阿拉伯芥TOC33基因表現的調節機制研究

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(1)國立台灣師範大學生命科學系碩士論文. 阿拉伯芥 TOC33 基因表現的調節機制研究 Regulatory mechanism of TOC33 expression in Arabidopsis. 研究生：陳冠廷 Kuan-Ting Chen 指導教授：孫智雯博士 Dr. Chih-Wen Sun 中華民國 103 年七月.

(2) 致謝能完成這篇論文，首先最感謝的是孫智雯老師，在兩年不長也不短的碩士生涯中，老師在科學上的研究以及方向有最正確的教導，實在感激不盡。感謝涂世隆老師及蘇銘燦老師在論文以及口試上的指導，給予我極為寶貴的建議，並提點我仍舊不足的地方，謝謝老師們。. 我也要感謝所有曾經陪伴過我的 D207 成員們，感謝大楊學長及心嚴學姊在實驗的教導以及協助，我才有辦法完成每個實驗；感謝玉山學長及 Tiffany 學姊，總是像個榜樣來鼓勵我；感謝阿丹學姊及小耿學長，給予我許許多多讀碩士班時寶貴的建議以及鼓勵；感謝弘安、德釗學弟及詩云、嘉雯學妹，謝謝你們帶給我歡樂的陪伴。. 我還要感謝所有與我一同讀碩士的碩士班同學們，因為有你們的陪伴，使我碩士生涯增添了不一樣的色彩。感謝豐碩學長，總是傾聽我在實驗室所遇見的困難；感謝程堯、佳鼎、佳瞜、昊亮、淑玲、威延，除了聽我報告我的實驗之外，也常常陪同我一同用餐；感謝雅婷、映伶學姊，在大家都很忙碌的時候願意花時間聽我報告，謝謝你們大家。另外，我也要感謝碩哥、忠翰助教，除了陪我聊聊天之外，你們也是少數在植物領域上，可以與我分享經驗的長輩(雖然領域不同)，謝謝你們給予我不同的碩士班生涯。. 最後，我也要感謝我親愛的家人們，給予我自由的時間及照顧，使我在能夠專注在課業及研究上。將這份喜悅與大家分享!. 陳冠廷謹誌於國立臺灣師範大學生命科學系中華民國一○三年七月.

(3) 目錄中文摘要…………………………………………………………………...……………..……...II 英文摘要…………………………………………………………...….……………………..….III 緒論………………………………………………………………...………………………..…....1 研究材料與方法………………………………………………...……………………………..…3 一、植物材料……………..……………………………………………………………...……3 二、植物暫時性基因轉殖分析…………………………..…………………………..……….3 1. 報導基因質體的製備………………………………………………………………...…..3 2. 轉殖植物葉片樣品準備………………………………………………………………... .4 3. 質體殖入阿拉伯芥葉片……………………………………………………...………... ..4 4. 報導基因活性分析………………………………………………….…………….……. .4 三、基因序列分析…………………..………………………………………………………...5 四、光照處理及基因表現量分析……………………..…………………………………..….5 1. 光線環境因子處理……………………………………………………………………... .5 2. RNA 萃取………………………………………………………………………………. ..6 3. 即時定量反轉錄 PCR………………………………………………………………….. ..6 4. cDNA 絕對定量…………………………………………………………………..……. ..6 結果………………………………………………………...………........................ ...... .............7 討論……………………………………………………………...……........................................10 參考文獻…………………………………………………………………...................................12 表格與圖片……………………………………………………………………...........................15 表一專一引子對序列資料………………………………………………………………...15 圖一建構 TOC33 啟動子序列刪減之質體示意圖………………………………………..16 圖二比較不同 TOC33 基因啟動子片段驅動報導基因之相對活性……………………..17 圖三週期性光處理對於基因規律性表現與表現量的影響……………………...………18 圖四連續性光處理對於基因規律性表現與表現量的影響…………………...………....19 I.

(4) 圖五比較 Col.及 cia2/cil 突變植株在週期性白光處理下之基因表現規律性與表現量..20 圖六比較 Col.及 cia2/cil 突變植株在連續性白光處理下之基因表現規律性與表現量..21 附錄………………………………………………………………………………………....…...22 附錄一以 PALCE 資料庫分析 CAE1 之調控序列………………………………………..22 附錄二以 PALCE 資料庫分析 CAE2 之調控序列………………………………………..23 附錄三以 PALCE 資料庫分析 CAE3 之調控序列………………………………………..25 附錄四 DIURNAL 資料庫不同實驗條件狀況(12L/12D)之列表…….………….….........27 附錄五以 DIURNAL 資料庫分析 TOC33/CIA2/CIL/TOC34 基因表現模式…………….28 附錄六以 DIURNAL 資料庫分析 CCA1/TOC1/CAB3 基因表現模式………….…….....32 附錄七週期性與連續性光照下 CCA1/TOC1/CAB3 的基因絕對表現量………………...36 附錄八比較 Col.及 cia2/cil 突變植株中 CCA1/TOC1/CAB3 的基因絕對表現量……….37. II.

(5) 摘要植物葉綠體蛋白質主要是由細胞核中的基因轉錄轉譯後，透過轉運蛋白機組(TOC/TIC complex)送至葉綠體內。TOC 蛋白位在葉綠體外膜上，負責辨識及運送蛋白質。在阿拉伯芥的研究中，TOC33 及 TOC34 是同源蛋白，但 TOC33 負責辨識及協助光合作用相關蛋白的運輸；TOC34 則參與辨識及運送一些維持葉綠體基本功能的蛋白。根據我們之前的基因微陣列及生化實驗結果，發現 CIA2 (是一個細胞核內的轉錄因子)會調節 TOC33 基因表現但不會影響 TOC34 基因表現。而 CIL 是一個在阿拉伯芥中與 CIA2 胺基酸有 65%相同的同源蛋白。為了瞭解表現 TOC33 基因的調節機制，啟動子刪除及植物暫時性基因轉殖實驗先用來分析 TOC33 啟動子上的轉錄關鍵序列，分析報導基因表現的結果發現 TOC33 轉錄起始位點前-810 至-710 及-710 至-411 之間分別可能會促進及抑制基因的表現量。接著透過生物資訊網站 PLACE 及 AGRIS 來分析比對這些關鍵序列是否有已知的順式作用元素及蛋白結合位，預測結果顯示 TOC33 啟動子序列上存在許多可能的順式作用元素，其中 TOC33 關鍵序列會受到光線或缺水等環境因子調節。此外，根據 DIURNAL 基因資料庫及反轉錄聚合酶連鎖反應實驗結果，發現 TOC33、CIA2 及 CIL 在白光下具有規律性的表現。因此，我們也利用不同光源處理野生型及突變株植物，並以 qRT-PCR 來分析 TOC33 基因的表現規律性或表現量是否會直接或間接受到 CIA2 及 CIL 調節。結果顯示 CIA2 及 CIL 不會調節 TOC33 基因的表現規律性，但會增加 TOC33 基因的表現量。此外，TOC33 基因在單獨紅光處理與白光處理下呈現相同的表現量，暗示光受體光敏素亦參與調節 TOC33 基因的表現。. 關鍵字：TOC33、TOC34、CIA2、CIL、植物暫時性基因轉殖、qRT-PCR. III.

