第二章 製備 2’-去氧腺嘌呤模版分子
2.1.3 模版與單體間的作用力
模版與單體之間的作用是主要決定模版高分子孔洞形成的關鍵因 素 ， 而 這 個 作 用 力 可 以 是 共 價 鍵 (covalent bond) 或 是 非 共 價 鍵 (noncovalent bond) 來輔助孔洞的形成，不論哪一種作用力，都必須可以 在不破壞分子模版高分子的結構下，將模版移除形成具專一性辨識之孔 洞。
共價鍵結
利用共價鍵結來輔助孔洞的形成，最早是由 Wulff 研究團隊 1977 年
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(Wulff et al., 1977a; Wulff et al., 1977b)提出，將模版分子 phenyl--D-mannopyranoside (24a) 與兩分子的 4-vinylphenylboronic acid 單體 (24b) 反應形成共價鍵結後，再加入大量的交聯試劑二甲基丙烯酸乙二醇酯 (ethylene glycol dimeth acrylate, EGDMA) 在 惰 性 溶 劑 中 共 同 聚 合 (copolymerization) 製備出分子模版高分子（圖四十一），接著利用水或 甲醇可以移除 95% 的模版 (Wulff and Schauhoff, 1991)。
圖四十一、Phenyl--D-mannopyranoside 24 之分子模版高分子(Wulff et al., 1977b)。
非共價鍵結
利用非共價鍵結來輔助孔洞的形成，最早是由 Mosbach 與 Shea 的
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研究團隊將 L-phenylalanine anilide (25) 做為模版分子，methacrylic acid 為單體（圖四十二），利用模版分子與單體之間存在靜電與氫鍵的非共 價鍵結作用力形成分子孔洞，讓分子模版應用更廣。
圖四十二、L-Phenylaniline anilide 25 模版高分子(Sellergren et al., 1988)。
2.1.4 研究動機
核苷酸鹼基 (nucleotide bases) 分子模版高分子的研究，最早是由 Shea 研究團隊於 1993 年合成 9-ethyladenine 模版高分子開啟了核苷酸鹼 基分子模版高分子的研究 (Shea et al., 1993; Spivak et al., 1997; Spivak and Shea, 1998)。2010 年 Scorrano 等人利用甲基丙烯酸 (methacrylic acid, MAA 27) 當成單體 (monomer) 、二甲基丙烯酸乙二醇酯 28 當成交聯 劑 (crosslinker) (圖四十三) 以及乙氰/水(4/1, v/v)混合溶劑當成致孔劑，
製備辨識 1-methyladenosine 26 的 1-methyladenosine 模版高分子。實驗結
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果顯示所製備的分子模版高分子在 adenosine 29、 2’-deoxyadenosine 10、cytidine 30、inosine 31 同時存在下僅對 1-methyladenosine 26 具有專 一選擇性 (圖四十四)。
圖四十三、模版分子 1-methyladenosine 26、甲基丙烯酸 27 單體與二甲 基丙烯酸乙二醇酯 28 交聯劑之構造。
圖四十四、1-methyladenosine 26 分子模版高分子與不同核苷酸鹼基之結 合常數。
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除此之外，作者也將此 1-methyladenosine 26 分子模版高分子做為固 相萃取（MIP-SPE）的填充材料，並將加入 1-methyladenosine 26 的尿液 樣本進行固相萃取並以乙氰/水/醋酸 (4/1/1, v/v/v) 之混合液沖提。利用 高效液相層析分析（圖四十五），可看到經過固相萃取可將尿液中的間 質去除。
圖四十五、高效液相層析圖譜。(A) 尿液樣品、(B) 加入 1-methyladenosine 26 的尿液樣品以及(C)將加入 1-methyladenosine 26 的尿液樣品經過分子 模版高分子萃取 (Scorrano et al., 2010)。
間質影響 (matrix effect) 是分析生物樣品時最大的干擾，因此可以 發展對分析物具專一性鍵結之分子模版高分子作為固相萃取或是層析 管柱填充材料，提高分析之靈敏度。在本論文第一部份已經由動物實驗
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證實黃樟素代謝產物 SFO 3 在體內會攻擊 DNA 產生 SFO-DNA 加成產 物，為了進一步探討 SFO 的基因毒性，我們將分析給予黃樟素代謝產 物 SFO 3 的老鼠不同器官之組織 DNA，並經由酵素將組織 DNA 水解 後 分 析 N1-SFO-dAdo 11 與 N6
-SFO-dAdo 12 的 生 成 量 。 由 於 N1-SFO-dAdo 11 會經由 Dimroth rearrangement 重排成 N
6-SFO-dAdo
12，所以我們會在鹼性條件下將 N1-SFO-dAdo 11 重排成 N6-SFO-dAdo
12 並在分析之前利用 C18 之固相萃取匣進行樣品的純化以及預濃縮，因此我們想發展可辨識 N6
-SFO-dAdo 12 分子模版高分子（圖四十六）
取代傳統固相萃取，做為組織 DNA 酵素水解後純化與預濃縮固相萃取 材料。
圖四十六、DNA 加成產物 N6
-SFO-dAdo 12 分子模版高分子。
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2.2 結果與討論
由於所合成之 N6
-SFO-dAdo 12 量非常的少，我們先依照文獻的實
