 0.1 mg/l NAA、1 mg/IBA 及 5 mg/l IBA 等處理組之誘導發根反應最佳，平均分別有 4、3.6 及 3.6 的發根數。而這些處理組其分芽生長茂盛，且根部發育良好，顯然 NAA 及 IBA 對於霍山石斛之發根具有重要之角色。第二部份為霍山石斛試管內提前開花之研究，其材料以具 2-3 葉，約 1 公分大小之幼苗為材料，於含有不同比例濃度之植物生長調節劑下，進行試管內提前開花之誘導。基礎培養基內另外添加不同濃度組合之 PGR，以 NAA 配合 TDZ、BA、2iP 或 kinetin。試驗結果顯示，在未添加任何 NAA 之試驗組中，以 BA 及 kinetin 該兩組較早被誘導花苞，其中 0.5 mg/l BA 平均花苞形成率為 1.67 個最高，其次為 1 mg/l BA 有 0.83 個，其花苞形成情形較佳，而 TDZ 組則無任何誘導情形發生。然而，在添加 0.5 mg/l NAA 1.

(10) 試驗組方面，以 TDZ 及 kinetin 較早被誘導花苞形成，BA 處理組則先大量誘導小植株產生後，於後期陸續被誘導花苞形成。統計其平均花苞形成率，以 5 mg/l TDZ 有 1.17 個最高，5 mg/l BA 及 1 mg/l BA 為 0.67 及 0.5 個次之。分析其上述結果，BA 在有無 NAA 誘導下，皆具有誘導作用。在繼代霍山石斛植株時，可由其生理反應推測，霍山石斛本身內生性細胞分裂素可能較高，故能於無生長調節劑之下，即可偶發性試管內開花。但若另外添加外生性細胞分裂素，其試管內提前開花之情形會相對增加。因此，可推測細胞分裂素扮演著試管內開花重要之因子。. 關鍵字：癒傷組織、霍山石斛、試管內提前開花、形態發生、植物生長調節劑、類原球體. 2.

(11) Induction of in vitro morphogenesis and early flowering of Dendrobium huoshanense. Advisor：Dr. Jen-Tsung Chen Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung Student：Po-Lun Lee Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung ABSTRACT The thesis was separated the two sections. To study in vitro morphogenesis of Dendrobium huoshanense is the first experiment. Basal medium contains 1/2 MS salt with vitamin, 20 g/l sucrose, 1 g/l peptone and 4 g/l Gelrite. The combination of 2,4-D with TDZ were also added for induction of callus. Root tip, leaf and stem node were harvested and placed on the medium. Callus was induced and grew well from root tip in the medium with 1 mg/l 2,4-D. Bright yellow callus was subsequently transferred to the medium containing NAA combination with TDZ or BA for induction of somatic embryogenesis. The PLB were induced and regenerated after 3 months. The rooting experiment was subsequently induced by added NAA or IBA. The results revealed that 0.1 mg/l NAA, 1 mg/l IBA and 5 mg/l IBA, with 4, 3.6 and 3.6 roots per tube, respectively, were observed better induction in the rooting. The second experiment focused on in vitro early flowering of Dendrobium huoshanense. 0.5-1 cm plantlets, with 2-3 leave, were embedded to the medium containing TDZ, BA, 2iP or kinetin with or without NAA for induction of in vitro early flowering. The results 3.

(12) suggested that better induction was observed in 0.5 mg/l BA and 1 mg/l BA with 1.67 and 0.83 flower buds per treatment respectively while without containing NAA, but no induction in TDZ treatment. However, the addition of 0.5 mg/l NAA revealed that TDZ and kinetin treatments were early induced in formation of flower bud and obtained 1.17 flower buds per treatment in 5 mg/l TDZ. Interestedly, BA treatment was observed to grow lot of cluster buds in the early stage and flowering in late stag subsequently. The results were observed that 0.5 mg/l BA and 1 mg/l BA yields 0.67 and 0.5 flower buds per treatment, respectively. In intro early flowering of Dendrobium huoshanense can occasionally observed in the subculture. The phenomenon implies that Dendrobium huoshanense possesses active endogenous cytokinins and results to in vitro early flowering spontaneously. However, the addition of exogenous cytokinins can enhance in vitro early flowering of Dendrobium huoshanense. Consequently, cytokinins play a crucial role in in vitro early flowering of Dendrobium huoshanense.. Keyword：callus, Dendrobium huoshanense, in vitro early flowering, morphogenesis, PGRs, PLB.. 4.

(13) 第一章、緒論 1.1 蘭花之分佈及植物學特性在開花植物中，蘭科（Orchidaceae）植物屬於較大科之ㄧ，除了於寒帶及沙漠地區外，幾乎可見其生長蹤影。根據記錄統計，蘭科植物目前有約有八百屬，三萬至三萬五千原生種，更有十萬餘種為人工培育之品種，且每年還有其他雜交品種推出，實為一個活躍之生技產業。蘭科植物依其生活型態，可歸類成常見之著生蘭（ epiph yte），如：蝴蝶蘭；地生蘭（terrestrial），如：紫蘭（又稱白及）；岩生蘭（lithophyte），如：辛氏盔蘭；腐生蘭（saprophytic ) ，如：天麻。（Rittershausen and Rittershausen, 2002）。從蘭科的生理構造特徵來分析，其屬於單子葉植物，雌雄同花。除此之外，其具五種植物特徵學（Sheehan and Sheehan,1994）。第一特徵，蘭花具完整花器，即具六片花枚，分內外兩輪，外輪為三片萼片，內輪為三片花瓣。兩側花瓣一般較大且成對，底部單瓣特化成唇辦（labellum or lip），外型奇幻多變，其功用為引誘昆蟲接近，以達授粉，完成繁衍之目的。而該豐富且華麗的外型，即為蘭花商業價值之所在。第二特徵，其花朵中央具蕊柱（column），由雌雄合蕊所組成。第三特徵，蕊柱前端內含花粉塊（pollinia），花粉塊乃由花粉所黏結組成，其因不同種類，而具有 2-8 塊之差。而花粉塊聚集之處為藥床（clinandrium），其外側具藥帽（anther cap），以蓋住花粉塊，並保護之。第四特徵，為位在花粉塊後側之喙（rostellum）。. 5.

