cDNA 絕對定量

先以 cDNA 作為模板，使用專一性引子 UBQ10-F1 與 UBQ10-R1 進行 PCR，複製 出 UBQ10 序列的部分片段。之後將此 252-bps 的 UBQ10 片段黏接至載體 pGEM-T (Promega)，建構質體 pGUB10-1，作為基因絕對定量的參考序列。將 10 倍濃度差異(0.1 pg/µl 到 10 ng/µl 等 6 種不同濃度)的 pGUB10-1 做為模板，以 qRT-PCR 的方式測出不 同濃度質體的 CT值。再以 log(ng/µl)作為 X 軸，CT值為 Y 軸劃出標準曲線，計算出 趨勢線公式為 Y=-3.439X+14.353，R²值為 0.9994。數據分析先算出各基因 CT值扣除

UBQ10 C

結果

TOC33 啟動子序列對報導基因的影響

以專一性引子(表一)透過聚合酶連鎖反應將目標序列放大，得到每段相差約 100 bps 的啟動子序列。再以限制酶及接合酶將目標序列轉殖至帶有報導基因 LUC2 的質體上，建 構出 10 個含有不同長度啟動子序列的報導基因質體，分別命名為 pKT3301~pKT3310 (圖 一)，啟動子序列長度從 1189 bps 到 320 bps。

透過基因槍把帶有不同長度啟動子刪除基因片段的報導基因質體，於真空高壓下轟擊 入阿拉伯芥葉片，經由 4 小時光照、8 小時黑暗、4 小時光照培養 16 小時後，分析

pKT3301~pKT3310 質體中，由 TOC33 啟動子序列所驅動的報導基因表現量。結果發現 pKT3301~pKT3303 的表現量沒有顯著差異，但 pKT3303 的表現量為 pKT3304 的 2.8 倍(圖 二)，pKT3305 的表現量為 pKT3304 的 3 倍，pKT3305~pKT3306 的表現量沒有顯著差異，

但 pKT3307 的表現量為 pKT3306 的 2.5 倍，pKT3307~pKT3310 的表現量沒有顯著差異。

因此，缺少 pKT3303~pKT3304 的-810 到-710 之間 100 bps 啟動子序列，會使基因表現量 下降，而缺少 pKT3304~pKT3305 的-710 到-616 之間 94 bps 以及缺少 pKT3306~pKT3307 的-517 到-411 之間 106 bps 的啟動子序列，會使基因表現量上升，表示這三段啟動子序列 可能是調節 TOC33 基因表現的關鍵序列。

TOC33 關鍵啟動子序列基因分析

根據啟動子序列刪除分析報導基因的表現量得知，TOC33 啟動子序列上-810 到-710、

-710 到-616 及-517 到-411 之間可能為調節 TOC33 基因表現的關鍵序列。將 TOC33 啟動子 序列-810 到-710 間的 100 bps 命名為 CAE1 (cis-acting element 1)，-710 到-616 間的 94 bps 命名為 CAE2，-517 到-411 間的 106 bps 命名為 CAE3。以生物資訊網站 PLACE 及 AGRIS 分析及比對三段 CAE 序列，比較是否含有已知的順式作用元素或蛋白結合位。

從 PLACE 網站比對分析 CAE1~CAE3 序列，發現 CAE1 可能存在六種順式作用元素或 蛋白結合位(附錄一)，其中 CAAT box (Shirsat et al., 1989; Kusnetsov et al., 1999)、CCA1 binding site (Wang et al., 1997)、T-box (Chan et al., 2001)可能與光調節有關。CAE2 可能存

在十三種順式作用元素或蛋白結合位(附錄二)，其中 E-box (Hartmann et al., 2005)及 MYC 辨識位(Agarwal et al., 2006)可能與光調節有關，MYB 辨識位(Abe et al., 2003)則與植物脫 水機制有關。CEA3 可能存在十三種順式作用元素或蛋白結合位(附錄三)，其中-10 promoter element (Thum et al., 2001)、E-box (Hartmann et al., 2005)及 MYC 辨識位(Agarwal et al., 2006) 可能與光調節有關，MYB 辨識位(Abe et al., 2003)則與植物脫水機制有關。

