第一章 緒論
1.5 植物開花機制之探討
在高等植物中，被子植物之合子胚發育後，會進行植物營養生長期
（vegetative phase），再生長多年後，植株成熟，即會進入所謂的開花期
（flowering phase）（Goldberg et al. 1994）。在該時期即可進行有性生殖，以 繁衍下一代。而近年來，縮短植物幼年期，一直被植物生物學及作物育種 當做重要之課題（Chia et al. 1999; Chang and Hsing 1980; Jung and Müller 2009）。而試管內提前開花之突變與方法，已被研究多年，但其機轉仍然不 明，特別是在非模式植物的研究。
在開花的研究中，早在 1930 年，Mikhail Chailakhyan 就已提出開花素
（frorigen）之存在（Taiz & Zeiger, 2006, p. 660），這些年來，植物學家深
深相信其能誘導開花。但經過多年的研究，仍無法明確地找到開花的刺激 物質。而近年研究中指出，開花素可能是一些植物賀爾蒙，如：吉貝素、
細胞分裂素、乙烯、RNA（mRNA 或 miRNA）、蛋白質…等。
然 而 ， 誘 導 開 花 之 原 理 被 分 類 成 四 途 徑 。 第 一 類 、 光 周 期 性 途 徑
（autonomous and vernalization pathway）：其涉及葉子數目（如：煙草葉數 目需長至22片才會開花），低溫處理（如：許多植物需經冬天低溫處理，
才能抽花芽而開花）。該二者作用皆會降低FLC基因 (具SOC1基因抑制作 用)的表現，使得植物進入開花期。第三類、碳水化合物（蔗糖）途徑
（carbohydrate, or sucrose pathway）：其可增加LFY基因之表現，竟而誘導 開花，但切確機轉仍不明。第四類、荷爾蒙路徑（hormones pathway）：其
最被研究透徹的是吉貝素，但皆僅於生物模式植物（阿拉伯芥）的研究。
其藉由GAMYB基因之參與（Woodger et, al, 2003），而促進LFY基因之表 現。另外，近年研究指出，吉貝素非敏感RNA（GA insensitive RNA；GAI RNA）扮演著長距離運移，而傳送至頂生組織，刺激FT 蛋白之生成，竟 而引發一連串基因的表現，而使得花朵形成（Huang et. al., 2009）。
1.6 蘭花產業及市場之現況
當台灣農業發展及產值日趨式微之時，唯見蘭花科技產業於逆境中不斷 成長，無論是產量或品質皆為逐年增加。因此，蘭花成為台灣最重要的經 濟花卉之一，每年有近二百億的產值，故蘭花生物科技又被認為新十大建 設之重要產業。近年來，由於更多開發中國家經濟及生活水平大幅提升，
對於生活藝術及品質要求更高，連帶使得全球花卉市場蓬勃發展。目前台 灣生產之花卉不僅可滿足國內市場，且在國際市場的需求增加之下，使得 台灣的外銷花卉市場更具有發展空間。2010 年 2 月出刊的專業花卉雜誌
「Flora Culture International」報導，由於國際 金融海嘯的衝擊，在荷蘭花卉 拍賣市場統計中，2009 年全球花卉產值下滑 5%，而台灣去年外銷花卉總 金額 1 億 1,070 萬美元，蘭花占 78%，於逆境中成長。在此更顯示，台灣 優良的蘭花生物科技廣受國際市場的接受與肯定。
6
CO gene FT mRNA FT protein
FT /FD
FT protein
本圖修改自Taiz, L. and Zeiger, E. (2006) Plant Physiology. 4
th
ed圖1.1、開花分子訊息傳導之示意圖
第二章、霍山石斛之試管內形態發生
斛鹼（Dendrobine），石斛能鹼（Nobiline），石斛因鹼（Dendrine），石斛次 鹼 （ Nobilonine ）， 6- 羥 基 石 斛 新 鹼 （ 6-Oxydendroxine ）， 氮 氧 石 斛 鹼 kinetin來誘導類原球體形成（Fu et al., 2004）；近年也有以甘露醇加入 kinetin，於前冷處理(cold pretreatment)後，大量誘導類原球體形成之報導（Luo et al., 2009）。另外，也有以莖節作為培植體，添加NAA及kinetin來
誘導PLB之形成（Wang et al., 2004）。但在繁殖的過程中，為更有效得到 優良的類原球體，因此更多研究發表指出，可在培養基內加入水楊酸，於 懸浮培養下，可獲得比控制組多1.63倍之類原球體（Wang et al., 2009）；
另外，也有研究指出，碳源及氮源之比例亦會影響類原球體之形成（Zha et
霍山石斛（Dendrobium huoshanense）的實生苗（購自百谷草藥用植物園，
台灣南投）。
2.2.2 基礎培養基
試驗選用改良式 1/2 MS（Murashige and Skoog, 1962）鹽類（含維他命），
添加 20 g/l 蔗糖，1 g/l 蛋白腖，4 g/l 水晶洋菜作為基礎培養。在加入水晶 洋菜前，培養基先調整 pH 至 5.2 ± 0.01。
本試驗選用之生長調節劑包括：植物生長素2,4-D、NAA、IBA 及細胞
2.2.7 霍山石斛發根之試驗
試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平 均值的差異分析。 mg/l TDZ（*1）及1 mg/l 2,4-D＋1 mg/l TDZ（*2）之處理組，根尖於誘導 初期呈現膨脹隆起之現象（圖2-1-a），而該現象隨著時間增加，膨脹情形
數字為試管數
另外，莖節培植體於暗環境誘導方面，發現無添加生長調節劑（*2），
0.1 mg/l TDZ （*2）、0.5 mg/l TDZ（*1）、0.5 mg/l TDZ（*3）、1 mg/l TDZ
（*3）、1 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）、1 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）、 1 mg/l 2,4-D＋0.5 mg/l TDZ（*1）)、1 mg/l 2,4-D＋0.5 mg/l TDZ（*1）、1 mg/l 2,4-D＋1 mg/l TDZ （*1）及2 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）等八個處理 有長出芽體（圖2-2-a）。另外，1 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）及2 mg/l 2,4-D＋0.1 mg/l TDZ（*1）等二個處理，有長出類似癒傷組織之物質（圖
較低，故有部分類原球體繼續發育（圖2-4-a）。不過，試驗後期，也僅見
el al.