(14) 第五特徵，其果實為蒴果（capsule），該蒴果內含多數缺乏胚乳之細小種子，種子發育僅停留在球形胚（globular embryo），故在自然環境下，須與蘭菌（orchid mycorrhizal fungus）共生，方得以發芽（Smith, 1966）。. 1.2 植物之形態發生生物體於發育及再生過程中，其細胞及組織經由分化，使得其器官或形態結構發生改變。然而植物之形態發生除可由有性之繁殖觀察到外，亦可從無性繁殖之方法窺其演變。一般而言，培植體（explants）在植物生長調節劑誘導下，即可直間或間接誘導癒傷組織或體胚形成，再改變生長調節劑種類，繼續誘導類原球體（protocorm-like body；PLB）或植株之形成。然而體胚在早期生長時，即以雙極性之特性，於相反方向生長，而分化形成莖端與根端（Haccius, 1978）。體胚與合子胚之型態發生是極為相似（Zimmerman. 1993），其胚之演化，先從分化成二分體開始，再繼續分裂成四分體、八分體，在進入球型胚。之後再轉變成心形胚（heart embryo），魚雷胚（torpedo embryo），最後再發育為成熟之合子胚（Dodeman et al., 1997）。而體胚與合子胚其最大之不同僅在於—合子胚乃經受精而成，但體胚則無經受精之過程。由於體胚形成，乃將體細胞經由逆分化過程後，再誘導再分化。其發育途徑又可分為直接誘導及間接誘導，但少數植物可進行中間型體胚發生（intermediate somatic embryogenesis）或重複型. 6.

(15) 體胚發生（repetitive somatic embryogenesis）之途徑。. 1.3 蘭花繁殖技術之演化及試管內形態發生早期蘭花以分株繁殖為主，其母株會於基部或是花梗形成側芽或小苗，再進行切離，與母株分開，以達繁殖之目的。但因分株之數量有限，故無法大量繁殖，以致造成特有品種具有天價之情形，更無法廣泛應用於花卉市場。爾後，無菌發芽成為蘭花繁殖之方法，其乃將蘭花種子播種於含營養成分之培養基，於無菌環境內進行生長及繁殖。但因種子本身還是有性繁殖而得來，原有之優良性狀仍無法保留，故演化成以組織培養之無性微體繁殖來取代之。其乃拜現代科技所賜，利用無菌培養，於培養基內添加植物生長調節劑，取蘭花之器官組織（如：根、莖、葉），以誘導其形成癒傷組織，或直接誘導體胚之形成，以進一步再誘導植株之形成。而這樣的繁殖方式，儼然已成為現今植物學繁殖之主要方法。蘭花組織培養之歷史可追溯於 60 年代，法國人莫瑞爾以莖頂進行組織培養，而誘導類原球體形成，進而獲得再生植株（Morel, 1960），而這也開啟蘭花組織培養之新方向。在組織培養的應用下，多種蘭科植物如：素心蘭（Cymbidium）、蝴蝶蘭（Phalaenoposis）、石斛蘭（Dendrobium）、香蘭（Vanilla planifolia）及巴菲爾鞋蘭（Paphiopedilum）等得以被大量地進行微體繁殖的研究，且如雨後春筍般刊登在專業期刊（Arditt and Ernst,1993；Chen et. 7.

(16) al.,2002）。另外，素心蘭可經由根莖進行微體繁殖（Hasegawa and Goi, 1987；Shimasaki and Uemoto, 1991；Chang and Chang, 1998）。經由癒傷組織形成體胚或類原球體後，再進行繁殖的有：蝴蝶蘭（Ishii et al., 1998）、石斛蘭（Jonojit et al., 2007）、素心蘭（Chang and Chang, 1998 )、文心蘭（Oncidium）（Chen and Chang, 2000）及巴菲特蘭（Hong et al., 2008）。經由類原球體產生而進行繁殖的有：瓢唇蘭（Catasetum）（Kraus and Moterio, 1989）、朵麗蝶蘭（Doritaenopsis）（Tokuhara and Mii, 1993）、萬代蘭（Venda）（Tanaka et al., 1975）、蝴蝶蘭（Rosmah et.al., 2006）及紫蘭（Spathoglottis plicata）（Teng et al., 1997）。亦可利用葉子作為培植體（explants），直接誘導體胚形成的有：文心蘭（Chen et al, 1999）、石斛蘭（Chung et al., 2007）及蝴蝶蘭（Kuo et al.,2005；Chen and Chang, 2006；Gow et al., 2008）。然而，蝴蝶蘭亦可利用原生質體，來做為達到無性微體繁殖之目的（Tokuhara and Mii, 2001；Shrestha et al., 2007）。. 1.4 蘭科植物形態發生之影響因子在蘭花形態發生之過程中，植物生長調節劑扮演著極為重要之角色。常用的生長調節劑可分為抑制體胚形成，但可促進生長的植物生長素（auxin）及可促進體胚形成，或能誘導開花的細胞分裂素（cytokinin）兩種。當然其他種類，如：吉貝素（gibberellin）或其他物質，如：椰子水、香蕉泥、. 8.

(17) 馬鈴薯泥，甚至一些化學物質，如：AgNO3、CoCl2、水楊酸….等等，皆會影響蘭花的形態發生。例如，在文心蘭的研究中，培養基添加 ancymidol、 paclobutrazol 及 ACC，皆會促使體胚之形成（Chen and Chang, 2003 ；Chen and Chang, 2003）。除此之外，培養基之成分及比例（如：無機鹽、碳源及氮源）、培植體之部位與擺放方向，及光照時間長短，皆會影響其形態發生之結果。例如：添加蔗糖 10 g/l，即能誘導形態發生之要求；文心蘭葉片尖端，軸面朝上擺放及黑暗培養者，體胚形成率皆較高（Chen and Chang, 2002）。. 1.5 植物開花機制之探討在高等植物中，被子植物之合子胚發育後，會進行植物營養生長期（vegetative phase），再生長多年後，植株成熟，即會進入所謂的開花期（flowering phase）（Goldberg et al. 1994）。在該時期即可進行有性生殖，以繁衍下一代。而近年來，縮短植物幼年期，一直被植物生物學及作物育種當做重要之課題（Chia et al. 1999; Chang and Hsing 1980; Jung and Müller 2009）。而試管內提前開花之突變與方法，已被研究多年，但其機轉仍然不明，特別是在非模式植物的研究。在開花的研究中，早在 1930 年，Mikhail Chailakhyan 就已提出開花素（frorigen）之存在（Taiz & Zeiger, 2006, p. 660），這些年來，植物學家深. 9.

