設計 TOC33 上游調控序列專一引子(表一)，以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)放大不同長度 TOC33 啟動子刪除片段，利用 DNA 重組的方式，透過限 制酵素(Bam HI/ Hínd III)將序列接合至含有冷光報導基因(luciferase, LUC2)的質體(圖 一)，並以大腸桿菌選殖、定序及限制酵素處理等方法確定 TOC33 上游調控序列片段 的長度及正確性。
2. 轉殖植物葉片樣品準備 菜鑲嵌病毒 35S 啟動子驅動β-葡萄糖甘酸酶(β-glucuronidase, GUS)報導基因的質體，
並加入 12.5 µl 2.5M CaCl2及 5 µl 0.1M spermidine 混合均勻，以 1000 rpm 離心，去除 上清液。再以 200 µl 絕對酒精(99% EtOH)清洗 2 次，去除上清液，加入適量的絕對酒 精混和均勻。取 2.5 µl 金粉液滴於巨攜圓盤(macrocarriers)上，以基因槍(Biolistic PDS-1000, He Particle Delivery System, Bio-Rad)於真空高壓下轟擊入製備好的阿拉伯 芥葉片。轟擊完的阿拉伯芥葉片，放置於日夜恆溫 22 °C 生長箱培養 16 小時(光週期 設定為 4 小時光、8 小時暗、4 小時光)，待轉入的質體反應後，再進行報導基因活性 的分析。每組實驗均處理三次重複。
4. 報導基因活性分析
將轉殖植物以液態氮冷凍後，利用研缽將組織磨碎成粉狀，隨即將粉末加入適量 1X Reporter Lysis Buffer (Promega)，震盪混和均勻。於 4 °C 離心後取上清液，置於冰 上以維持活性。
(1) 測量總蛋白質(Total protein)濃度
取適量樣本萃取液於透明 96 孔微量盤中，加入 1X Protein Assay Buffer (Bio-Rad) 反應，參照廠商建議，以分光光度計(Multiskan GO microplate spectrophotometer, Thermo Scientific) 測量在波長 595 nm 的吸光值。同時以不同濃度的 BSA 作為標準曲 線(Standard Curve)，來推算總蛋白質的濃度。
(2) LUC 活性定量
取適量樣本萃取液於白色 96 孔微量盤中，加入 100 µl Luciferase Assay Reagent (Promega)，利用冷光儀(SpectraMax L luminescence microplate reader, Molecular Devices) 以波長為 450 nm 的光激發偵測 LUC 的活性。
(3) GUS 活性定量(Jefferson et al., 1987)
取適量樣本萃取液於黑色 96 孔微量盤中，加入 50 µl 1mM 4-MUG
(4-methylumbellyferyl β-D-glucuronide)溶液(溶於 1X Reporter Lysis Buffer)，參照廠商 建議反應程序後，利用螢光儀(SpectraMax GEMINI XPS fluorescence microplate reader, Molecular Devices)偵測樣本在波長 455 nm 的吸光值。同時以不同濃度的 4-MU (4-methyl umbelliferone)製作標準曲線(Standard curve)，來推算 GUS 的濃度。
(4) LUC 對 GUS 相對活性計算
分析不同 TOC33 上游調控序列影響阿拉伯芥葉片中報導基因 LUC 對 GUS 活性的 比值，判斷各長度的序列片段影響報導基因比值的表現程度，找出在 TOC33 啟動子 序列上，可能影響基因表現的關鍵序列。
三、 基因序列分析
以 TOC33 啟動子上，基因表現程度有影響的關鍵序列片段，透過 PLACE、AGRIS 網站做序列比對，比較是否有已知的順式作用元素及蛋白結合位。
四、 光照處理及基因表現量分析 1. 光線環境因子處理