, 2011）、葉子（Chung et al., 2005, 2007）、芽端（Jonojit et al., 2007）誘導類原球體或癒傷組織之成功案例。但本實驗材料霍山石斛之繁殖試 驗，又以另一種方式呈現，且其表現之結果，似乎又大為不同。
在葉培植體方面，無任何處理組能被有效地誘導類原球體或癒傷組織的 形成，這可推論其葉子的逆分化能力不佳，以至於其對植物生長調節劑無
任何反應。然而在根尖培植體方面，發現於含有1 mg/l 2,4-D的處理下，有 三處理組能產生癒傷組織，其餘處理組之根尖皆生長不佳、褐化，導致癒 傷組織無法有效被誘導。上述的結果，在其他石斛蘭（Khosravi et al.,2008）
與蘭花（Chen and Chang, 2000）也被觀察到。這些癒傷組織在經繼代後，
發現僅有一組（無加入TDZ者），其繼代之癒傷組織增殖率明顯高過其他 算是一種繁殖的好方法（Shiau et al., 2005）。另外，該實驗長出之類似癒 傷組織之物質，經以相同培養基繼代後，觀察到其生長情形不佳，且最後
理七日後，全數白化。而 5 mg/l 及 10 mg/l 處理者，因其濃度較低，故有類 原球體尚呈現具活性的綠色。但經繼代培養後，最後也僅見 10 mg/l 處理組 有一根試管長成幼苗。至於大類原球體組，雖然以秋水仙素處理之時間較 長，但因類原球體較大，所承受的毒性耐受相對較佳，類原球體存活率普 遍較高，而形成之幼苗相對較多。
在微體繁殖的過程中，發根為植株移出試管前甚為重要之步驟。而影響 發根的原因很多，除植物本身內生性細胞分裂素濃度會影響外，另外添加 植物生長素（Aktar et al, 2007）或活性碳（Khatun et al, 2010）都會影響其 生長。而在本論文的發根試驗中，發現IBA處理組在任何濃度下，皆能有效 地誘導發根；但NAA處理組，除5 mg/l NAA該組可能因濃度過高，導致許 多試管植株發生褐化死亡外，在0.1 mg/l及1 mg/l NAA處理下，其根部可有 效地被誘導。類似的試驗，大陸先前也有同樣的研究結果（Shi et al., 2003）。
由於試驗之植株根部發育良好，使得其生長情形較佳。在偶然間發現，少 數 處 理 組 有 試 管 內 提 前 開 花 之 情 形 發 生 ， 且 花 朵 外 型 正 常 。 另 外，花朵基部有膨脹情形，推測未來其可能會形成果夾。
表2-1. TDZ及2,4-D對霍山石斛根尖培植體癒傷組織形成之影響 Treatments（mg/l） Explants
number
表2-2. TDZ及2,4-D對霍山石斛莖節培植體誘導之影響 Treatments（mg/l） Explants
number
表2-3. 植物生長調節劑對霍山石斛癒傷組織誘導體胚形成之影響 Treatments（mg/l） Number of
PLB formation
Percentage of PLB formation (%)
表2-4. NAA及IBA對霍山石斛發根及植株生長之影響
圖 2-1. 霍山石斛根尖誘導癒傷組織之情形及繼代生長狀況 （bar）
a. 誘導初期，根尖呈現膨脹隆起之現象 ( 4.5 mm )
b. 隨著時間增加，膨脹情形更為顯著，且形成圓球狀之黃色組織 ( 4.5 mm )
c. 根尖之尖端形成鮮黃色之癒傷組織 ( 4.5 mm )
d. 癒傷組織在 1 mg/l 2,4-D 繼代下，繼續增殖生長 ( 7.2 mm )
f. 癒傷組織在 1 mg/l 2,4-D 且含 TDZ 下進行繼代，發現有白化情形發生 ( 4.5 mm )
g. 癒傷組織因無法增殖生長，最後萎縮褐化 ( 7.2 mm )
a b c
e
d f
圖 2-2. 霍山石斛莖節形態發生之觀察及組織繼代之生長狀況 （bar）
a. 莖節培植體於暗環境誘導之小芽體 ( 3.5 mm )
b. 小芽體生長至較大之狀況時，即移出試管，另外繼代 ( 3.5 mm ) c. 莖節培植體於暗環境誘導之類似癒傷組織 ( 1.6 mm )
d. 類似癒傷組織經繼代結果，其毫無增殖生長，甚至萎縮褐化 ( 1.6 mm )
a b
c d
圖 2-3. 霍山石斛癒傷組織試管內形態發生及器官發生之誘導情形（bar）