針對在 AGRIS 上的比對結果也顯示，TOC33 在轉錄起始點前-110 到-105 帶有序列 AACTAAC，可能是 MYB4 鍵結的 motif (Chen et al., 2002)，會被 MYB 家族蛋白結合的特 定序列。以及轉錄起始點前-19 到-14 帶有序列可能具有 GATAAG，可能是 I box 啟動子上 的 motif (Rose et al., 1999)。

紅光對於 TOC33、CIA2、CIL 基因表現韻律的影響

光線對於植物生長發育及概日韻律扮演重要的角色，而紅光、遠紅光及藍光對於植物 的影響更為重要。先前研究發現 CIA2 是一個受光調節的蛋白質，從 DIURNAL database (Mockler et al., 2007)上發現 TOC33、CIA2 及 CIL 在 12 小時光照 12 小時黑暗底下皆具有 規律性的表現(附錄四及五)。為了瞭解調節 TOC33、CIA2 及 CIL 規律性表現的原因，實驗 以 14 天大的阿拉伯芥植株分別處理白光及紅光，來探討光質是否會影響這三個基因的規 律性表現。結果先將 CCA1、TOC1 及 CAB3 在所有植物組織的表現模式先做檢測，並與 DIURNAL database 上的基因表現模式做比較(附錄六及七)，確定了光處理的準確性後，再 分析 TOC33、CIA2 及 CIL 三個基因的絕對表現量，並以 TOC34 作為負向控制組。在維持 白光照射 12 小時光照 12 小時黑暗，四個基因表現皆具有規律性，其中 TOC33 會在進入 黑暗後 4 到 8 小時會達到最高峰(圖三 A)；CIA2 的規律性較為不明顯，但若比較 DIURNAL 的實驗結果，發現 CIA2 會在一天當中達到兩次高峰，分別是進入光照後 8 小時以及進入 黑暗後 8 小時(圖三 B 及附錄五)；CIL 會在進入黑暗後 8 小時達到高峰(圖三 C)；TOC34 會在進入光照後 12 小時達到最高峰(圖三 D)。當進行 12 小時紅光照射 12 小時黑暗的實驗 處理之後，四個基因仍然存在相似的規律性，而且基因的表現量與白光照射下相同，其中

CIL 照射紅光之後，達到高峰的時間會提前 4 個小時(圖三 C)。在連續光照下，四個基因

會比維持 12 小時光照 12 小時黑暗提前 4 個小時，韻律性不變(圖三 A 及四 A)。因此，基 因的規律性與基因的表現量在紅光處理下可以維持與白光照射下相似的結果。

野生型及 cia2/cil 突變植物中 TOC33、CIA2、CIL 基因表現韻律的影響

為了進一步了解 CIA2 與 CIL 蛋白是否會調節 TOC33 規律性的表現，實驗以 14 天大 的野生型及 cia2/cil 雙基因突變植株來觀察維持白光照射 12 小時光照 12 小時黑暗下與連 續 24 小時光照的結果。此實驗亦先檢測 CCA1、TOC1 及 CAB3 在所有植物組織的表現模 式，並與 DIURNAL database 上的基因表現模式做比較(附錄六及八)後，再分析 TOC33、

CIA2 及 CIL 三個基因的絕對表現量。結果發現 TOC33、CIL 及 TOC34 基因的規律性與前

述實驗相同(圖五 A、C 及 D)，但 CIA2 在缺少 CIA2 與 CIL 蛋白的植株下，達到高峰的次 數會由兩次變成一次，只剩下進入光照後 8 小時表現量較高的高峰(圖五 B)。比較基因的 絕對表現量，TOC33 與 CIL 在缺少 CIA2 與 CIL 蛋白的植株中，基因的表現量皆會下降為 原表現量的 50%左右(圖五 A 及 C)；但是 CIA2 達到高峰的表現量會比 Col.來的多(圖五 B)。

作為負向控制組的 TOC34，基因的規律性與絕對表現量在 Col.與 cia2/cil 雙基因突變株中 沒有差異(圖五 D)。在連續光照下，TOC33 與 CIL 在基因表現量的結果與維持光週期 12 小時光照 12 小時黑暗的結果相同，但表現量達到高峰的時間會提前 4 個小時(圖五 A、C 及圖六 A、C)；CIA2 與 TOC34 在基因規律性與基因表現量的結果皆與維持光週期 12 小時 光照 12 小時黑暗相似(圖五 B、D 及圖六 B、D)。因此，CIA2/CIL 蛋白會調控 TOC33 及