(6) Abstract Most of chloroplastic proteins are encoded by nuclear genome and then imported into chloroplast by TOC/TIC complex. TOC proteins, located at outer membrane of chloroplast, are responsive for recognizing and importing chloroplastic proteins. In Arabidopsis, TOC33 and TOC34 are homologous proteins. Nevertheless, they are involved in transporting photosynthetic proteins and housekeeping proteins, respectively. According to our previous microarray and biochemical analyses, chloroplast import apparatus 2 (CIA2, a nuclear transcription factor) can regulate the expression yield of TOC33 but not TOC34. Besides, CIA2-like (CIL) is a homologous protein of CIA2 in Arabidopsis which shares 65% identity. To understand how the TOC33 expression is regulated during gene transcription, promoter deletion and plant transient assays are used to characterize the critical sequences on TOC33 promoter. So far, the reporter activity assay indicate that TOC33 has one positive and two negative regulatory sequence, located on -810 to -710 and -710 to -411 respectively. Then, we analyze these critical sequences by PLACE and AGRIS database to find the cis-acting elements and the protein binding sites. The results indicate these critical sequences might be light-regulated or dehydration-regulated. Moreover, based on DIURNAL database and our reverse-transcription PCR (RT-PCR) results, TOC33, CIA2 and CIL express rhythmically in white light. Therefore, the rhythmic expression pattern and expression yields of TOC33 in wild-type and cia2-related mutant plants under different light treatments are further verified by real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR). The results illustrate that CIA2 and CIL increase the expression yield of TOC33 but has little effect to regulate the rhythmic pattern of TOC33. Furthermore, similar expression level of TOC33 under red light and white light treatment implies that phytochrome might be involved in the regulation of TOC33 expression.. Keyword: TOC33, TOC34, CIA2, CIL, plant transient assays, qRT-PCR. IV.

(7) 緒論色質體(plastids)是高度分化的胞器，廣泛存在於植物及藻類細胞中。葉綠體是由原色質體分化而來的色質體之一，主要功能為進行光合作用來產生植物所需的能量，也可以進行胺基酸、脂肪酸及萜烯類化合物(terpenes)的生合成。葉綠體內約有 3000 個蛋白質，其中超過 95%的蛋白質是由細胞核中的基因轉錄，再透過後轉譯轉運作用(posttranslational translocation)運送到葉綠體內。大部分運送至葉綠體的前驅蛋白(precursor protein)在胺基端 (NH2-terminal)會攜帶一段可供辨識的導引訊息(transit peptite)，經由轉運蛋白機組 (translocon complex)的辨識及協助，將前驅蛋白送至葉綠體中，最後會經由切割酵素(stroma processing peptidase)將導引訊息切除，形成成熟的蛋白質並運送至葉綠體各部位發揮其功能(Kessler and Schnell, 2009; Rossig et al., 2013; Shi and Theg, 2013)。轉運蛋白機組主要分別是位在葉綠體外膜上的 TOC (translocon at the outer envelope membrane)以及位在葉綠體內膜上的 TIC (translocon at the inner envelope membrane)，並利用分子量來區分不同轉運蛋白機組成員(Agne and Kessler, 2009; Tsai et al., 2013)。葉綠體外膜上核心的複合體主要是 TOC159、TOC34 及 TOC75，其中 TOC159 及 TOC34 是膜上的 GTP 水解酶(GTPase)，為前驅蛋白的受器；TOC75 是 β-筒狀(β-barrel)膜蛋白，形成通道使蛋白進入葉綠體中(Agne and Kessler, 2009; Tsai et al., 2013)。在阿拉伯芥中有兩個 TOC34 的同源蛋白，分別是負責運送光合作用蛋白(photosynthetic proteins)的 atTOC33，以及負責運送非光合作用蛋白(non-photosynthetic proteins)或管家蛋白(house-keeping proteins)的 atTOC34 (Shi and Theg, 2013)。前人研究以 EMS (ethyl-methane sulphonate)致突變劑及抗藥性篩選法，篩選出阿拉伯芥中葉綠體功能發生缺失的突變株，稱為 cia (chloroplast import apparatus)，透過生化及遺傳的實驗發現，cia2 是外表型偏淺綠色，葉綠體運輸效率下降的突變株(Sun et al., 2001)。此外，CIL (CIA2-like)是阿拉伯芥中 CIA2 的同源基因，CIL 基因轉錄出的胺基酸序列有 65 %是與 CIA2 相同，從 cia2 突變株的組織中發現，CIL 的轉錄量會提升，但不足以彌補 cia2 在外表型及葉綠體功能上的缺失，代表 CIL 無法完全取代 CIA2 的功能(Sun et al., 2001)。. -1-.

(8) 先前研究比較 cia2 突變株與野生型(Columbia, Col.)葉子中的 TOC/TIC 的基因表現量，發現 TOC33 在 Col.的表現量是 cia2 突變株的兩到三倍，但 TOC34 基因表現未受影響。此結果說明 CIA2 藉由調節 TOC33 來影響葉綠體蛋白運輸的效率(Sun et al., 2001)。從染色質免疫沉澱法(chromatin immunoprecipitation)的實驗結果中，也發現 CIA2 可以直接接合在 TOC33 啟動子序列上，卻不會接合在 TOC34 啟動子序列上(Sun et al., 2009)。本研究擬以 TOC33 為目標基因，以啟動子序列刪除及植物暫時性基因轉殖的技術，找出調控基因表現的關鍵序列。接著利用生物資訊網站 PLACE (Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements, Higo et al., 1999)及 AGRIS (Arabidopsis Gene Regulatory Information Server, Yilmaz et al., 2011)來分析比對這些關鍵序列是否有已知的順式作用元素(cis-acting element) 及蛋白結合位。最後，分析不同光源處理下 TOC33 的基因表現韻律(rhythmic expression) 及表現量在 Col 與 cia2/cil 突變株中的差異，進一步了解 TOC33 在不同光源下的規律表現及 CIA2/CIL 調節 TOC33 規律表現的機制。. -2-.

(9) 研究材料與方法. 一、植物材料 1. 材料基因槍實驗使用阿拉伯芥野生型種子(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia, Col.)。光處理實驗使用阿拉伯芥野生型(Col.)與雙基因突變株(cia2/cil)種子。 2. 消毒與種植取阿拉伯芥種子 500 顆置入 1.5mL 微量離心管，並以 75%酒精震盪約 10 分鐘，除去上清液。接著以 25%消毒水(Clorox：無菌水＝1：3，含有 0.5% Tween-20)，震盪約 10 分鐘，去除上清液。最後以大量無菌水清洗 3 次，去除上清液以完成消毒工作。將消毒完成的阿拉伯芥種子加入約 1mL 的無菌水，置於 4 °C 環境下進行春化作用兩天。將春化完成的種子於無菌操作台內，以無菌水清洗 2 次，加入 0.1% Agar，將種子均勻分布於 1X MS 培養基(1X Murashing and Skoog salt mixture, Gamborg’s vitamin, 2% sucrose) (Murashing and Skoog, 1962)後，生長在日夜恆溫 22 °C 生長箱中。 3. 生長條件植物基因轉殖實驗之植株，以 16 小時白光/8 小時黑暗的光照週期，培養至 16 天大。光處理實驗之植株，以 12 小時白光/12 小時黑暗的光照週期，培養至 14 天大，再進行不同光源處理實驗。. 二、植物暫時性基因轉殖分析 (plant transient assay) 1. 報導基因質體的製備設計 TOC33 上游調控序列專一引子(表一)，以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)放大不同長度 TOC33 啟動子刪除片段，利用 DNA 重組的方式，透過限制酵素(Bam HI/ Hínd III)將序列接合至含有冷光報導基因(luciferase, LUC2)的質體(圖一)，並以大腸桿菌選殖、定序及限制酵素處理等方法確定 TOC33 上游調控序列片段的長度及正確性。. -3-.

