黃樟素 (Safrole) 1 - 2’,3’-環氧黃樟素與 DNA 鹼基反應所形成加成產物之探討

第一章 2’,3’-環氧黃樟素與 DNA 鹼基反應所形成加成產物之探討

1.1.3 黃樟素 (Safrole) 1

黃樟素 1 是黃樟油 (sassafras oil) 的主要成分，同時也存在於一些 香料中，如：羅勒 (basil) 、豆蔻 (nutmeg)、肉桂 (cinnamon)、黑胡椒 (black pepper)中(Munerato et al., 2005; Ueng et al., 2004)。目前被國際癌症研究署（International Agency for Research on Cancer, IARC）歸類為 2B（可能對人類造成致癌）的化合物 (IARC, 1976)。歐盟共同體食物科學委員會 (The Scientific Committee for Food of the European Union) 估計每人 (以體重60 kg計) 每日黃樟素平均攝取量0.3 mg，而聯合國糧農榔者大(Lin, 2002)，因此近年來對於嚼食檳榔與口腔癌(Hsieh et al., 2001) 或肝癌之間的相關性是否與黃樟素 1 的暴露有關一直是生物學家所感 興趣的課題。

1.1.4 黃樟素 1 致癌機制的相關研究

黃樟素 1 被攝取進入人體後，在體內會被代謝成1’-羥基黃樟素 (1’-hydroxysafrole 2) (Borchert et al., 1973b; Stillwell et al., 1974)、2’,3’-環氧黃樟素(safrole 2’,3’-oxide, SFO 3) (Wislocki et al., 1976)、3’-羥基黃 樟素(3’-hydroxysafrole 4) (Benedetti et al., 1977) 與1,2-羥基-4-烯丙基苯 (1,2-dihydroxy-4-allylbenzene 5) (Benedetti et al., 1977)（圖三）。從生理為基礎的動力學 (physiologically based biokinetic, PBBK) 模式代入體外代 謝參數計算，給予黃樟素 1 (300 mg/kg body weight) 的老鼠黃樟素代謝 產物 2、4、5與 7 的量分別為黃樟素 1 的10.0%、7.7%、74.0%與6.9%

(Martati et al., 2011)。

過去的文獻報導，給老鼠餵食黃樟素 1 之後，發現老鼠的尿液中 有1’-羥基黃樟素 2 的生成(Borchert et al., 1973b; Stillwell et al., 1974)。

1976 年， Wislocki 等人 (Wislocki et al., 1976) 給予老鼠服用 [2’, 3’-³H]-1’-hydroxysafrole，發現肝臟內之DNA (hepatic DNA)、核醣體RNA (ribosomal RNA) 和蛋白質含有³H的衍生物，而這些主要是親電基在體 內反應產生的致癌物質，因此黃樟素代謝產物 2 一直被認為是黃樟素 1 代謝過程中與體內DNA反應活性最大之致癌物，也是黃樟素的最終代 謝產物 (Borchert et al., 1973a; Borchert et al., 1973b)。

圖三、黃樟素 1 之代謝 (Martati et al., 2011)。

當黃樟素代謝產物 1’-羥基黃樟素 2 與 2’-去氧鳥糞嘌呤(2’-deoxy- guanosine, 2’-dGuo) 反應，主要形成 N²-(trans-isosafrole-3’-yl)-2’-deoxy- guanosine 8 與 N²-(safrole-1’-yl)-2’-deoxyguanosine 9 (圖四)兩個 DNA 加 成產物(Chung et al., 2008)。

圖四、1’-羥基黃樟素 2 的 DNA 加成產物：N²-(trans-isosafrole-3’-yl) - 2’-deoxyguanosine 8 (Phillips et al., 1981) 與 N²-(safrole-1’-yl)-2’- deoxyguanosine 9 (Chung et al., 2008)。

圖五、³²P 同位素標記分析黃樟素 DNA 加成產物，Spot 1:加成產物 8 與 Spot 2: 加成產物 9，關於 spots 3 和 4 仍然不清楚其構造。(A)在 HepG2 細胞中加入 1’-羥基黃樟素 2 (400 mM) 培養 24 小時; (B)未加入 1’-羥基 黃樟素 2 的控制組; (C, D) 嚼食檳榔者之白血球細胞(對照組) (Liu et al., 2004)。