(18) 深相信其能誘導開花。但經過多年的研究，仍無法明確地找到開花的刺激物質。而近年研究中指出，開花素可能是一些植物賀爾蒙，如：吉貝素、細胞分裂素、乙烯、RNA（mRNA 或 miRNA）、蛋白質…等。然而，誘導開花之原理被分類成四途徑。第一類、光周期性途徑（photoperiodic pathway）：其涉及光敏素（phytochrome）及隱光敏素（cryptochrome）之作用。當這些植物色素接受刺激後，會在葉子部位使得 C O基因表現，竟而轉錄 F T mR NA ，並運移至頂部分生組織（ ap ex meristem）。而這些mRNA，會繼續轉譯成FT蛋白，再與FD（ferredoxin）蛋白結合，成為一複合體。該複合體會誘發SOC1基因表現後，再繼續引發其他下游基因的表現，如：LFY及AP1基因之表現，而使得植物由營養生長期轉變成開花期，而誘發花朵的形成。另外，有部分FT mRNA也會同時在葉子部位轉譯成FT蛋白而送至頂部分生組織，也同樣誘發一連串基因表現，使得花朵形成（訊號路徑詳如圖1.1）。第二類、自發性及春化作用（autonomous and vernalization pathway）：其涉及葉子數目（如：煙草葉數目需長至22片才會開花），低溫處理（如：許多植物需經冬天低溫處理，才能抽花芽而開花）。該二者作用皆會降低FLC基因 (具SOC1基因抑制作用)的表現，使得植物進入開花期。第三類、碳水化合物（蔗糖）途徑（carbohydrate, or sucrose pathway）：其可增加LFY基因之表現，竟而誘導開花，但切確機轉仍不明。第四類、荷爾蒙路徑（hormones pathway）：其. 10.

(19) 最被研究透徹的是吉貝素，但皆僅於生物模式植物（阿拉伯芥）的研究。其藉由GAMYB基因之參與（Woodger et, al, 2003），而促進LFY基因之表現。另外，近年研究指出，吉貝素非敏感RNA（GA insensitive RNA；GAI RNA）扮演著長距離運移，而傳送至頂生組織，刺激FT 蛋白之生成，竟而引發一連串基因的表現，而使得花朵形成（Huang et. al., 2009）。. 1.6 蘭花產業及市場之現況當台灣農業發展及產值日趨式微之時，唯見蘭花科技產業於逆境中不斷成長，無論是產量或品質皆為逐年增加。因此，蘭花成為台灣最重要的經濟花卉之一，每年有近二百億的產值，故蘭花生物科技又被認為新十大建設之重要產業。近年來，由於更多開發中國家經濟及生活水平大幅提升，對於生活藝術及品質要求更高，連帶使得全球花卉市場蓬勃發展。目前台灣生產之花卉不僅可滿足國內市場，且在國際市場的需求增加之下，使得台灣的外銷花卉市場更具有發展空間。2010 年 2 月出刊的專業花卉雜誌「Flora Culture International」報導，由於國際金融海嘯的衝擊，在荷蘭花卉拍賣市場統計中，2009 年全球花卉產值下滑 5%，而台灣去年外銷花卉總金額 1 億 1,070 萬美元，蘭花占 78%，於逆境中成長。在此更顯示，台灣優良的蘭花生物科技廣受國際市場的接受與肯定。. 11.

(20) FT /FD. FT protein FT protein FT mRNA CO gene 6. 本圖修改自Taiz, L. and Zeiger, E. (2006) Plant Physiology. 4th ed. 圖1.1、開花分子訊息傳導之示意圖. 12.

(21) 第二章、霍山石斛之試管內形態發生 2.1 前人研究及試驗目的長期以來，蘭花大都聚焦在觀賞的應用，至於藥用蘭花的栽培，則以金線連（Anoectochilus formosanus Hayata）及白及較為大家所熟悉。然而在中國古書中，記載著另一種更為珍貴之品種 -- 霍山石斛（ Dendrobium huoshanense）。該石斛為蘭科石斛屬，從生藥學來分析，其有效成分為石斛鹼（Dendrobine），石斛能鹼（Nobiline），石斛因鹼（Dendrine），石斛次鹼（ Nobilonine ）， 6- 羥基石斛新鹼（ 6-Oxydendroxine ），氮氧石斛鹼（Denbrobium N-oxide）等生物鹼之外，亦發現多醣體及類黃酮成分。原產於中國華中、華南，因大量濫採，導致其產量急速減少，但又因市場供需增加，以致其價格高居不下。霍山石斛乃列為中國九大仙藥之一，在本草綱目中記載，霍山石斛具有強陰益精，厚腸胃，平胃氣，長肌肉，益智除驚，輕身延年之功效。另外，其他古書亦指出可清肝明目、養心靈神、清熱生津，清肺養胃。又列屬上品，故可久服調養身體。而近年來，其在藥理的領域中，更被深入的研究。研究中發現，其藉由活化視網膜色素上皮細胞，可恢復視覺之功能，而多醣體可調節造血及免疫功能（Hsieh et, al, 2008），實可稱為蘭中藥王。在先前研究中，霍山石斛即有取果莢之種子，置於有添加植物生長調節劑之培養基中，以誘導類原球體形成而進行繁殖。例如：有以添加2,4-D及 kinetin來誘導類原球體形成（Fu et al., 2004）；近年也有以甘露醇加入 kinetin，於前冷處理(cold pretreatment)後，大量誘導類原球體形成之報導。另外，也有以莖節作為培植體，添加NAA及kinetin來（Luo et al., 2009）. 13.

(22) 誘導PLB之形成（Wang et al., 2004）。但在繁殖的過程中，為更有效得到優良的類原球體，因此更多研究發表指出，可在培養基內加入水楊酸，於懸浮培養下，可獲得比控制組多1.63倍之類原球體（Wang et al., 2009）；另外，也有研究指出，碳源及氮源之比例亦會影響類原球體之形成（Zha et al., 2007）；在限制磷的狀況下，會使多醣體之生合成受影響，而降低類原球體之形成（Jiang et al., 2006）。本試驗設計，乃改取霍山石斛之其他組織器官，於不同植物生長調節劑誘導之下，進行無性的微體繁殖，藉由此方式，以有效成功地獲得大量新生植株，並保留其優良之性狀。另外，試驗亦做霍山石斛多倍體之誘導，以期能藉由此實驗來了解多倍體與二倍體之霍山石斛，觀察其性狀有何差異。. 2.2 材料與方法 2.2.1 試驗材料霍山石斛（Dendrobium huoshanense）的實生苗（購自百谷草藥用植物園，台灣南投）。. 2.2.2 基礎培養基試驗選用改良式 1/2 MS（Murashige and Skoog, 1962）鹽類（含維他命），添加 20 g/l 蔗糖，1 g/l 蛋白腖，4 g/l 水晶洋菜作為基礎培養。在加入水晶洋菜前，培養基先調整 pH 至 5.2 ± 0.01。. 2.2.3 植物生長調節劑 14.