取消毒並春化完成的野生型(Col.)、雙基因突變(cia2/cil)種子，種植於 1X MS 培 養基中，培養於 22 °C、12 小時光照、12 小時黑暗的生長箱中。待植物生長至 13 天 時，每 4 小時將植物以液態氮冷凍收集，作為實驗前對照組，共收集 6 個時間點。待 植物生長至 14 天時，將植物移至連續白光與紅光光照的生長箱中做光照處理，每 4 小時將植物以冷凍液態氮收集，保存於-80 °C 中，一共收集三天 19 個時間點。
2. RNA 萃取(Chomczynski and Sacchi, 1987)
利用 TRIzol 試劑(Invitrogen)抽取不同光照處理阿拉伯芥的 total RNA。將適量的 植物組織以液態氮冷凍，並以已預冷的研缽將組織磨成粉狀，加入含有 3ml TRIzol 試劑的 15 mL 離心管中混勻，於室溫下處理 5 分鐘。接著加入 1 ml 氯仿(chloroform, CHCl3)，混和均勻於室溫下反應 5 分鐘，以分離出蛋白質。之後以 4000 rpm，4 °C 離 心 30 分鐘(Eppendorf 5804R centrifuge)，再將上清液加入含有 2 ml 異丙醇(isopropanol)
的 15 mL 離心管中，於室溫下靜置 10 分鐘，使 RNA 沉澱。再以 4000rpm，4 °C 離心 20 分鐘。去除上清液後，加入 3 ml 75%酒精以洗去雜質，以 4000rpm，4 °C 離心 15 分鐘，去除上清液。靜置於室溫乾燥後，加入適當 DEPC(diethyl pyrocarbonate)水回溶 RNA，測量 RNA 濃度並於-80 °C 儲存備用。
3. 即時定量反轉錄 PCR (real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR) 針對目標基因 TOC33、CIA2、CIL 設計專一性引子(表一)，取 5 µg total RNA 利 用反轉錄酶(M-MLV reverse transcriptase, Promega)反轉錄成 cDNA (complementary DNA)。以 cDNA 作為模板，TOC33、CIA2、CIL、TOC34、UBQ10、CCA1、TOC1、
CAB3 專一性引子及 2X SYBE FAST qPCR kit 的試劑(KAPA Biosystems)進行實驗，
PCR 條件設定為 95 °C 3 分鐘，之後 95 °C 3 秒、60 °C 30 秒為一個循環，進行 40 個 循環(StepOne Plus thermal cycler, Applied Biosystems)，並分析其結果。
4. cDNA 絕對定量(absolute quantification)
先以 cDNA 作為模板，使用專一性引子 UBQ10-F1 與 UBQ10-R1 進行 PCR，複製 出 UBQ10 序列的部分片段。之後將此 252-bps 的 UBQ10 片段黏接至載體 pGEM-T (Promega)，建構質體 pGUB10-1，作為基因絕對定量的參考序列。將 10 倍濃度差異(0.1 pg/µl 到 10 ng/µl 等 6 種不同濃度)的 pGUB10-1 做為模板，以 qRT-PCR 的方式測出不 同濃度質體的 CT值。再以 log(ng/µl)作為 X 軸，CT值為 Y 軸劃出標準曲線，計算出 趨勢線公式為 Y=-3.439X+14.353，R2值為 0.9994。數據分析先算出各基因 CT值扣除
UBQ10 C
T值(ΔCT)，並透過趨勢線公式將ΔCT換算成濃度，再換算出不同基因所含莫 耳數，作為各基因表現的絕對定量數值。結果
TOC33 啟動子序列對報導基因的影響
以專一性引子(表一)透過聚合酶連鎖反應將目標序列放大，得到每段相差約 100 bps 的啟動子序列。再以限制酶及接合酶將目標序列轉殖至帶有報導基因 LUC2 的質體上，建 構出 10 個含有不同長度啟動子序列的報導基因質體，分別命名為 pKT3301~pKT3310 (圖 一)，啟動子序列長度從 1189 bps 到 320 bps。
透過基因槍把帶有不同長度啟動子刪除基因片段的報導基因質體，於真空高壓下轟擊 入阿拉伯芥葉片，經由 4 小時光照、8 小時黑暗、4 小時光照培養 16 小時後，分析