2004 年，Liu 等人在 HepG2 細胞中加入黃樟素的代謝產物 1’-羥基

黃樟素 2 一起培養，利用 ³²P-後標籤法分析得到圖五-A，與有嚼食檳榔

病史者的白血球細胞圖五-C、D 的自動放射顯影片比較，確定嚼食檳榔者的白血球細胞會有 1’-羥基黃樟素 2 的 DNA 加成產物: N²-(trans-iso safrole-3’-yl) -2’-deoxyguanosine 8 (spot 1)^生成(Liu et al., 2004)。除此之外，2008 年 Liu 等人也利用 ³²P-後標籤法分析 28 位嚼食檳榔 10 年之久 的肝腫瘤患者，並在其中 2 位病患肝組織中分析到加成產物 8 (Chung et al., 2008)。

而另一具親電反應之黃樟素代謝產物 2’,3’-環氧黃樟素 3，雖然在沙 門氏菌(Salmonella typhimurium) TA1535 和 TA100 的安姆氏試驗(Ames Test)中發現黃樟素代謝產物 3 具有中度致突變性 (moderate mutagenicity) (Swanson et al., 1979; Wislocki et al., 1977)，並且會造成人類肺癌細胞

體外反應，利用 ³²P-後標籤法分析發現至少有九個加成產物生成 (圖六

-A 與圖六-B)。

圖六、³²P 同位素標記分析 2’,3’-環氧黃樟素 DNA 加成產物。 （A）2’,3’-環氧黃樟素 3 與小牛胸腺 DNA 之反應;（B）2’,3’-（A）2’,3’-環氧黃樟素 3 與 2’-去氧鳥糞核苷之反應；(C) 靜脈注射單一劑量黃樟素 1 (97.3 mg/kg body weight) 之老鼠肝臟 DNA:老鼠體內生成之黃樟素 DNA 加成產物分別以 a-d 標示; (D)正常老鼠之肝臟 DNA（控制組）; (E）靜脈注射單一劑量 2’,3’-環氧黃樟素 3 (106.9 mg/kg body weight)。(Qato and Guenthner, 1995)

同時在分析給予單一劑量黃樟素 1 (97.3 mg/kg body wt) 之老鼠肝 臟中，也有發現黃樟素 DNA 加成產物生成 (圖六-C)，但在同樣給予單

一劑量黃樟素代謝產物 3 (106.9 mg/kg body wt) 之老鼠肝臟 DNA (圖六 -E) 與沒有藥物暴露之老鼠肝臟 DNA 比較發現並無任何黃樟素代謝產 物 3 相關的 DNA 加成產物生成，作者推測此結果主要是因為黃樟素代 謝產物 3 可以經由麩胺基硫轉移酵素 (glutathione S-transferases, GSTs) 和環氧化合物水解酶 (epoxide hydrolases, EHs) 去毒化的過程代謝掉 ( Luo et al., 1992; Luo and Guenthner, 1994, 1995)，所以無法在體內形成 黃樟素代謝產物 3 相關的 DNA 加成產物，因此黃樟素代謝產物 3 一直 被認為不具有任何基因毒性。

1.1.5 DNA 加成產物的分析方法

³²P-後標籤法（³²P-postlabeling）、免疫分析法 ( immunoassays)、

電化學檢測法 (electrochemical detection, ECD)、螢光偵測 (fluorescence detection)與質譜法 (mass spectrometry)都是用來定量 DNA 加成產物的方法 (Himmelstein et al., 2009)。在複雜的生物樣品中定量這些超微量的 DNA 加成產物，必須考慮方法之高專一性與高靈敏性 (Himmelstein et al., 2009; Koc and Swenberg, 2002)，³²P-後標籤法是這些方法中最具高靈敏度（～1 adduct per 10⁹ normal base）卻缺乏高專一性，其他的方法則是具高專一性缺乏高靈敏度，由於此方法必須利用聚核苷酸激酶 (polynucleotide kinase, PNK) 將 [-³²P]ATP 上之³²P-orthophosphate 轉移

到 2-deoxyribose 上 5’-OH 端 (Phillips and Arlt, 2007)，因此此方法最大 的缺點就是不適合用於醣苷鍵不穩定（例如：N7-alkylguanine adducts）

之 DNA 加成產物的分析 (Himmelstein et al., 2009; Koc and Swenberg, 2002; Swenberg et al., 2007)。

從 1990 年代開始，同位素稀釋質譜法 (isotope dilution mass al., 1992; Krause et al., 1997; Faller et al., 2001;Csanady et al., 2003; Wu et

isotope dilution) 高效液相層析電噴灑游離串聯質譜法 (high performance liquid chromatographyelectrospray ionization-tandem mass, HPLCEIS-MS/MS) 定量體外與體內黃樟素代謝產物 3 之 DNA 加成產物的量。