a. 癒傷組織於誘導前呈現黃色蟲卵外型 ( 0.8 mm ) b. 癒傷組織於誘導第三天即轉呈淺綠色 ( 0.8 mm ) c. 癒傷組織誘導過程中，組織顏色加深 ( 10 mm ) d. 誘導後期，癒傷組織轉成類原球體 ( 15 mm )
a b
c d
圖 2-4. 霍山石斛多倍體之誘導之過程 （bar）
a. 類原球體莖秋水仙素處理後，部分組織呈現白化情形 ( 0.8 mm ) b. 存活下來之類原球體，繼續分化成芽體 ( 0.8 mm )
c. 芽體至試管移出後，在瓶內分化形成叢生芽 ( 15 mm ) d. 將叢生芽分株繼代，以促進其生長 ( 15 mm )
a b
c d
圖 2-5. 霍山石斛發根試驗之過程及其生長情形
a. 植株經 IBA 或 NAA 處理後，根部被誘導生長 ( 10 mm ) b. 控制組之植株雖有分芽生長，但無根部之發育 ( 10 mm )
c. 經四個月的誘導，根部發育明顯改善，且觀察到有試管內提前開花之 情形 ( 15 mm )
d. 在 5 mg/l NAA 處理組中，可能因濃度過高，而導致植株褐化死亡 ( 8 mm )
a b
c d
第三章、霍山石斛試管內提前開花之研究
3.1 前人研究及試驗目的
在試管內開花之研究當中，以蘭科植物被研究得最多。近年來，其他植 物 也 陸 續 被 用 來 研 究 ， 如 ： 抗 腫 瘤 之 藥 用 植 物 藥 睡 茄 （
W i t h a n i a somnifera Dunal
）（Saritha and Naidu,2007）、莧科觀賞植物鳳尾球（Celosia argentea var. plumose）（Bodhipadma et al., 2011）等。然而，影響試管內開花的因子除了前面所描述的蔗糖、吉貝素外，另外包括有：含胺物質（精 胺--spermidine、腐胺--putrescine）及被討論甚多的細胞分裂素(Bernier et al.
1993；Bonhomme et al. 2000；Corbesier and Coupland 2006)。因此，從這些 研究中得知，細胞分裂素扮演著極為重要之角色。因此，陸續的試驗即以
在蘭花的試管內開花方面，已經被報導的包括 Cymbidium（Kostenyuk et al., 1999；Chang and Chang, 2003）、Doriella（Duan and Yazawa, 1994）、
石斛蘭（Wang et al., 1997；Hee et al., 2007；Sim et al., 2007, 2008；Tee et al.,
2008；Wang, et al., 2009）、文心蘭（Kerbauy 1984）、蝴蝶蘭（Duan and Yazawa, 1995）及其他蘭花（Chia et al., 1999；Oh and Kostenyuk, 2001）。早期試管 內提前開花之研究，即以添加不同比例之細胞分裂素或再添加植物生長素 處理，以誘導其開花。但其中最值得注意的是，近幾年的研究當中，連續 三篇論文發表在 Plant Cell Reports，其完整地建立了石斛蘭實生苗於試管 內，提早開花及生產種子的系統。其中一個試驗（Sim et al., 2007）乃利用 析（radioimmunoassay）定量其濃度（Sim et al., 2008）。試驗結果顯示，
2008；Wang, et al., 2009）、文心蘭（Kerbauy 1984）、蝴蝶蘭（Duan and Yazawa, 1995）及其他蘭花（Chia et al., 1999；Oh and Kostenyuk, 2001）。早期試管 內提前開花之研究，即以添加不同比例之細胞分裂素或再添加植物生長素 處理，以誘導其開花。但其中最值得注意的是，近幾年的研究當中，連續 三篇論文發表在 Plant Cell Reports，其完整地建立了石斛蘭實生苗於試管 內，提早開花及生產種子的系統。其中一個試驗（Sim et al., 2007）乃利用 析（radioimmunoassay）定量其濃度（Sim et al., 2008）。試驗結果顯示，