(10) 2. 轉殖植物葉片樣品準備以 16 天大的阿拉伯芥葉片，於無菌操作台內以滅菌過的剪刀剪下，利用滅菌過的鑷子，將葉片以葉背朝上的方式平鋪於 0.5X MS(含有 0.85% Agar)培養基中央，排成直徑約 1.5 公分的圓。 3. 質體殖入阿拉伯芥葉片取清洗過的金粉，加入等分子數 TOC33 啟動子序列驅動 LUC2 的質體及以花椰菜鑲嵌病毒 35S 啟動子驅動 β-葡萄糖甘酸酶(β-glucuronidase, GUS)報導基因的質體，並加入 12.5 µl 2.5M CaCl2 及 5 µl 0.1M spermidine 混合均勻，以 1000 rpm 離心，去除上清液。再以 200 µl 絕對酒精(99% EtOH)清洗 2 次，去除上清液，加入適量的絕對酒精混和均勻。取 2.5 µl 金粉液滴於巨攜圓盤(macrocarriers)上，以基因槍(Biolistic PDS-1000, He Particle Delivery System, Bio-Rad)於真空高壓下轟擊入製備好的阿拉伯芥葉片。轟擊完的阿拉伯芥葉片，放置於日夜恆溫 22 °C 生長箱培養 16 小時(光週期設定為 4 小時光、8 小時暗、4 小時光)，待轉入的質體反應後，再進行報導基因活性的分析。每組實驗均處理三次重複。 4. 報導基因活性分析將轉殖植物以液態氮冷凍後，利用研缽將組織磨碎成粉狀，隨即將粉末加入適量 1X Reporter Lysis Buffer (Promega)，震盪混和均勻。於 4 °C 離心後取上清液，置於冰上以維持活性。 (1) 測量總蛋白質(Total protein)濃度取適量樣本萃取液於透明 96 孔微量盤中，加入 1X Protein Assay Buffer (Bio-Rad) 反應，參照廠商建議，以分光光度計(Multiskan GO microplate spectrophotometer, Thermo Scientific) 測量在波長 595 nm 的吸光值。同時以不同濃度的 BSA 作為標準曲線(Standard Curve)，來推算總蛋白質的濃度。 (2) LUC 活性定量取適量樣本萃取液於白色 96 孔微量盤中，加入 100 µl Luciferase Assay Reagent (Promega)，利用冷光儀(SpectraMax L luminescence microplate reader, Molecular Devices) 以波長為 450 nm 的光激發偵測 LUC 的活性。 -4-.

(11) (3) GUS 活性定量(Jefferson et al., 1987) 取適量樣本萃取液於黑色 96 孔微量盤中，加入 50 µl 1mM 4-MUG (4-methylumbellyferyl β-D-glucuronide)溶液(溶於 1X Reporter Lysis Buffer)，參照廠商建議反應程序後，利用螢光儀(SpectraMax GEMINI XPS fluorescence microplate reader, Molecular Devices)偵測樣本在波長 455 nm 的吸光值。同時以不同濃度的 4-MU (4-methyl umbelliferone)製作標準曲線(Standard curve)，來推算 GUS 的濃度。 (4) LUC 對 GUS 相對活性計算分析不同 TOC33 上游調控序列影響阿拉伯芥葉片中報導基因 LUC 對 GUS 活性的比值，判斷各長度的序列片段影響報導基因比值的表現程度，找出在 TOC33 啟動子序列上，可能影響基因表現的關鍵序列。三、基因序列分析以 TOC33 啟動子上，基因表現程度有影響的關鍵序列片段，透過 PLACE、AGRIS 網站做序列比對，比較是否有已知的順式作用元素及蛋白結合位。. 四、光照處理及基因表現量分析 1. 光線環境因子處理取消毒並春化完成的野生型(Col.)、雙基因突變(cia2/cil)種子，種植於 1X MS 培養基中，培養於 22 °C、12 小時光照、12 小時黑暗的生長箱中。待植物生長至 13 天時，每 4 小時將植物以液態氮冷凍收集，作為實驗前對照組，共收集 6 個時間點。待植物生長至 14 天時，將植物移至連續白光與紅光光照的生長箱中做光照處理，每 4 小時將植物以冷凍液態氮收集，保存於-80 °C 中，一共收集三天 19 個時間點。 2. RNA 萃取(Chomczynski and Sacchi, 1987) 利用 TRIzol 試劑(Invitrogen)抽取不同光照處理阿拉伯芥的 total RNA。將適量的植物組織以液態氮冷凍，並以已預冷的研缽將組織磨成粉狀，加入含有 3ml TRIzol 試劑的 15 mL 離心管中混勻，於室溫下處理 5 分鐘。接著加入 1 ml 氯仿(chloroform, CHCl3)，混和均勻於室溫下反應 5 分鐘，以分離出蛋白質。之後以 4000 rpm，4 °C 離心 30 分鐘(Eppendorf 5804R centrifuge)，再將上清液加入含有 2 ml 異丙醇(isopropanol) -5-.

(12) 的 15 mL 離心管中，於室溫下靜置 10 分鐘，使 RNA 沉澱。再以 4000rpm，4 °C 離心 20 分鐘。去除上清液後，加入 3 ml 75%酒精以洗去雜質，以 4000rpm，4 °C 離心 15 分鐘，去除上清液。靜置於室溫乾燥後，加入適當 DEPC(diethyl pyrocarbonate)水回溶 RNA，測量 RNA 濃度並於-80 °C 儲存備用。 3. 即時定量反轉錄 PCR (real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR) 針對目標基因 TOC33、CIA2、CIL 設計專一性引子(表一)，取 5 µg total RNA 利用反轉錄酶(M-MLV reverse transcriptase, Promega)反轉錄成 cDNA (complementary DNA)。以 cDNA 作為模板，TOC33、CIA2、CIL、TOC34、UBQ10、CCA1、TOC1、 CAB3 專一性引子及 2X SYBE FAST qPCR kit 的試劑(KAPA Biosystems)進行實驗， PCR 條件設定為 95 °C 3 分鐘，之後 95 °C 3 秒、60 °C 30 秒為一個循環，進行 40 個循環(StepOne Plus thermal cycler, Applied Biosystems)，並分析其結果。 4. cDNA 絕對定量(absolute quantification) 先以 cDNA 作為模板，使用專一性引子 UBQ10-F1 與 UBQ10-R1 進行 PCR，複製出 UBQ10 序列的部分片段。之後將此 252-bps 的 UBQ10 片段黏接至載體 pGEM-T (Promega)，建構質體 pGUB10-1，作為基因絕對定量的參考序列。將 10 倍濃度差異(0.1 pg/µl 到 10 ng/µl 等 6 種不同濃度)的 pGUB10-1 做為模板，以 qRT-PCR 的方式測出不同濃度質體的 CT 值。再以 log(ng/µl)作為 X 軸，CT 值為 Y 軸劃出標準曲線，計算出趨勢線公式為 Y=-3.439X+14.353，R2 值為 0.9994。數據分析先算出各基因 CT 值扣除 UBQ10 CT 值(ΔCT)，並透過趨勢線公式將 ΔCT 換算成濃度，再換算出不同基因所含莫耳數，作為各基因表現的絕對定量數值。. -6-.