(23) 本試驗選用之生長調節劑包括：植物生長素2,4-D、NAA、IBA 及細胞分裂素 TDZ、BA。. 2.2.4. 霍山石斛癒傷組織之誘導本試驗乃參考前人之方法（Chung et al., 2005），取霍山石斛之葉（0.5×1 cm）、根尖（1 cm）及莖節（取一節）來誘導體胚或癒傷組織之形成。然後將上述材料置於加有1-10 mg/l 之2,4-D 及0.1-1 mg/l 之TDZ之培養基內，於暗處誘導，於三個月後統計結果。另外，莖結部位亦作光照環境下，直接誘導體胚形成之試驗，亦於三個月後統計結果（上述培養基置於試管內，每一試管加入10 ml， 20個處理，每個處理有6個重複）。. 2.2.5 霍山石斛癒傷組織之試管內形態發生以試驗所得之癒傷組織，轉至0.5或2 mg/l NAA與0.3、1或3 mg/l等不同濃度的TDZ、BA之培養基，進行體胚誘導及器官的形成。（上述培養基置於試管內，每一試管加入10 ml， 21個處理，每個處理有5個重複）。. 2.2.6 霍山石斛多倍體之誘導以試驗所得之類原球體分兩種直徑大小實驗。小者類原球體直徑約2 mm 左右，置於含0.5 mg/l BA 及5-100 mg/l等不同濃度之秋水仙素的培養基，經七日處理後，再轉至含1 mg/l IBA之培養基繼續培養；大者類原球體直徑約4 mm左右，亦置於含 0.5 mg/l BA 及5 -100 mg/l等不同濃度之秋水仙素的培養基，經十日處理後，再轉至含1 mg/l IBA之培養基繼續培養，期以誘導多倍體之植株產生。 15.

(24) 2.2.7 霍山石斛發根之試驗本試驗進行繼代時，觀察到誘導的新植株幾乎無法有正常之根部生長。為改善此情形，另設計發根之試驗，以試驗所得之幼苗，轉至含0.1、1及5 mg/l NAA或IBA之培養基進行培養，進行4個月的生長，以了解根部誘導之情形，並觀察其生長狀況，且加以分析比較。. 2.2.8 統計方法試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值的差異分析。. 2.3 結果 2.3.1 霍山石斛癒傷組織之誘導試驗結果顯示，不同之培植體有不同之誘導反應，分別形成癒傷組織或直接形成芽體。在葉培植體誘導方面，全部試驗組皆無任何誘導反應發生。然而在根尖培植體誘導方面，發現含1 mg/l 2,4-D（*1），1 mg/l 2,4-D＋0.5 mg/l TDZ（*1）及1 mg/l 2,4-D＋1 mg/l TDZ（*2）之處理組，根尖於誘導初期呈現膨脹隆起之現象（圖2-1-a），而該現象隨著時間增加，膨脹情形更為顯著，且產生圓球狀之黃色組織（圖2-1-b），最後在尖端形成鮮黃色之癒傷組織（圖2-1-c）（表2-1）。在誘導十週後，取下該組織，並以相同培養基繼續繼代。然而，這些處理組所得到之癒傷組織，經分組繼代後，觀察其結果，除1 mg/l 2,4-D處理組之癒傷組織仍具保有鮮黃色之外表（圖 2-1-d），且有顯著良好的增殖能力外，其他處理組的癒傷組織，皆毫無增殖情形，且呈淡白色（圖2-1-e），最後萎縮褐化（圖2-1-f）。（* ）之內 16.

(25) 數字為試管數另外，莖節培植體於暗環境誘導方面，發現無添加生長調節劑（*2）， 0.1 mg/l TDZ （*2）、0.5 mg/l TDZ（*1）、0.5 mg/l TDZ（*3）、1 mg/l TDZ （*3）、1 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）、1 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）、 1 mg/l 2,4-D＋0.5 mg/l TDZ（*1）)、1 mg/l 2,4-D＋0.5 mg/l TDZ（*1）、1 mg/l 2,4-D＋1 mg/l TDZ （*1）及2 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）等八個處理有長出芽體（圖2-2-a）。另外，1 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）及2 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）等二個處理，有長出類似癒傷組織之物質（圖 2-2-c）（表2-2）。然上述長出來的芽體生長較大時（圖2-2-b），則移出試管外，以小蘭花瓶於一般培養基添加0.1 mg/l NAA下，進行繼代。而類似癒傷組織之物質，則於相同生長調節劑之試管內，繼續進行繼代。然而經繼代結果，皆毫無增殖生長情形，且最後發生褐化（圖2-2-d）。至於，莖節培植體於光照環境誘導方面，誘導表現情形更差，芽體生長比例更低。. 2.3.2 霍山石斛癒傷組織試管內形態發生及器官發生之誘導癒傷組織由原來含2,4-D之培養基轉至含BA或TDZ之培養後，於第三天即發現黃色的癒傷組織表面漸漸轉呈淡綠色（圖2-3-a,b,c）。經繼代後，癒傷組織漸漸形成類原球體（圖2-3-d）。從實驗統計發現，在2 mg/l NAA與TDZ 或BA組合下，其類原球體形成較佳（表2-3）。. 2.3.3 霍山石斛多倍體之誘導試驗初步誘導結果，小類原球體該組，經以50 mg/l及100 mg/l秋水仙素處理七日後，全數白化。然而，5 mg/l及10 mg/l秋水仙素處理者，因其濃度 17.