CIL 基因表現量，維持 CIA2 基因在一天當中達到兩次高峰，但不會影響 TOC34 基因規律

討論

由啟動子序列刪除搭配報導基因的實驗，發現位在 TOC33 上游調控序列不只有單一 個序列，可能有多種調控方式，分別在 TOC33 啟動子序列上-710 ~ -810、-710 ~ -616 以及 -517 ~ -411 之間，所驅動的報導基因表現量會有明顯的差異，分別命名為 CAE1、CAE2 以 及 CAE3。CAE1~3 三段各約有 100 bps 的調控序列，CAE1 為正向的調控序列，而 CAE2 以及 CAE3 為負向調控序列。以 PLACE 及 AGRIS 共同分析比對，發現這三段序列皆可能 存在與光調節有關的 motif，而負向調控序列的 CAE2 及 CAE3 共同存在 E-box、MYB 辨 識位及 MYC 辨識位，由 AGRIS 分析也找到 MYB 家族的辨識位。MYB 是可以調節植物 脫水反應(dehydration-responsive)基因 rd22(Abe et al., 2003)，MYC 辨識位也會同時與 E-box 合作，參與光對植物基因表現的調節(Hartmann et al., 2005)。此外，當植物處在低溫的環 境下，MYC 辨識位會被 bHLH (basic helix-loop-helix)類的轉錄因子 ICE1 (inducer of CBF expression 1)所辨識及鍵結(Agarwal et al., 2006)。因此，TOC33 上游負向的調控序列，可 能會受到光、乾旱或低溫的調節。

我們之前對於 CIA2 及 CIL 啟動子序列的分析(Chang, 2012)，加上本研究對於 TOC33 啟動子的分析，推測這三個基因確實有可能會受光調節。從 DIRUNAL database (Mockler et

al., 2007)上觀察 TOC33、CIA2、CIL 及 TOC34，在 Col.植株以 12 小時光照 12 小時黑暗的

光週期下，表現會具有規律性(附錄五)，而植物受光調節主要會受到紅光、遠紅光及藍光 的影響。我們進一步分析紅光是否影響 TOC33 具有規律性的表現，結果發現在 12 小時光 照 12 小時黑暗或連續 24 小時光照下，四個基因的規律性與絕對表現量，在紅光下可以維 持與白光相似的結果，推測紅光存在就可以維持植物在白光下的基因的概日韻律性。而藍 光與遠紅光是否會影響植物基因的規律性表現，需要進一步再做驗證。在已知的研究中，

植物的光受體(photoreceptor)光敏素(phytochrome)會吸收紅光，之後轉換成具有活性的光敏 素(Pfr)；經由遠紅光照射後，會再變回沒有活性的光敏素(Pr)。根據實驗結果，推測具有 活性的光敏素存在就可以維持植物基因的概日韻律性。此外，我們也發現缺乏 CIA2 與 CIL 蛋白的植株中，TOC33 的規律性不變，但是基因表現量下降了，這與先前的研究所指出 CIA2 會調節 TOC33 基因表現的結果相同(Sun et al., 2001；Sun et al., 2009)。因此 CIA2 的

存在與否不會影響 TOC33 基因的規律性，但會影響其基因的表現量。實驗結果也比較 CIA2 與 CIL 的基因表現，發現在 cia2/cil 突變株中，CIA2 表現量達高峰的時間會由兩次變成一 次，基因的表現量會比 Col.多；而 CIL 基因表現量會下降(圖五 B 及 C)。先前的研究指出，

CIA2 缺乏的情況下，CIL 的轉錄量會上升(Sun et al., 2001)，表示 CIL 可以彌補 CIA2 部分 的功能。因此 CIA2 及 CIL 可能存在不同的回饋的機制，在同時缺乏 CIA2 與 CIL 蛋白時，

會促進 CIA2 基因在光照下達高峰的表現量，抑制 CIL 基因表現量。TOC34 的基因表現在

cia2/cil 突變植株中，基因的規律性及表現量都不會受到影響，也可以證實作為負向控制組

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