pKT3301~pKT3310 質體中，由 TOC33 啟動子序列所驅動的報導基因表現量。結果發現 pKT3301~pKT3303 的表現量沒有顯著差異，但 pKT3303 的表現量為 pKT3304 的 2.8 倍(圖 二)，pKT3305 的表現量為 pKT3304 的 3 倍，pKT3305~pKT3306 的表現量沒有顯著差異，
但 pKT3307 的表現量為 pKT3306 的 2.5 倍，pKT3307~pKT3310 的表現量沒有顯著差異。
因此，缺少 pKT3303~pKT3304 的-810 到-710 之間 100 bps 啟動子序列，會使基因表現量 下降，而缺少 pKT3304~pKT3305 的-710 到-616 之間 94 bps 以及缺少 pKT3306~pKT3307 的-517 到-411 之間 106 bps 的啟動子序列，會使基因表現量上升，表示這三段啟動子序列 可能是調節 TOC33 基因表現的關鍵序列。
TOC33 關鍵啟動子序列基因分析
根據啟動子序列刪除分析報導基因的表現量得知，TOC33 啟動子序列上-810 到-710、
-710 到-616 及-517 到-411 之間可能為調節 TOC33 基因表現的關鍵序列。將 TOC33 啟動子 序列-810 到-710 間的 100 bps 命名為 CAE1 (cis-acting element 1)，-710 到-616 間的 94 bps 命名為 CAE2，-517 到-411 間的 106 bps 命名為 CAE3。以生物資訊網站 PLACE 及 AGRIS 分析及比對三段 CAE 序列，比較是否含有已知的順式作用元素或蛋白結合位。
從 PLACE 網站比對分析 CAE1~CAE3 序列，發現 CAE1 可能存在六種順式作用元素或 蛋白結合位(附錄一)，其中 CAAT box (Shirsat et al., 1989; Kusnetsov et al., 1999)、CCA1 binding site (Wang et al., 1997)、T-box (Chan et al., 2001)可能與光調節有關。CAE2 可能存
在十三種順式作用元素或蛋白結合位(附錄二)，其中 E-box (Hartmann et al., 2005)及 MYC 辨識位(Agarwal et al., 2006)可能與光調節有關，MYB 辨識位(Abe et al., 2003)則與植物脫 水機制有關。CEA3 可能存在十三種順式作用元素或蛋白結合位(附錄三)，其中-10 promoter element (Thum et al., 2001)、E-box (Hartmann et al., 2005)及 MYC 辨識位(Agarwal et al., 2006) 可能與光調節有關，MYB 辨識位(Abe et al., 2003)則與植物脫水機制有關。
針對在 AGRIS 上的比對結果也顯示，TOC33 在轉錄起始點前-110 到-105 帶有序列 AACTAAC，可能是 MYB4 鍵結的 motif (Chen et al., 2002)，會被 MYB 家族蛋白結合的特 定序列。以及轉錄起始點前-19 到-14 帶有序列可能具有 GATAAG，可能是 I box 啟動子上 的 motif (Rose et al., 1999)。
紅光對於 TOC33、CIA2、CIL 基因表現韻律的影響
光線對於植物生長發育及概日韻律扮演重要的角色，而紅光、遠紅光及藍光對於植物 的影響更為重要。先前研究發現 CIA2 是一個受光調節的蛋白質，從 DIURNAL database (Mockler et al., 2007)上發現 TOC33、CIA2 及 CIL 在 12 小時光照 12 小時黑暗底下皆具有 規律性的表現(附錄四及五)。為了瞭解調節 TOC33、CIA2 及 CIL 規律性表現的原因，實驗 以 14 天大的阿拉伯芥植株分別處理白光及紅光，來探討光質是否會影響這三個基因的規 律性表現。