(13) 結果 TOC33 啟動子序列對報導基因的影響以專一性引子(表一)透過聚合酶連鎖反應將目標序列放大，得到每段相差約 100 bps 的啟動子序列。再以限制酶及接合酶將目標序列轉殖至帶有報導基因 LUC2 的質體上，建構出 10 個含有不同長度啟動子序列的報導基因質體，分別命名為 pKT3301~pKT3310 (圖一)，啟動子序列長度從 1189 bps 到 320 bps。透過基因槍把帶有不同長度啟動子刪除基因片段的報導基因質體，於真空高壓下轟擊入阿拉伯芥葉片，經由 4 小時光照、8 小時黑暗、4 小時光照培養 16 小時後，分析 pKT3301~pKT3310 質體中，由 TOC33 啟動子序列所驅動的報導基因表現量。結果發現 pKT3301~pKT3303 的表現量沒有顯著差異，但 pKT3303 的表現量為 pKT3304 的 2.8 倍(圖二)，pKT3305 的表現量為 pKT3304 的 3 倍，pKT3305~pKT3306 的表現量沒有顯著差異，但 pKT3307 的表現量為 pKT3306 的 2.5 倍，pKT3307~pKT3310 的表現量沒有顯著差異。因此，缺少 pKT3303~pKT3304 的-810 到-710 之間 100 bps 啟動子序列，會使基因表現量下降，而缺少 pKT3304~pKT3305 的-710 到-616 之間 94 bps 以及缺少 pKT3306~pKT3307 的-517 到-411 之間 106 bps 的啟動子序列，會使基因表現量上升，表示這三段啟動子序列可能是調節 TOC33 基因表現的關鍵序列。 TOC33 關鍵啟動子序列基因分析根據啟動子序列刪除分析報導基因的表現量得知，TOC33 啟動子序列上-810 到-710、 -710 到-616 及-517 到-411 之間可能為調節 TOC33 基因表現的關鍵序列。將 TOC33 啟動子序列-810 到-710 間的 100 bps 命名為 CAE1 (cis-acting element 1)，-710 到-616 間的 94 bps 命名為 CAE2，-517 到-411 間的 106 bps 命名為 CAE3。以生物資訊網站 PLACE 及 AGRIS 分析及比對三段 CAE 序列，比較是否含有已知的順式作用元素或蛋白結合位。從 PLACE 網站比對分析 CAE1~CAE3 序列，發現 CAE1 可能存在六種順式作用元素或蛋白結合位(附錄一)，其中 CAAT box (Shirsat et al., 1989; Kusnetsov et al., 1999)、CCA1 binding site (Wang et al., 1997)、T-box (Chan et al., 2001)可能與光調節有關。CAE2 可能存 -7-.

(14) 在十三種順式作用元素或蛋白結合位(附錄二)，其中 E-box (Hartmann et al., 2005)及 MYC 辨識位(Agarwal et al., 2006)可能與光調節有關，MYB 辨識位(Abe et al., 2003)則與植物脫水機制有關。CEA3 可能存在十三種順式作用元素或蛋白結合位(附錄三)，其中-10 promoter element (Thum et al., 2001)、E-box (Hartmann et al., 2005)及 MYC 辨識位(Agarwal et al., 2006) 可能與光調節有關，MYB 辨識位(Abe et al., 2003)則與植物脫水機制有關。針對在 AGRIS 上的比對結果也顯示，TOC33 在轉錄起始點前-110 到-105 帶有序列 AACTAAC，可能是 MYB4 鍵結的 motif (Chen et al., 2002)，會被 MYB 家族蛋白結合的特定序列。以及轉錄起始點前-19 到-14 帶有序列可能具有 GATAAG，可能是 I box 啟動子上的 motif (Rose et al., 1999)。紅光對於 TOC33、CIA2、CIL 基因表現韻律的影響光線對於植物生長發育及概日韻律扮演重要的角色，而紅光、遠紅光及藍光對於植物的影響更為重要。先前研究發現 CIA2 是一個受光調節的蛋白質，從 DIURNAL database (Mockler et al., 2007)上發現 TOC33、CIA2 及 CIL 在 12 小時光照 12 小時黑暗底下皆具有規律性的表現(附錄四及五)。為了瞭解調節 TOC33、CIA2 及 CIL 規律性表現的原因，實驗以 14 天大的阿拉伯芥植株分別處理白光及紅光，來探討光質是否會影響這三個基因的規律性表現。結果先將 CCA1、TOC1 及 CAB3 在所有植物組織的表現模式先做檢測，並與 DIURNAL database 上的基因表現模式做比較(附錄六及七)，確定了光處理的準確性後，再分析 TOC33、CIA2 及 CIL 三個基因的絕對表現量，並以 TOC34 作為負向控制組。在維持白光照射 12 小時光照 12 小時黑暗，四個基因表現皆具有規律性，其中 TOC33 會在進入黑暗後 4 到 8 小時會達到最高峰(圖三 A)；CIA2 的規律性較為不明顯，但若比較 DIURNAL 的實驗結果，發現 CIA2 會在一天當中達到兩次高峰，分別是進入光照後 8 小時以及進入黑暗後 8 小時(圖三 B 及附錄五)；CIL 會在進入黑暗後 8 小時達到高峰(圖三 C)；TOC34 會在進入光照後 12 小時達到最高峰(圖三 D)。當進行 12 小時紅光照射 12 小時黑暗的實驗處理之後，四個基因仍然存在相似的規律性，而且基因的表現量與白光照射下相同，其中 CIL 照射紅光之後，達到高峰的時間會提前 4 個小時(圖三 C)。在連續光照下，四個基因照射紅光與白光的結果相似(圖四)。但 TOC33 的基因表現在連續光照下，達到高峰的時間. -8-.

(15) 會比維持 12 小時光照 12 小時黑暗提前 4 個小時，韻律性不變(圖三 A 及四 A)。因此，基因的規律性與基因的表現量在紅光處理下可以維持與白光照射下相似的結果。野生型及 cia2/cil 突變植物中 TOC33、CIA2、CIL 基因表現韻律的影響為了進一步了解 CIA2 與 CIL 蛋白是否會調節 TOC33 規律性的表現，實驗以 14 天大的野生型及 cia2/cil 雙基因突變植株來觀察維持白光照射 12 小時光照 12 小時黑暗下與連續 24 小時光照的結果。此實驗亦先檢測 CCA1、TOC1 及 CAB3 在所有植物組織的表現模式，並與 DIURNAL database 上的基因表現模式做比較(附錄六及八)後，再分析 TOC33、 CIA2 及 CIL 三個基因的絕對表現量。結果發現 TOC33、CIL 及 TOC34 基因的規律性與前述實驗相同(圖五 A、C 及 D)，但 CIA2 在缺少 CIA2 與 CIL 蛋白的植株下，達到高峰的次數會由兩次變成一次，只剩下進入光照後 8 小時表現量較高的高峰(圖五 B)。比較基因的絕對表現量，TOC33 與 CIL 在缺少 CIA2 與 CIL 蛋白的植株中，基因的表現量皆會下降為原表現量的 50%左右(圖五 A 及 C)；但是 CIA2 達到高峰的表現量會比 Col.來的多(圖五 B)。作為負向控制組的 TOC34，基因的規律性與絕對表現量在 Col.與 cia2/cil 雙基因突變株中沒有差異(圖五 D)。在連續光照下，TOC33 與 CIL 在基因表現量的結果與維持光週期 12 小時光照 12 小時黑暗的結果相同，但表現量達到高峰的時間會提前 4 個小時(圖五 A、C 及圖六 A、C)；CIA2 與 TOC34 在基因規律性與基因表現量的結果皆與維持光週期 12 小時光照 12 小時黑暗相似(圖五 B、D 及圖六 B、D)。因此，CIA2/CIL 蛋白會調控 TOC33 及 CIL 基因表現量，維持 CIA2 基因在一天當中達到兩次高峰，但不會影響 TOC34 基因規律性及基因表現量。. -9-.