(26) 較低，故有部分類原球體繼續發育（圖2-4-a）。不過，試驗後期，也僅見 10 mg/l秋水仙素處理組有一根試管存活，並形成芽體（圖2-4-b）。而這些芽體經繼代後，形成叢生芽（圖2-4-c）。這些叢生芽在分株繼代，而漸漸長成幼苗（圖2-4-d）。至於大類原球體組，雖然以秋水仙素處理之時間較長，但因類原球體較大，所能承受秋水仙素毒性相對較強，類原球體存活率普遍較高，且形成芽體情形亦較佳。。. 2.3.4 霍山石斛發根之試驗在霍山石斛發根試驗之結果觀察到，0.1 mg/l NAA 及 1、5 mg/l IBA 等處理組之誘導反應最佳，平均有 4、3.6 及 3.6 的發根數（表 2-4）。而這些處理組（圖 2-5-a）其根部生長相較於對照組（圖 2-5-b），其根部發育良好，分芽生長較佳。並發現有試管內提前開花之情形發生，且其花朵外型均較正常（圖 2-5-c）。然而，在 5 mg/l NAA 處理組中，有 3 試管試驗組之幼苗發生褐化死亡（圖 2-5-d）。. 2.4 討論霍山石斛為大陸現今栽培之重要藥材之ㄧ，其繁殖皆以種子誘導類原球體為途徑。此外，前人研究中，石斛的繁殖有以取果夾種子、莖節（Asghar,. el al., 2011）、葉子（Chung et al., 2005, 2007）、芽端（Jonojit et al., 2007）誘導類原球體或癒傷組織之成功案例。但本實驗材料霍山石斛之繁殖試驗，又以另一種方式呈現，且其表現之結果，似乎又大為不同。在葉培植體方面，無任何處理組能被有效地誘導類原球體或癒傷組織的形成，這可推論其葉子的逆分化能力不佳，以至於其對植物生長調節劑無 18.

(27) 任何反應。然而在根尖培植體方面，發現於含有1 mg/l 2,4-D的處理下，有三處理組能產生癒傷組織，其餘處理組之根尖皆生長不佳、褐化，導致癒傷組織無法有效被誘導。上述的結果，在其他石斛蘭（Khosravi et al.,2008）與蘭花（Chen and Chang, 2000）也被觀察到。這些癒傷組織在經繼代後，發現僅有一組（無加入TDZ者），其繼代之癒傷組織增殖率明顯高過其他組，且其色澤呈現分化活性甚高之鮮黃色；反觀，有加入TDZ者，其癒傷組織之增殖率顯然不佳，且呈現較無分化能力的淡白色，最後呈現褐化之情形。相較於前人之研究，霍山石斛對於植物生長調節劑之誘導濃度要求，有著較窄範圍。至於，莖節培植體於暗環境誘導試驗觀察得到，在2,4-D濃度小於2 mg/l 以下之處理者，其莖節能長出1-3個芽體，而TDZ濃度似乎影響不大；但是當2,4-D濃度高過2 mg/l者，可能因其毒性關係，幾乎無法誘導芽體的產生。相較於其他同類型設計的試驗結果，本實驗因芽體繁殖率不高，似乎也不算是一種繁殖的好方法（Shiau et al., 2005）。另外，該實驗長出之類似癒傷組織之物質，經以相同培養基繼代後，觀察到其生長情形不佳，且最後也發生褐化萎縮之現象發生。試驗所得之癒傷組織經 IBA 及 TDZ 處理後，於三個月形成類原球體。相較於其他石斛蘭癒傷組織誘導類原球體生長，顯得較為緩慢（Zhao et al., 2008）。而其中又以含 2 mg/l NAA 組合 IBA 或 TDZ 之培養基者，其誘導效果較佳，平均有 40-80%之形成率。在多倍體之誘導試驗中發現，秋水仙素對於霍山石斛之類原球體顯然具強烈之毒性。以小類原球體該組來看，經以 50 mg/l 及 100 mg/l 秋水仙素處 19.

(28) 理七日後，全數白化。而 5 mg/l 及 10 mg/l 處理者，因其濃度較低，故有類原球體尚呈現具活性的綠色。但經繼代培養後，最後也僅見 10 mg/l 處理組有一根試管長成幼苗。至於大類原球體組，雖然以秋水仙素處理之時間較長，但因類原球體較大，所承受的毒性耐受相對較佳，類原球體存活率普遍較高，而形成之幼苗相對較多。在微體繁殖的過程中，發根為植株移出試管前甚為重要之步驟。而影響發根的原因很多，除植物本身內生性細胞分裂素濃度會影響外，另外添加植物生長素（Aktar et al, 2007）或活性碳（Khatun et al, 2010）都會影響其生長。而在本論文的發根試驗中，發現IBA處理組在任何濃度下，皆能有效地誘導發根；但NAA處理組，除5 mg/l NAA該組可能因濃度過高，導致許多試管植株發生褐化死亡外，在0.1 mg/l及1 mg/l NAA處理下，其根部可有效地被誘導。類似的試驗，大陸先前也有同樣的研究結果（Shi et al., 2003）。由於試驗之植株根部發育良好，使得其生長情形較佳。在偶然間發現，少數處理組有試管內提前開花之情形發生，且花朵外型正常。另外，花朵基部有膨脹情形，推測未來其可能會形成果夾。. 20.

(29) 表2-1. TDZ及2,4-D對霍山石斛根尖培植體癒傷組織形成之影響 Treatments（mg/l）. Explants. Responding. Callus formation. 2,4-D. TDZ. number. explants. (%). 0. 0. 6. 0. 0 b. 0. 0.1. 6. 0. 0 b. 0. 0.5. 6. 0. 0 b. 0. 1. 6. 0. 0 b. 1. 0. 6. 1. 17 ab. 1. 0.1. 6. 0. 0 b. 1. 0.5. 6. 1. 17 ab. 1. 1. 6. 2. 33 a. 2. 0. 6. 0. 0 b. 2. 0.1. 6. 0. 0 b. 2. 0.5. 6. 0. 0 b. 2. 1. 6. 0. 0 b. 5. 0. 6. 0. 0 b. 5. 0.1. 6. 0. 0 b. 5. 0.5. 6. 0. 0 b. 5. 1. 6. 0. 0 b. 10. 0. 6. 0. 0 b. 10. 0.1. 6. 0. 0 b. 10. 0.5. 6. 0. 0 b. 10. 1. 6. 0. 0 b. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法進行平均值得差異比較( P< 0.05)。. 21.