結果先將 CCA1、TOC1 及 CAB3 在所有植物組織的表現模式先做檢測，並與 DIURNAL database 上的基因表現模式做比較(附錄六及七)，確定了光處理的準確性後，再 分析 TOC33、CIA2 及 CIL 三個基因的絕對表現量，並以 TOC34 作為負向控制組。在維持 白光照射 12 小時光照 12 小時黑暗，四個基因表現皆具有規律性，其中 TOC33 會在進入 黑暗後 4 到 8 小時會達到最高峰(圖三 A)；CIA2 的規律性較為不明顯，但若比較 DIURNAL 的實驗結果，發現 CIA2 會在一天當中達到兩次高峰，分別是進入光照後 8 小時以及進入 黑暗後 8 小時(圖三 B 及附錄五)；CIL 會在進入黑暗後 8 小時達到高峰(圖三 C)；TOC34 會在進入光照後 12 小時達到最高峰(圖三 D)。當進行 12 小時紅光照射 12 小時黑暗的實驗 處理之後，四個基因仍然存在相似的規律性，而且基因的表現量與白光照射下相同，其中
CIL 照射紅光之後，達到高峰的時間會提前 4 個小時(圖三 C)。在連續光照下，四個基因
照射紅光與白光的結果相似(圖四)。但 TOC33 的基因表現在連續光照下，達到高峰的時間會比維持 12 小時光照 12 小時黑暗提前 4 個小時，韻律性不變(圖三 A 及四 A)。因此，基 因的規律性與基因的表現量在紅光處理下可以維持與白光照射下相似的結果。
野生型及 cia2/cil 突變植物中 TOC33、CIA2、CIL 基因表現韻律的影響
為了進一步了解 CIA2 與 CIL 蛋白是否會調節 TOC33 規律性的表現，實驗以 14 天大 的野生型及 cia2/cil 雙基因突變植株來觀察維持白光照射 12 小時光照 12 小時黑暗下與連 續 24 小時光照的結果。此實驗亦先檢測 CCA1、TOC1 及 CAB3 在所有植物組織的表現模 式，並與 DIURNAL database 上的基因表現模式做比較(附錄六及八)後，再分析 TOC33、
CIA2 及 CIL 三個基因的絕對表現量。結果發現 TOC33、CIL 及 TOC34 基因的規律性與前
述實驗相同(圖五 A、C 及 D)，但 CIA2 在缺少 CIA2 與 CIL 蛋白的植株下，達到高峰的次 數會由兩次變成一次，只剩下進入光照後 8 小時表現量較高的高峰(圖五 B)。比較基因的 絕對表現量，TOC33 與 CIL 在缺少 CIA2 與 CIL 蛋白的植株中，基因的表現量皆會下降為 原表現量的 50%左右(圖五 A 及 C)；但是 CIA2 達到高峰的表現量會比 Col.來的多(圖五 B)。
作為負向控制組的 TOC34，基因的規律性與絕對表現量在 Col.與 cia2/cil 雙基因突變株中 沒有差異(圖五 D)。在連續光照下，TOC33 與 CIL 在基因表現量的結果與維持光週期 12 小時光照 12 小時黑暗的結果相同，但表現量達到高峰的時間會提前 4 個小時(圖五 A、C 及圖六 A、C)；CIA2 與 TOC34 在基因規律性與基因表現量的結果皆與維持光週期 12 小時 光照 12 小時黑暗相似(圖五 B、D 及圖六 B、D)。因此，CIA2/CIL 蛋白會調控 TOC33 及
CIL 基因表現量，維持 CIA2 基因在一天當中達到兩次高峰，但不會影響 TOC34 基因規律
性及基因表現量。討論
由啟動子序列刪除搭配報導基因的實驗，發現位在 TOC33 上游調控序列不只有單一 個序列，可能有多種調控方式，分別在 TOC33 啟動子序列上-710 ~ -810、-710 ~ -616 以及 -517 ~ -411 之間，所驅動的報導基因表現量會有明顯的差異，分別命名為 CAE1、CAE2 以 及 CAE3。CAE1~3 三段各約有 100 bps 的調控序列，CAE1 為正向的調控序列，而 CAE2
由啟動子序列刪除搭配報導基因的實驗，發現位在 TOC33 上游調控序列不只有單一 個序列，可能有多種調控方式，分別在 TOC33 啟動子序列上-710 ~ -810、-710 ~ -616 以及 -517 ~ -411 之間，所驅動的報導基因表現量會有明顯的差異，分別命名為 CAE1、CAE2 以 及 CAE3。CAE1~3 三段各約有 100 bps 的調控序列，CAE1 為正向的調控序列，而 CAE2