(16) 討論由啟動子序列刪除搭配報導基因的實驗，發現位在 TOC33 上游調控序列不只有單一個序列，可能有多種調控方式，分別在 TOC33 啟動子序列上-710 ~ -810、-710 ~ -616 以及 -517 ~ -411 之間，所驅動的報導基因表現量會有明顯的差異，分別命名為 CAE1、CAE2 以及 CAE3。CAE1~3 三段各約有 100 bps 的調控序列，CAE1 為正向的調控序列，而 CAE2 以及 CAE3 為負向調控序列。以 PLACE 及 AGRIS 共同分析比對，發現這三段序列皆可能存在與光調節有關的 motif，而負向調控序列的 CAE2 及 CAE3 共同存在 E-box、MYB 辨識位及 MYC 辨識位，由 AGRIS 分析也找到 MYB 家族的辨識位。MYB 是可以調節植物脫水反應(dehydration-responsive)基因 rd22(Abe et al., 2003)，MYC 辨識位也會同時與 E-box 合作，參與光對植物基因表現的調節(Hartmann et al., 2005)。此外，當植物處在低溫的環境下，MYC 辨識位會被 bHLH (basic helix-loop-helix)類的轉錄因子 ICE1 (inducer of CBF expression 1)所辨識及鍵結(Agarwal et al., 2006)。因此，TOC33 上游負向的調控序列，可能會受到光、乾旱或低溫的調節。我們之前對於 CIA2 及 CIL 啟動子序列的分析(Chang, 2012)，加上本研究對於 TOC33 啟動子的分析，推測這三個基因確實有可能會受光調節。從 DIRUNAL database (Mockler et al., 2007)上觀察 TOC33、CIA2、CIL 及 TOC34，在 Col.植株以 12 小時光照 12 小時黑暗的光週期下，表現會具有規律性(附錄五)，而植物受光調節主要會受到紅光、遠紅光及藍光的影響。我們進一步分析紅光是否影響 TOC33 具有規律性的表現，結果發現在 12 小時光照 12 小時黑暗或連續 24 小時光照下，四個基因的規律性與絕對表現量，在紅光下可以維持與白光相似的結果，推測紅光存在就可以維持植物在白光下的基因的概日韻律性。而藍光與遠紅光是否會影響植物基因的規律性表現，需要進一步再做驗證。在已知的研究中，植物的光受體(photoreceptor)光敏素(phytochrome)會吸收紅光，之後轉換成具有活性的光敏素(Pfr)；經由遠紅光照射後，會再變回沒有活性的光敏素(Pr)。根據實驗結果，推測具有活性的光敏素存在就可以維持植物基因的概日韻律性。此外，我們也發現缺乏 CIA2 與 CIL 蛋白的植株中，TOC33 的規律性不變，但是基因表現量下降了，這與先前的研究所指出 CIA2 會調節 TOC33 基因表現的結果相同(Sun et al., 2001；Sun et al., 2009)。因此 CIA2 的. - 10 -.

(17) 存在與否不會影響 TOC33 基因的規律性，但會影響其基因的表現量。實驗結果也比較 CIA2 與 CIL 的基因表現，發現在 cia2/cil 突變株中，CIA2 表現量達高峰的時間會由兩次變成一次，基因的表現量會比 Col.多；而 CIL 基因表現量會下降(圖五 B 及 C)。先前的研究指出， CIA2 缺乏的情況下，CIL 的轉錄量會上升(Sun et al., 2001)，表示 CIL 可以彌補 CIA2 部分的功能。因此 CIA2 及 CIL 可能存在不同的回饋的機制，在同時缺乏 CIA2 與 CIL 蛋白時，會促進 CIA2 基因在光照下達高峰的表現量，抑制 CIL 基因表現量。TOC34 的基因表現在 cia2/cil 突變植株中，基因的規律性及表現量都不會受到影響，也可以證實作為負向控制組的 TOC34 不會受到 CIA2 與 CIL 調節。. - 11 -.

(18) 參考文獻 1. Abe H., Urao T., Ito T., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2003). Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell. 15:63-78. 2. Agarwal M., Hao Y., Kapoor A., Dong C.H., Fujii H., Zheng X., Zhu J.K. (2006). A R2R3 type MYB transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance. J Biol Chem. 281:37636-45. 3. Agne, B., and Kessler, F. (2009). Protein transport in organelles: The Toc complex way of preprotein import. FEBS J. 276: 1156–1165. 4. Chan C.S., Guo L., Shih M.C. (2001). Promoter analysis of the nuclear gene encoding the chloroplast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit of Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol. 2001 46:131-41. 5. Chang C.T. (2012). Regulatory mechanism of CIA2/CIL gene expression in Arabidopsis. Master thesis. 6. Chen W., Provart N.J., Glazebrook J., Katagiri F., Chang H.S., Eulgem T., Mauch F., Luan S., Zou G., Whitham S.A., Budworth P.R., Tao Y., Xie Z., Chen X., Lam S., Kreps J.A., Harper J.F., Si-Ammour A., Mauch-Mani B., Heinlein M., Kobayashi K., Hohn T., Dangl J.L., Wang X., Zhu T. (2002). Expression profile matrix of Arabidopsis transcription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stresses. Plant Cell. 14:559-74. 7. Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987). Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction. Anal Biochem.162:156-159. 8. Elmayan T. and Tepfer M. (1995). Evaluation in tobacco of the organ specificity and strength of the rolD promoter, domain A of the 35S promoter and the 35S2 promoter. Transgenic Res. 4:388-96. 9. Hartmann U., Sagasser M., Mehrtens F., Stracke R., Weisshaar B. (2005). Differential combinatorial interactions of cis-acting elements recognized by R2R3-MYB, BZIP, and. - 12 -.

(19) BHLH factors control light-responsive and tissue-specific activation of phenylpropanoid biosynthesis genes. Plant Mol Biol. 57:155-71. 10. Higo K., Ugawa Y., Iwamoto M., and Korenaga T. (1999). Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database:1999. Nucleic Acids Research 27:297-300. 11. Jarvis, P., Chen, L.J., Li, H., Peto, C.A., Fankhauser, C., Chory, J. (1998). An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282: 100-103. 12. Jefferson, R.A. (1987). Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405. 13. Kessler, F., and Schnell, D. (2009). Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Curr Opin Cell Bio. 21:494–500. 14. Kusnetsov V., Landsberger M., Meurer J., Oelmuller R. (1999). The Assembly of the CAAT-box Binding Complex at a Photosynthesis Gene Promoter Is Regulated by Light, Cytokinin, and the Stage of the Plastids. J. Biol. Chem. 274:36009-14. 15. Lamesch, P., Berardini, T.Z., Li, D., Swarbreck, D., Wilks, C., Sasidharan, R., Muller, R., Dreher, K., Alexander, D.L., Garcia-Hernandez, M., Karthikeyan, A.S., Lee, C.H., Nelson, W.D., Ploetz, L., Singh, S., Wensel, A., and Huala, E. (2012). The Arabidopsis Information Resource (TAIR): improved gene annotation and new tools. Nucleic Acids Res. 40:1202-1210. 16. Mockler, T.C., Michael, T.P., Priest, H.D., Shen, R., Sullivan, C.M., Givan, S.A., McEntee, C., Kay, S.A., Chory, J. (2007). The DIURNAL project: DIURNAL and circadian expression profiling, model-based pattern matching, and promoter analysis. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 72: 353-363. 17. Murashige, T., and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497. 18. Rose A., Meier I., Wienand U. (1999). The tamato I-box binding factor LeMYBI is a member of a novel class of Myb-like proteins. Plant J 20: 641-652. 19. Rossig C., Reinbothe C., Gray J., Valdes O., Wettstein D., Reinbothe S. (2013). Three proteins mediate import of transit sequence-less precursors into the inner envelope of chloroplasts in Arabidopsis thaliana. PNAS 110:19962-19967. - 13 -.