(30) 表2-2. TDZ及2,4-D對霍山石斛莖節培植體誘導之影響 Treatments（mg/l）. Explants. Responding. Callus. Bud. number. explants. formation. formation. 2,4-D. TDZ. 0. 0. 6. 2 ab. 0. 2 ab. 0. 0.1. 6. 2 ab. 0. 2 ab. 0. 0.5. 6. 3 a. 0. 3 a. 0. 1. 6. 3 a. 0. 3 a. 1. 0. 6. 0 b. 0. 0 b. 1. 0.1. 6. 2 ab. 1. 1 ab. 1. 0.5. 6. 1 ab. 0. 1 ab. 1. 1. 6. 1 ab. 0. 1 ab. 2. 0. 6. 0 b. 0. 0 a. 2. 0.1. 6. 1 ab. 1. 0 b. 2. 0.5. 6. 0 b. 0. 0 b. 2. 1. 6. 0 b. 0. 0 b. 5. 0. 6. 0 b. 0. 0 b. 5. 0.1. 6. 0 b. 0. 0 b. 5. 0.5. 6. 0 b. 0. 0 b. 5. 1. 6. 0 b. 0. 0 b. 10. 0. 6. 0 b. 0. 0 b. 10. 0.1. 6. 0 b. 0. 0 b. 10. 0.5. 6. 0 b. 0. 0 b. 10. 1. 6. 0 b. 0. 0 b. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法進行平均值得差異比較( P< 0.05)。. 22.

(31) 表2-3. 植物生長調節劑對霍山石斛癒傷組織誘導體胚形成之影響 Treatments（mg/l） BA. Number of. Percentage of PLB. PLB formation. formation (%). NAA. TDZ. 0. 0. 0. 0 b. 0. 0.3. 1. 20 ab. 0. 1. 2. 40 ab. 0. 3. 0. 0 b. 0.5. 0. 0. 0 b. 0.5. 0.3. 0. 0 b. 0.5. 1. 2. 40 ab. 0.5. 3. 1. 20 ab. 2. 0. 4. 80 a. 2. 0.3. 3. 60 ab. 2. 1. 2. 40 ab. 2. 3. 2. 40 ab. 0. 0.3. 0. 0 b. 0. 1. 1. 20 ab. 0. 3. 1. 20 ab. 0.5. 0.3. 3. 60 ab. 0.5. 1. 0. 0 b. 0.5. 3. 1. 20 ab. 2. 0.3. 2. 40 ab. 2. 1. 4. 80 a. 2. 3. 3. 60 ab. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法進行平均值得差異比較( P< 0.05)。 23.

(32) 表2-4. NAA及IBA對霍山石斛發根及植株生長之影響 Treatments. Root. Shoot. Average of. Average of. Flowering and. (mg/l). No.. No.. root No.. shoot No.. flower No.. PGR-free. 2. 16. 0.8 bc. 3.2. 0/0. NAA. 0.1. 20. 20. 4 a. 4. 2/2. 1. 11. 10. 2.2 abc. 2. 0/0. 5. 0. 5. 0 c. 1. 0/0. 0.1. 17. 18. 3.2 ab. 3.6. 0/0. 1. 18. 17. 3.6 a. 3.4. 1/2. 5. 18. 22. 3.6 a. 4.4. 1/1. IBA. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法進行平均值得差異比較( P< 0.05)。. 24.

(33) a. b. d. e. c. f. 圖 2-1. 霍山石斛根尖誘導癒傷組織之情形及繼代生長狀況（bar） a. 誘導初期，根尖呈現膨脹隆起之現象 ( 4.5 mm ) b. 隨著時間增加，膨脹情形更為顯著，且形成圓球狀之黃色組織 ( 4.5 mm ) c. 根尖之尖端形成鮮黃色之癒傷組織 ( 4.5 mm ) d. 癒傷組織在 1 mg/l 2,4-D 繼代下，繼續增殖生長 ( 7.2 mm ) f. 癒傷組織在 1 mg/l 2,4-D 且含 TDZ 下進行繼代，發現有白化情形發生 ( 4.5 mm ) g. 癒傷組織因無法增殖生長，最後萎縮褐化 ( 7.2 mm ). 25.

(34) a. b. c. d. 圖 2-2. 霍山石斛莖節形態發生之觀察及組織繼代之生長狀況（bar） a. 莖節培植體於暗環境誘導之小芽體 ( 3.5 mm ) b. 小芽體生長至較大之狀況時，即移出試管，另外繼代 ( 3.5 mm ) c. 莖節培植體於暗環境誘導之類似癒傷組織 ( 1.6 mm ) d. 類似癒傷組織經繼代結果，其毫無增殖生長，甚至萎縮褐化 ( 1.6 mm ). 26.

(35) a. b. c. d. 圖 2-3. 霍山石斛癒傷組織試管內形態發生及器官發生之誘導情形（bar） a. 癒傷組織於誘導前呈現黃色蟲卵外型 ( 0.8 mm ) b. 癒傷組織於誘導第三天即轉呈淺綠色 ( 0.8 mm ) c. 癒傷組織誘導過程中，組織顏色加深 ( 10 mm ) d. 誘導後期，癒傷組織轉成類原球體 ( 15 mm ). 27.

(36) a. b. c. d. 圖 2-4. 霍山石斛多倍體之誘導之過程（bar） a. 類原球體莖秋水仙素處理後，部分組織呈現白化情形 ( 0.8 mm ) b. 存活下來之類原球體，繼續分化成芽體 ( 0.8 mm ) c. 芽體至試管移出後，在瓶內分化形成叢生芽 ( 15 mm ) d. 將叢生芽分株繼代，以促進其生長 ( 15 mm ). 28.

(37) a. b. c. d. 圖 2-5. 霍山石斛發根試驗之過程及其生長情形 a. 植株經 IBA 或 NAA 處理後，根部被誘導生長 ( 10 mm ) b. 控制組之植株雖有分芽生長，但無根部之發育 ( 10 mm ) c. 經四個月的誘導，根部發育明顯改善，且觀察到有試管內提前開花之情形 ( 15 mm ) d. 在 5 mg/l NAA 處理組中，可能因濃度過高，而導致植株褐化死亡 ( 8 mm ). 29.

(38) 第三章、霍山石斛試管內提前開花之研究. 3.1 前人研究及試驗目的在試管內開花之研究當中，以蘭科植物被研究得最多。近年來，其他植物也陸續被用來研究，如：抗腫瘤之藥用植物藥睡茄（Withania. somnifera Dunal）（Saritha and Naidu,2007）、莧科觀賞植物鳳尾球（Celosia argentea var. plumose）（Bodhipadma et al., 2011）等。然而，影響試管內開花的因子除了前面所描述的蔗糖、吉貝素外，另外包括有：含胺物質（精胺--spermidine、腐胺--putrescine）及被討論甚多的細胞分裂素(Bernier et al. 1993；Bonhomme et al. 2000；Corbesier and Coupland 2006)。因此，從這些研究中得知，細胞分裂素扮演著極為重要之角色。因此，陸續的試驗即以不同細胞分裂素為主角，配合其他植物生長調節劑來組合。蘭花的育種時程取決於本身的生長週期，一般從種子到開花約需二至四年以上。因此，如果能有效地縮短蘭花的幼年期，則育種的時程也可以隨之縮短，如此可以有效地降低育種的成本，並加快新品種的推出。而應用試管內開花的系統，可作為蘭花早期變異的檢測，並可以縮短育種的時程（Alex et al., 2008）。在蘭花的試管內開花方面，已經被報導的包括 Cymbidium（Kostenyuk et al., 1999；Chang and Chang, 2003）、Doriella（Duan and Yazawa, 1994）、石斛蘭（Wang et al., 1997；Hee et al., 2007；Sim et al., 2007, 2008；Tee et al., 30.