驗方法先合成 2’-去氧腺嘌呤 10 模版高分子，建立分子模版高分子技術。
2.2.1 2’-去氧腺嘌呤 (2’-deoxyadenosine, 2’-dAdo 10) 與甲基丙烯酸 (methacrylic acid, MAA 27) 結合之變溫 NMR 量測
本實驗開始之初參照文獻 (Scorrano et al., 2010) 在 60 oC 下加熱進 行分子模版高分子之聚合反應，並利用乙氰/水/醋酸 (4/1/1, v/v/v) 之混 合液將模版分子洗去，但得到之分子模版高分子經測試並不具任何分子 鍵結能力，同時掃瞄式電子顯微鏡 (scanning electron microsope, SEM) 拍攝所得到的 MIP 形態 (morphology) (圖四十七) 也與文獻上所報導這
類分子模版高分子會有花椰菜的形態不同，因此我們推測在 60 oC 下，
模版分子與單體 27 之間的氫鍵作用力已經不存在因此無法得到具辨識 效果孔洞之分子模版高分子。
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圖四十七、利用熱化學法 (60 oC) 製備 2’-去氧腺嘌呤模版高分子之掃瞄 式電子顯微鏡圖。
由於文獻上報導，當 2’-去氧腺嘌呤上的鹼基與醋酸間有氫鍵作用力 存在時，2-H 與 8-H 隨著溫度降低時會分別往高磁場區 (upfield) 與低磁 場(downfield) 區位移 (附圖三十九) ( Rao et al., 1999; Basilio Janke et al.,
2004) 為了找尋最佳化反應條件，我們將2’-去氧腺嘌呤與甲基丙烯酸配
製在合成分子模版高分子 (molecular imprinting polymer, MIP) 時的 CD3CN/D2O = 4:1 混合溶劑，利用1H NMR 進行變溫實驗，探討 2’-去氧 腺嘌呤與甲基丙烯酸之間的氫鍵作用。
根據文獻上的研究我們將 25 oC 所測得之 1H NMR 光譜，化學位移
8.17 ppm 與
8.20 ppm 的訊號分別定為 2’-去氧腺嘌呤上 2-H 與 8-H 的訊號（圖四十八）(Narukulla et al., 2008)。從變溫實驗中，我們可以看 到在 55 oC 所測得之1H NMR 光譜，化學位移
8.19 ppm 為 2-H 與 8-H 重疊在一起之訊號隨著溫度降低氫鍵作用越強，2-H 會朝高磁場區移動99
而 8-H 會朝低磁場區移動，可確定一開始所使用加熱 (60 oC) 進行模版 高分子聚合反應已經破壞了模版分子與甲基丙烯酸單體 27 之間的氫 鍵，因此我們修改反應方法利用照光裂解產生自由基進行分子模版高分 子聚合。
圖四十八、2’-去氧腺嘌呤 10 與甲基丙烯酸 27 以 1:14 之莫耳比例混合 後，進行變溫實驗之1H NMR 光譜(500 MHz, CD3CN/D2O = 4:1)。
2.2.2 2’-去氧腺嘌呤模版高分子之聚合
為了監控 2’-去氧腺嘌呤模版高分子的聚合，將 2’-去氧腺嘌呤 10、
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甲基丙烯酸 27、甲基丙烯酸乙二醇酯 28 與偶氮二異丁腈 32 以 1 : 14 : 75: 9 的莫耳比例配製在 CD3CN/D2O = 4:1 之氘溶劑中，並利用1H NMR 進行反應的監控。從圖四十九可看到，隨著時間增加氫譜的訊號逐漸變 寬而可以知道利用 UV 燈 (365 nm) 在 0 oC 下照射一分鐘反應 16 小時 後雖然沒有看到固體的生成，但是從氫譜的訊號逐漸變寬（圖四十九 C）
可以確認知道聚合反應的進行。
圖四十九、2’-去氧腺嘌呤 10、甲基丙烯酸 27、甲基丙烯酸乙二醇酯 28 以 1 : 14 : 75 和偶氮二異丁腈 29 反應監控之1H NMR 光譜圖 (300 MHz, CD3CN/D2O = 4:1)。（A）未光照之混合液、(B) 在 0 oC 下以 UV 燈（365 nm）進行光照 1 分鐘、（C）聚合反應 16 小時。
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除此之外所得之高分子固體，利用掃瞄式電子顯微鏡 (scanning electron microsope, SEM) 拍攝所得到的 MIP 的形態(morphology) (圖五 十 A)，與文獻報導此類的分子模版高分子會有類似花椰菜(cauliflower) 的形態 (圖五十 B) 相似 (Scorrano et al., 2010)。
圖五十、分子模版高分子的掃瞄式電子顯微鏡圖。(A) 2’-去氧腺嘌呤模 版高分子；(B)文獻之 1-Methyladenosin 模版高分子 (Scorrano et al., 2010)。
2.2.3 2’-去氧腺嘌呤模版高分子之鍵結能力
為了評估所得之 2’-去氧腺嘌呤 10 分子模版高分子是否具有鍵結能 力 ， 我 們 將 2’- 去 氧 腺 嘌 呤 10 溶 液 加 入 MIP ( 實 驗 組 ) 與 NIP (non-imprinting polymer)（控制組）混合隔夜偵測溶液中 2’-去氧腺嘌呤 10 濃度是否減少。從圖五十一可以得知，只有加入 MIP 溶液中 2’-去氧
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腺嘌呤 10 濃度有減少，同時隨著加入 MIP 的量增加溶液中 2’-去氧腺嘌 呤 10 濃度也減少，更可以證明我們所合成之分子模版高分子對 2’-去氧 腺嘌呤 10 具有再鍵結 (rebind) 的能力。
圖五十一、2’-去氧腺嘌呤 10 (1 mM) 加入模版高分子 (20 mg、40 mg) 與非模版高分子 (non-imprinting polymer, NIP 20 mg) 反應隔夜後，注入 25 L 澄清液，溶液中未鍵結之 2’-去氧腺嘌呤 10 之高效液相層析圖。
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