(20) 20. Shi L. X., Theg S. M. (2013). The chloroplast protein import system: From algae to trees. Biochimica et Biophysica Acta 1833:314–331. 21. Shirsat A., Wilford N., Croy R., Boulter D.(1989). Sequences responsible for the tissue specific promoter activity of a pea legumin gene in tobacco. Mol Gen Genet. 215:326-31. 22. Sun, C.W., Chen, L.J., Lin, L.C., Li, H.M. (2001). Leaf-specific up-regulation of chloroplast translocon genes by a CCT motif–containing protein, CIA2. Plant Cell 13: 2053–2061. 23. Sun, C.W., Huang, Y.C., Chang, H.Y. (2009). CIA2 coordinately up-regulates protein import and synthesis in leaf chloroplasts. Plant Physiol. 150: 879-888. 24. Tatematsu K., Ward S., Leyser O., Kamiya Y., Nambara E. (2005). Identification of cis-elements that regulate gene expression during initiation of axillary bud outgrowth in Arabidopsis. Plant Physiol. 138:757-66. 25. Thum K.E., Kim M., Morishige D.T., Eibl C., Koop H.U., Mullet J.E. (2001). Analysis of barley chloroplast psbD light-responsive promoter elements in transplastomic tobacco. Plant Mol Biol. 47:353-66. 26. Tsai J.Y., Chu C.C., Yeh Y.H., Chen L.J., Li H.M., Hsiao C.D. (2013). Structural characterizations of the chloroplast translocon protein Tic110. The Plant Journal 75:847–857 27. Wang Z.Y., Kenigsbuch D., Sun L., Harel E., Ong M.S., Tobin E.M. (1997). A Myb-related transcription factor is involved in the phytochrome regulation of an Arabidopsis Lhcb gene. Plant Cell. 9:491-507. 28. Yilmaz A., Mejia-Guerra M.K., Kurz K., Liang X., Welch L., Grotewold E. (2011). AGRIS: Arabidopsis Gene Regulatory Information Server, an update. Nucleic Acids Research 39:1118-1122.. - 14 -.

(21) 表格與圖片表一、專一引子對序列資料名稱. 序列內容(5’→3’). Toc33-reF1. GCCAAGCTTGGACCTCAATAGAGTTCCATC. Toc33-reR2. CGGGGATCCACTCCTAAACCCTTCAGCT. Toc33-reF2. GCCAAGCTTCCTTCCCTCGCAGTGGCAGC. Toc33-reF3. GCCAAGCTTGCCATCATCATCAGACTTTGCC. Toc33-reF4. GCCAAGCTTCCTGCAAATCCATGAAACCGG. Toc33-reF5. GCCAAGCTTGGCTGTTCTATCCCAGACCC. Toc33-reF6. GCCAAGCTTCCCAGTGCTCTCCGTGTTTC. Toc33-reF7. GCCAAGCTTGGACTGTTGACAGAGGCTCTG. Toc33-reF8. GCCAAGCTTCCTGAGCGAAGACAATCATGC. Toc33-reF9. GCCAAGCTTGACGCTATGCTAATTCAATGTTC. Toc33-reF10. GCCAAGCTTGGTAACTGGATTTGGTTTGGGG. TOC33-RT-F6. CTGATGTAGCAACAAACCAGAGG. 目的複製 TOC33 上游序列. 複製啟動子序列刪除分析所需片段. TOC33-RT-R6 GTGGCTTTCCACTTGTCTTG CIA2-RT-F1. GGAGACGAGTTTGAAGAGAACAG. CIA2-RT-R1. CTAGCATTGACATCGACAGCTTC. CIL-RT-F1. CTCGAATCCAAAGCTGGAGCAG. CIL-RT-R1. CCTTACATGAAAATCGACTCCG. TOC34-RT-F2. GATTCCTTTAATGTTTGCATTCC. TOC34-RT-R2 GTCCACAACTCAAGACCTTCGAC UBQ10-F23. GGACAAGGAAGGTATTCCTC. UBQ10-R1. CTTCTTAAGCATAACAGAGACGAG. CCA1-RT-F1. CAGAGTCCAATGCACGCCGC. CCA1-RT-R1. CTCGATATGTAAAACTTTGCG. TOC1-RT-F1. GGTCCACCAACCCACAGAG. TOC1-RT-R1. GGAGGCTCTATAGCAGTAAC. CAB3-RT-F2. CAACGCATGGGCCTTCGCA. CAB3-RT-R2. CAAACCATCACATACAACCTT. UBQ10-F1. CTTCGTCAAGACTTTGACCG. - 15 -. 進行 qRT-PCR 實驗. 選殖 pGUB10-1 質體.

(22) 圖一、建構 TOC33 啟動子序列刪減之質體示意圖由 TOC33 基因啟動子序列驅動冷光報導基因(LUC2)的質體示意圖。TOC33 啟動子(深灰色框)後方接 TOC33 之 5’ UTR (白色框)以穩定基因表現。5’ UTR 中間線段表示第一內插子，+1 代表 TOC33 轉錄起始點。左下圖為各前置引子(F1~F10)搭配反置引子(R2)在啟動子序列上的相對位置，每段相差約 100 bps。前置引子由啟動子 5’端開始遞減，反置引子位於 5’ UTR 的底端。表格為質體命名及啟動子序列長度。. - 16 -.

(23) 圖二、比較不同 TOC33 基因啟動子片段驅動報導基因之相對活性以基因槍將含有不同 TOC33 基因啟動子序列片段的質體，轉殖入 16 天大之阿拉伯芥葉片，繼續在 22 °C、4 小時光照 8 小時黑暗 4 小時光照下培養 16 小時，分析報導基因 LUC 比 GUS 活性比值之相對表現量。圖中以 pKT3301 之表現量為基準，各片段之相對表現量倍率。. - 17 -.

(24) (A). (B). (C). (D). 圖三、週期性光處理對於基因規律性表現與表現量的影響 (A) TOC33，(B) CIA2，(C) CIL，(D) TOC34 之基因絕對表現量 14 天大的 Col.植株(12 小時白光、12 小時黑暗)，分別處理白光(黑實線)與紅光(紅實線) 三天(12 小時光照、12 小時黑暗)。自第 13 天起，每 4 小時萃取植株之 RNA，並進行 qRT-PCR 實驗。數據分析以 UBQ10 作為 qRT-PCR 內部控制組，再以序列稀釋後的質體 pGUB10-1 作為絕對定量基準，每組實驗為一次生物性樣本重複。. - 18 -.

(25) (A). (B). (C). (D). 圖四、連續性光處理對於基因規律性表現與表現量的影響 (A) TOC33，(B) CIA2，(C) CIL，(D) TOC34 之基因絕對表現量 14 天大的 Col.植株(12 小時白光、12 小時黑暗)，分別處理連續白光(黑虛線)與連續紅光(紅虛線)三天。自第 13 天起，每 4 小時萃取植株之 RNA，並進行 qRT-PCR 實驗。數據分析以 UBQ10 作為 qRT-PCR 內部控制組，再以序列稀釋後的質體 pGUB10-1 作為絕對定量基準，每組實驗為一次生物性樣本重複。. - 19 -.

(26) (A). (B). (C). (D). 圖五、比較 Col.及 cia2/cil 突變植株在週期性白光處理下之基因表現規律性與表現量 (A) TOC33，(B) CIA2，(C) CIL，(D) TOC34 之基因絕對表現量 14 天大(生長週期為 12 小時白光、12 小時黑暗)的 Col. (黑實線)及 cia2/cil 突變植株(綠實線)，繼續以相同的生長週期培養三天。自第 13 天起，每 4 小時萃取植株之 RNA，並進行 qRT-PCR 實驗。數據分析以 UBQ10 作為 qRT-PCR 內部控制組，再以序列稀釋後的質體 pGUB10-1 作為絕對定量基準，每組實驗為三次生物性樣本重複。. - 20 -.