(39) 2008；Wang, et al., 2009）、文心蘭（Kerbauy 1984）、蝴蝶蘭（Duan and Yazawa, 1995）及其他蘭花（Chia et al., 1999；Oh and Kostenyuk, 2001）。早期試管內提前開花之研究，即以添加不同比例之細胞分裂素或再添加植物生長素處理，以誘導其開花。但其中最值得注意的是，近幾年的研究當中，連續三篇論文發表在 Plant Cell Reports，其完整地建立了石斛蘭實生苗於試管內，提早開花及生產種子的系統。其中一個試驗（Sim et al., 2007）乃利用石斛種子播種後，取得實生苗為材料，將幼苗分兩個階段試驗培養。第一階段，乃以含椰子水之培養基進行液態懸浮培養，俾使幼苗成長至具有花芽之形成；並於試驗之第二階段改以含 BA 之液固雙層培養基培養，以使花苞形成後，得以完整開花。該試管內開花試驗也將不同階段之幼苗研磨後，萃取其內生性細胞分裂素，以 HPLC 分析成分後，再利用放射免疫分析（radioimmunoassay）定量其濃度（Sim et al., 2008）。試驗結果顯示，在花芽生長過程中，植株體內 2iP 及 iPA 濃度甚高，並延至花朵開花階段；但若花芽誘導失敗，其濃度則顯著下降。因此，作者推測該兩種細胞分裂素，對於試管內提前開花扮演著極為重要之角色。雖然該試驗建立了有效的系統，但其結果，仍發現種子發育能力低於 1％，且花朵變異甚大。因此，從這些研究中得知，細胞分裂素扮演著試管內開花極為重要之因子。故為更加了解此試管內開花之差異，解開開花週期的疑問，本試驗選用花型較小之霍山石斛為材料，進行試管內開花之誘導，並加以研究。. 3.2 材料與方法 3.2.1 試驗材料. 31.

(40) 以試驗材料於繼代時，所得之幼苗為材料。. 3.2.2 基礎培養基試驗選用改良式 1/2 MS（Murashige and Skoog, 1962）鹽類（含維他命），添加 20 g/l 蔗糖，1 g/l 蛋白腖，4 g/l 水晶洋菜作為基礎培養。在加入水晶洋菜前，培養基先調整 pH 至 5.2 ± 0.01。. 3.2.3 植物生長調節劑本試驗選用之生長調節劑包括：植物生長素 NAA 及細胞分裂素 TDZ、 BA、2iP 及 kinetin。. 3.2.4 有無添加 NAA 誘導提前開花之處理本試驗取霍山石斛0.5-1cm高，具2-3葉片之幼苗為材料，以植物生長調節劑作為誘導因子。試驗共分二組，分別於培養基內無添加或添加0.5 mg/l NAA與 0.1-5 mg/l TDZ或0.1-5 mg/l BA或0.1-5 mg/l 2iP或0.1-5 mg/l kinetin（上述培養基置於試管內，每一試管加入10 ml，共作17個處理，每個處理有6個重複。）. 3.2.5 開花階段之辨識本開花實驗之階段辨識，乃依照花朵發育狀況分成四階段：第一階段為花序形成期：可見頂端分生組織（apex meristem）出現細小的 32.

(41) 芽體，且該芽體有繼續生長之趨勢（如圖 3-1-a）。第二階段為花苞形成期：該細小芽體長成較大花苞，且外型完整（如圖 3-1-b）。第三階段為開花期：花苞於生長成熟後，綻放花瓣，且持續至少兩周（如圖 3-1-c）。第四階段為結果期：花朵自花授粉，並形成果莢（如圖 3-1-d）。. 3.2.6 統計方法試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值的差異分析。. 3.3 結果 3.3.1 無添加 NAA 誘導提前開花之反應在無添加NAA的處理，花朵的形態發生大都僅形成花苞，而無法正常開花而褐化（如圖3-2-a）（除添加0.5 mg/l kinetin 有一試管開花外）（如圖 3-2-b）。而花苞形成以添加BA反應較佳，其濃度0.1 mg/l有1試管，0.5 mg/l 有3試管，1 mg/l有2試管，5 mg/l有1試管，幾乎所有濃度處理組皆有花苞形成。kinetin組次之，其濃度0.1 mg/l有2試管，0.5 mg/l有1試管，1 mg/l 有2試管。添加TDZ者，皆無花苞形成，而添加2iP者，僅有0.5 mg/l該處理有1試管形成花苞（表一）。. 3.3.2 添加 NAA 誘導提前開花之反應在添加0.5 mg/l NAA處理之組別，大部分試管內植株的根還是被抑制生 33.

(42) 長，僅有少數幾組有發短根情形。在試驗初期，開花情形以添加TDZ及 kinetin兩組最早形成花苞，其花苞形成情形分別為：TDZ濃度0.1 mg/l有1 試管，0.5 mg/l有1試管，5 mg/l有1試管；kinetin濃度0.1 mg/l有1試管，1 mg/l有2試管，5 mg/l有1試管。在試驗後期，發現初期分芽生長茂盛之BA 該組，其花苞逐漸形成，而花苞形成之濃度為：0.5 mg/l 有1試管，1 mg/l 有3試管，5 mg/l 有3試管。另外，2iP處理組，也於後期有花苞形成，其濃度為：0.1 mg/l有1試管，1 mg/l有2試管，5 mg/l有1試管（表二）。. 3.4 討論本試驗初期之設計，乃參考前人之方法，於培養基內加入不同種類及濃度之細胞分裂素，來影響開花週期，以誘導其開花。由試驗結果得知，在無添加NAA之試驗組中，以BA及kinetin二處理組誘導開花情形最佳，但發現花朵的形態發生，大都僅形成花苞即停止，而無法正常開花（除0.5 mg/l kinetin有一處理組開花）。然而，2iP處理組僅一組有花苞形成，TDZ處理組則完全無花苞形成。經觀察試管內幼苗之生長狀況，無任何一處理的幼苗能長出根。因此，花苞可經由某幾種細胞分裂素來刺激形成，但也因為細胞分裂素的關係，而抑制根的生長（Tee et al., 2008），以致幼苗無法吸收養分，竟而無法得到更多開花的營養成分（如:磷），或生合成進一步開花之內生性植物荷爾蒙，如： iPA（ Sim et al., 2008）或其他開花素 (frorigen)，如：一些長距離運移mRNA（Huang et. al., 2009）或蛋白質，而導致花苞生長停止。另外，從結間部位會因細胞分裂素，而長出較多新的芽體，竟而成為新的植株。但也會因為該些細胞分裂素濃度過高，反而. 34.