(27) (A). (B). (C). (D). 圖六、比較 Col.及 cia2/cil 突變植株在連續性白光處理下之基因表現規律性與表現量 (A) TOC33，(B) CIA2，(C) CIL，(D) TOC34 之基因絕對表現量 14 天大(生長週期為 12 小時白光、12 小時黑暗)的 Col. (黑實線)及 cia2/cil 突變植株(綠實線)，再以連續性白光培養三天(黑虛線及綠虛線分別代表 14 天後的 Col 及 cia2/cil 突變植株)。自第 13 天起，每 4 小時萃取植株之 RNA，並進行 qRT-PCR 實驗。數據分析以 UBQ10 作為 qRT-PCR 內部控制組，再以序列稀釋後的質體 pGUB10-1 作為絕對定量基準，每組實驗為一次生物性樣本重複。. - 21 -.

(28) 附錄附錄一、以 PALCE 資料庫分析 CAE1 之調控序列 Factor or Site Name ARR1AT (ARR1-binding element) CAATBOX1 (CAAT box) CCA1ATLHCB1 (CCA1 binding site). DOFCOREZM (Dof protein binding site). Loc.(Str.) Signal Sequence 49 (-) 96 (-) 95 (+). 93 (+). Description. NGATT. ARR1 is a response regulator; AGATT is found in the promoter of rice non-symbiotic haemoglobin-2 (NSHB) gene (Ross et al., 2004).. CAAT. "CAAT promoter consensus sequence" found in legA gene of pea.. AAMAATCT. CCA1 protein (myb-related transcription factor) interact with two imperfect repeats of AAMAATCT in Lhcb1*3 gene of Arabidopsis thaliana (A.t.); Related to regulation by phytochrome.. AAAG. Core site required for binding of Dof proteins in maize (Z.m.); Dof proteins are DNA binding proteins, with presumably only one zinc finger, and are unique to plants; Maize Dof1 enhances transcription from the promoters of both cytosolic orthophosphate kinase (CyPPDK) and a non-photosynthetic PEPC gene.. 23 (+) 16 (-). TBOXATGAPB (T box). 15 (+). ACTTTG. "Tbox" found in the Arabidopsis thaliana (A.T.) GAPB gene promoter; Mutations in the "Tbox" resulted in reductions of light-activated gene transcription; GAPB encodes the B subunit of chloroplast GADPH of A.T.. UP2ATMSD (Up2 motif). 72 (+). AAACCCTA. "Up2" motif found in 193 of the 1184 up-regulated genes after main stem decapitation in Arabidopsis.. - 22 -.

(29) 附錄二、以 PALCE 資料庫分析 CAE2 之調控序列 Factor or Site Name. Loc.(Str.). ARR1AT (ARR1-binding element). 35 (+). CACTFTPPCA1 (Key component of Mem1). 31 (+). Signal Sequence. Description. NGATT. ARR1 is a response regulator; AGATT is found in the promoter of rice non-symbiotic haemoglobin-2 (NSHB) gene (Ross et al., 2004).. YACT. Tetranucleotide (CACT) is a key component of Mem1 (mesophyll expression module 1) found in the cis-regulatory element in the distal region of the phosphoenolpyruvate carboxylase (ppcA1) of the C4 dicot F. trinervia.. GTAC. GTAC is the core of a CuRE (copper-response element) found in Cyc6 and Cpx1 genes in Chlamydomonas; Also involved in oxygen-response of these genes.. AAAG. Core site required for binding of Dof proteins in maize (Z.m.); Dof proteins are DNA binding proteins, with presumably only one zinc finger, and are unique to plants; Maize Dof1 enhances transcription from the promoters of both cytosolic orthophosphate kinase (CyPPDK) and a non-photosynthetic PEPC gene.. CANNTG. E-box of napA storage-protein gene of Brassica napus (B.n.); This sequence is also known as RRE (R response element) (Hartmann et al., 2005).. GANTTNC. "EEC"; Consensus motif of the two enhancer elements, EE-1 and EE-2, both found in the promoter region of the Chlamydomonas Cah1 (encoding a periplasmic carbonic anhydrase); Binding site of Myb transcription factor LCR1 (see Yoshioka et al, 2004).. 1 (-). TGCAGG. "3' intron-exon splice junctions"; Plant intron lower sequence; Consensus sequence for plant introns.. 74 (+). WAACCA. MYB recognition site found in the promoters of the dehydration-responsive gene rd22. 7 (-) 53 (+) 29 (-) 30 (+). CURECORECR (Core of a CuRE). 60 (+) 30 (-) 60 (-). DOFCOREZM (Dof protein binding site) EBOXBNNAPA (E-box). 25 (+). 66 (+) 66 (-) 36 (+). EECCRCAH1. 4 (-) 86 (-). INTRONLOWER MYB1AT. - 23 -.

(30) (MYB recognition site). and many other genes in Arabidopsis. 66 (+). MYCCONSENSUSAT (MYC recognition site). NODCON2GM (Nodulin consensus sequence) OSE2ROOTNODULE. POLLEN1LELAT52. SURECOREATSULTR11 (Core of sulfur-responsive element). 66 (-). CANNTG. MYC recognition site found in the promoters of the dehydration-responsive gene rd22 and many other genes in Arabidopsis; Binding site of ATMYC2; MYC recognition sequence in CBF3 promoter; Binding site of ICE1 (inducer of CBF expression 1) that regulates the transcription of CBF/DREB1 genes in the cold in Arabidopsis; ICE1 (Chinnusamy et al., 2004);This sequence is also known as RRE (R response element) (Hartmann et al., 2005).. CTCTT. One of two putative nodulin consensus sequences.. CTCTT. One of the consensus sequence motifs of organ-specific elements (OSE) characteristic of the promoters activated in infected cells of root nodules.. AGAAA. One of two co-dependent regulatory elements responsible for pollen specific activation of tomato (L.e.) lat52 gene; Also found in the promoter of tomato endo-beta-mannanase gene (LeMAN5) gene (Filichkin et al. 2004).. GAGAC. Core of sulfur-responsive element (SURE) found in the promoter of SULTR1;1 high-affinity sulfate transporter gene in Arabidopsis; SURE contains auxin response factor (ARF) binding sequence (GAGACA); its complementary seq is GAGACA, and this core sequence is a part of it; this core seq is involved in -S response.. 90 (+) 26 (-) 90 (+) 26 (-) 72 (+). 46 (-). - 24 -.