(43) 使幼苗褐化死亡。為改善發根受阻之情形，故參考前人之試驗（Chang and Chang, 2003），以添加0.5 mg/l NAA，期能對根部受抑制生長有所改善，並更有效誘導開花。經試驗結果，花苞形成以TDZ及kinetin處理組最早形成。但因根部發育仍被抑制，故花苞大部分仍無法開花（僅0.1 mg/l kinetin有1試管開花）。有趣的是，BA該組初期則呈現大量分芽生長情形，一直至試驗後期，才出現花苞的形成。但因根部生長仍受抑制，故花苞大部分皆無法正常開花（僅 5 mg/l BA處理組有1試管開花）。在試管內開花試驗及繼代過程中，發現花苞及花朵常有變異之外型產生（如圖3-3），而這樣的結果也在其他誘導試驗中發現（Tee et al., 2008；Sim et al., 2008）。推究其原因，除了可能是植物生長營養不足外，外生性細胞分裂素、乙烯及多胺類代謝產物（Kumar et.al., 1997； Kakkar et al., 2002）的存在，都可能誘使開花基因受到改變，而讓花朵產生變異性。特別值得注意的是，當試驗材料在繼代時，發現有少數幾株會發生試管內開花（培養基並無加入任何植物調節劑），由此可推論，霍山石斛該品種於試管內生長時，其細胞分裂素之分泌即較為旺盛，故能在試管內偶發性發生開花情形。但是，若另外添加細胞分裂素，則發現試管內開花之情形會相對增高。然而，相較於原生植株即有根的存在，試驗組因根部生長受抑制，使得其開花之情形，大都止於花苞形成之階段；相反地，繼代的原生植株，因其生長較為正常，花朵之形態也較為完整，甚至會自花受粉而生成果夾。另外，在做發根試驗時，也發現到一些處理組之試管內，不僅有花苞形成，並且發現有開花的情形，而花朵的外型皆為正常。以此可證明，植株 35.

(44) 在生長狀況正常下，其獲得充分之營養成分，使得葉子得以合成足夠之內生性荷爾蒙或開花素，而不會讓開花情形停留在花苞形成之階段。. 36.

(45) 表3-1. 在無添加NAA下，TDZ、BA、2iP及kinetin對霍山石斛試管內開花之影響 Treatments (mg/l) PGR-free TDZ 0.1 0.5 1.0 5.0 BA 0.1 0.5 1.0 5.0 2iP 0.1 0.5 1.0 5.0 kinetin 0.1 0.5 1.0 5.0. Flowering No. 2 0 0 0 0 1 3 2 1 0 1 0 0 2 1 2 0. Bud No. 2 0 0 0 0 1 10 5 2 0 2 0 0 2 1 2 0. *花序外型： A：僅形成花苞而未開放. Average of bud No. 0.33 b 0 b 0 b 0 b 0 b 0.17 b 1.67 a 0.83 ab 0.33 b 0 b 0.33 b 0 b 0 b 0.33 b 0.17 b 0.33 b 0 b. Flower type* 1A / 1A. 1A 2A / 6A / 2A 2A / 3A 2A 2A. 1A / 1A 1B 1A / 1A. B：花朵已開放. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法進行平均值得差異比較( P< 0.05)。. 37.

(46) 表 3-2. 在添加 0.5 mg/l NAA 下，TDZ、BA、2iP 及 kinetin 對霍山石斛試管內開花之影響 Treatments (mg/l) PGR-free TDZ 0.1 0.5 1.0 5.0 BA 0.1 0.5 1.0 5.0 2iP 0.1 0.5 1.0 5.0 kinetin 0.1 0.5 1.0 5.0. Flowering No. 0 1 1 0 1 0 1 3 3 1 0 2 1 1 0 2 1. Bud No. 0 1 2 0 7 0 1 3 4 1 0 2 1 1 0 3 1. *花序外型： A：僅形成花苞而未開放. Average of bud No. 0 b 0.17 ab 0.33 ab 0 b 1.17 a 0 b 0.17 ab 0.5 ab 0.67 ab 0.17 ab 0 b 0.33 ab 0.17 ab 0.17 ab 0 b 0.5 ab 0.17 ab. Flower type* 1A 2A 7A 1A 1A / 1A/ 1A 1A/ 2A/ 1B 1A 1A/ 1A 1A 1B 1A / 2A 1A. B：花朵已開放. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法進行平均值得差異比較( P< 0.05)。. 38.

(47) a. b. c. d. 圖 3-1. 霍山石斛開花階段之辨識（bar） a. 花序形成期：可見頂端分生組織出現細小的芽體 ( 4.5 mm ) b. 花苞形成期：該細小芽體長成較大花苞，且外型完整 ( 4.5mm) c. 開花期：花苞於生長成熟後，綻放花瓣，且持續至少兩周 ( 4.5mm ) d. 結果期：花朵自花授粉，並形成果莢 ( 12 mm ). 39.

(48) a. b. 圖 3-2. 試管內提前開花實驗之花朵形態發生（bar） a. 大都數的處理組，其僅形成花苞，且無法正常開花而褐化 ( 8.8 mm ) b. 少數處理組得以於試管內花苞開放 ( 8.8 mm ). 40.

(49) 圖 3-3. 試管內提前開花之花朵外型變異（bar） a. 開花實驗中花瓣外型之變異 ( 4.5 mm ) b. 開花實驗中花苞外型之變異 ( 4.5 mm ) c. 繼代過程中花朵之變異性，可觀察到花托肥大之外型 ( 12 mm ) d. 繼代過程中花朵之變異性，可觀察到花瓣奇特之外型 ( 12 mm ). 41.

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