(31) 附錄三、以 PALCE 資料庫分析 CAE3 之調控序列 Factor or Site Name. Loc.(Str.) Signal Sequence. TATTCT. "-10 promoter element" found in the barley (H.v.) chloroplast psbD gene promoter; Involved in the expression of the plastid gene psbD which encodes a photosystem II reaction center chlorophyll-binding protein that is activated by blue, white or UV-A light.. YACT. Tetranucleotide (CACT) is a key component of Mem1 (mesophyll expression module 1) found in the cis-regulatory element in the distal region of the phosphoenolpyruvate carboxylase (ppcA1) of the C4 dicot F. trinervia.. GTAC. GTAC is the core of a CuRE (copper-response element) found in Cyc6 and Cpx1 genes in Chlamydomonas; Also involved in oxygen-response of these genes.. AAAG. Core site required for binding of Dof proteins in maize (Z.m.); Dof proteins are DNA binding proteins, with presumably only one zinc finger, and are unique to plants; Maize Dof1 enhances transcription from the promoters of both cytosolic orthophosphate kinase (CyPPDK) and a non-photosynthetic PEPC gene.. CANNTG. E-box of napA storage-protein gene of Brassica napus (B.n.); This sequence is also known as RRE (R response element) (Hartmann et al., 2005).. 41 (-) -10PEHVPSBD (-10 promoter element). 63 (-). CACTFTPPCA1 (Key component of Mem1). 25 (+). CURECORECR (Core of a CuRE). 75 (+). DOFCOREZM (Dof protein binding site) EBOXBNNAPA (E-box). 4 (-). 75 (-). 54 (+). 79 (+) 79 (-). Description. GTGANTG10 (GTGA motif). 32 (-). GTGA. "GTGA motif" found in the promoter of the tobacco (N.t.) late pollen gene g10 which shows homology to pectate lyase and is the putative homologue of the tomato gene lat56.. MYB1AT (MYB recognition site). 93 (-). WAACCA. MYB recognition site found in the promoters of the dehydration-responsive gene rd22 and many other genes in Arabidopsis.. MYCCONSENSUSAT (MYC recognition site). 79 (+). CANNTG. MYC recognition site found in the promoters of the dehydration-responsive gene rd22 and many other genes in Arabidopsis; Binding site of ATMYC2;MYC recognition. - 25 -.

(32) sequence in CBF3 promoter; Binding site of ICE1 (inducer of CBF expression 1) that regulates the transcription of CBF/DREB1 genes in the cold in Arabidopsis; ICE1 (Chinnusamy et al., 2004);) This sequence is also known as RRE (R response element) (Hartmann et al., 2005).. 79 (-). P1BS (PHR1-binding sequence) RAV1BAT (RAV binding consensus sequence) ROOTMOTIFTAPOX1. SURECOREATSULTR11 (Sulfur-responsive element). TAAAGSTKST1 (TAAAG motif). GNATATNC. PHR1-binding sequence found in the upstream regions of phosphate starvation responsive genes from several plant species; phr1 (phosphate starvation response 1) gene codes for PHR1 protein related to PSR1 gene in C. reinhardtii.. CACCTG. Binding consensus sequence of an Arabidopsis (A.t.) transcription factor, RAV1; RAV1 specifically binds to DNA with bipartite sequence motifs of RAV1-A (CAACA) and RAV1-B (CACCTG); The expression level of RAV1 were relatively high in rosette leaves and roots.. ATATT. Motif found both in promoters of rolD.. GAGAC. Core of sulfur-responsive element (SURE) found in the promoter of SULTR1;1 high-affinity sulfate transporter gene in Arabidopsis; SURE contains auxin response factor (ARF) binding sequence (GAGACA); its complementary seq is GAGACA), and this core sequence is a part of it; this core seq is involved in -S response.. TAAAG. TAAAG motif found in promoter of Solanum tuberosum (S.t.) KST1 gene; Target site for trans-acting StDof1 protein controlling guard cell-specific gene expression; KST1 gene encodes a K+ influx channel of guard cells.. 42 (+) 42 (-). 79 (+). 43 (-) 65 (-). 87 (-). 53 (+). - 26 -.

(33) 附錄四、DIURNAL 資料庫不同實驗條件狀況(12L/12D)之列表 Name. Age. Access. (days). Media. Tissue. Light. Light period. Temperature. LDHC. 7. Col-0. agar, no suc. seedling 100uE 12/12 L/D 12h 22 °C/12h 12 °C. LDHH-Stitt. 35. Col-0. soil. leaf. 130uE 12/12 L/D 22°C. LDHH-Smith. 29. Col-0. soil. leaf. 180uE 12/12 L/D 20°C. COL LDHH. 7. Col-0. agar, 3% suc. seedling 120uE 12/12 L/D 22°C. LIGHT5 HIF138-13. 7. hif138-13. agar, no suc. seedling 102uE 12/12 L/D 22°C. LIGHT5 HIF138-8. 7. hif138-8. agar, no suc. seedling 103uE 12/12 L/D 22°C. LIGHT5 znknOX. 7. tsp-ox (hif138-8) agar, no suc. seedling 104uE 12/12 L/D 22°C. lux-2 LDHH. 7. lux-2. agar, 3% suc. seedling 120uE 12/12 L/D 22°C 縮寫表. lux-2. Lux Arrhythmo-2. tsp-ox (hif138-8). Tandem Zincknuckle Protein-OX. hif138-8. Heterogenous Inbred Family 138-8. hif138-13. Heterogenous Inbred Family 138-13. - 27 -.

(34) 附錄五、以 DIURNAL 資料庫分析 TOC33/CIA2/CIL/TOC34 基因表現模式. CIL. CIA2. TOC33. LDHH-Stitt. TOC34. TOC34. CIL. CIA2. TOC33. LDHC. - 28 -.

(35) TOC34. TOC34. CIL. CIL. CIA2. CIA2. TOC33. TOC33. LDHH-Smith COL LDHH. - 29 -.

(36) CIL. CIA2. TOC33. LIGHT5 HIF138-8. TOC34. TOC34. CIL. CIA2. TOC33. LIGHT5 HIF138-13. - 30 -.

(37) TOC34. TOC34. CIL. CIL. CIA2. CIA2. TOC33. TOC33. LIGHT5 znknOX lux-2 LDHH. - 31 -.

(38) 附錄六、以 DIURNAL 資料庫分析 CCA1/TOC1/CAB3 基因表現模式. TOC1. CCA1. LDHH-Stitt. CAB3. CAB3. TOC1. CCA1. LDHC. - 32 -.

(39) TOC1. CCA1. COL LDHH. CAB3. CAB3. TOC1. CCA1. LDHH-Smith. - 33 -.

(40) TOC1. CCA1. LIGHT5 HIF138-8. CAB3. CAB3. TOC1. CCA1. LIGHT5 HIF138-13. - 34 -.

(41) TOC1. CCA1. lux-2 LDHH. CAB3. CAB3. TOC1. CCA1. LIGHT5 znknOX. - 35 -.

(42) 附錄七、週期性與連續性光照下 CCA1/TOC1/CAB3 的基因絕對表現量. TOC1. CCA1. Continuous light (24L). CAB3. CAB3. TOC1. CCA1. Periodic light (12L/12D). 14 天大的 Col.植株(12 小時白光、12 小時黑暗)，分別處理週期性白光(黑實線)與紅光 (紅實線)三天，或連續白光(黑虛線)與連續紅光(紅虛線)三天。自第 13 天起，每 4 小時萃取植株之 RNA，並進行 qRT-PCR 實驗。數據分析以 UBQ10 作為 qRT-PCR 內部控制組，再以序列稀釋後的質體 pGUB10-1 作為絕對定量基準，每組實驗為一次生物性樣本重複。. - 36 -.

(43) 附錄八、比較 Col.及 cia2/cil 突變植株中 CCA1/TOC1/CAB3 的基因絕對表現量. TOC1. CCA1. Continuous light (24L). CAB3. CAB3. TOC1. CCA1. Periodic light (12L/12D). 14 天大(生長週期為 12 小時白光、12 小時黑暗)的 Col. (黑實線)及 cia2/cil 突變植株(綠實線)，分別以週期性白光或連續性白光繼續處理三天(黑虛線及綠虛線分別代表 14 天後的 Col.及 cia2/cil 突變植株)。自第 13 天起，每 4 小時萃取植株之 RNA，並進行 qRT-PCR 實驗。數據分析以 UBQ10 作為 qRT-PCR 內部控制組，再以序列稀釋後的質體 pGUB10-1 作為絕對定量基準，每組實驗為一次生物性樣本重複。. - 37 -.

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