式圖一、實驗流程圖。

SFO 3 與 2’-deoxyadenosine (2’-dAdo, 10)、adenine (Ade, 15)、

2’-deoxyguanosine (2’-dGuo, 18)、2’-deoxycytidine (2’-dCyt, 20) 和 thymidine (dThd, 22)之 DNA 加成產物之合成、純化與結構鑑定

合成¹⁵N 同位素標定之 DNA 加成產物

發展穩定同位素烯釋高效液相層析電噴灑游離串聯質譜法定量 SFO 3 與小 牛胸腺 DNA 反應之 DNA 加成產物

偵測給予 SFO 3 之老鼠體內是否會生成 SFO-DNA 加成產物

1.2 結果與討論

1.2.1 合成黃樟素代謝產物 2’,3’-環氧黃樟素(safrole 2’,3’-oxide, SFO 3) 黃樟素 (safrole, 1) 代謝產物 ( ± )-2’,3’- 環氧黃樟素 (( ± )-safrole 2’,3’-oxide, (±)-SFO 3) 並無法經由商業採購取得，因此參照文獻 (Noller and Kneeland, 1946) 之方法製備合成 (式圖二)。

式圖二、黃樟素代謝產物 ()-2’,3’-環氧黃樟素 3 的合成。

1.2.2 2’,3’-環氧黃樟素 DNA 加成產物之合成、純化與結構鑑定

1.2.2.1 黃樟素代謝產物 (±)-3 與 2’- 去氧腺嘌呤 (2’-deoxyadenosine, 2’-dAdo 10) 之反應

式圖三、2’-去氧腺嘧啶 10 與()-SFO 3 之加成產物 N1-SFO-dAdo 11 與

N

⁶

-SFO-dAdo 12 的合成。

圖七、(A) (±)-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 在 pH 7.4, 37^oC 下反應 72 小時 與(B) (±)-SFO 3 在 pH 7.4, 37^oC 下反應 72 小時之高效液相層析圖譜。(C) 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 與(D)加成產物 N⁶

-SFO-dAdo 12 之 UV 吸收

光譜圖。

將黃樟素代謝產物()-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 (2’-deoxy- adenosine, 2’-dAdo 10) 在生理條件下 (pH 7.4, 37^oC) (式圖三) 反應 72 小時，然後 利用高效液相層析儀分析會有兩個吸收峰生成： t_R = 18.6 min 與 tR = 23.2 min 分別為 N1-SFO-dAdo 11 與 N⁶

-SFO-dAdo 12 (圖七)，將其分別收集

後利用電噴灑游離法 (electrospray ionization, ESI) 鑑定其分子量（圖八）。得到 N1-SFO-dAdo 11 之質荷比為: m/z 430 ([M + H]⁺)、452 ([M + H + Na]⁺)與 314 ([M - 2’-deoxyribose + H]⁺)，而 N⁶

-SFO-dAdo12 之質荷比

為：m/z 430 ([M + H]⁺)、453 ([M + H + Na]⁺)與 314 ([M - 2’-deoxyribose + H]⁺)，可以確定兩者皆為 10 接上 (±)-3 之後的 DNA 加成產物，因此我們 利用高效液相層析儀分離上述二產物並收集樣品進行核磁共振結構鑑定。

圖八、DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 和 N⁶

-SFO-dAdo 12 正離子模式

下之電噴灑游離質譜圖。

1.2.2.1.1 DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 之結構鑑定

圖九、DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。

加成產物 11 之 ¹H NMR 光譜上化學位移



6.33 之三重峰是 2-deoxyribose 上的 1’-H，因此從 HMQC 光譜圖 (附圖十四) 中將與 1’-H

4.27)。最後從 C-2 和 C-6 與 '-H 和 "-H 確認加成產物 11 為 2’-去氧腺嘌呤上 N1 位置 alkylation 的 N1-SFO-dAdo (圖九和表二)。

表二、¹H and ¹³C Chemical Shifts (), Spin-Spin Coupling Constants, J_H,H(Hz) of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N1-SFO-dAdo 11.

proton^e  (ppm) multiplicity J_H,H (Hz) carbon (ppm)  HMBC

Unresolved multiplet due to a mixture of diastereomers. [c] n.d. denotes not detected. [d] Signals of H-2”

and H- were overlapped. [e] Separated shifts due to a mixture of diastereomers. [f] Selective decoupling of

H-2’ or H-2”. [g] Proton NMR spectra measured in an 800 MHz spectrometer.

圖十一、DNA 加成產物 N⁶

-SFO-dAdo 12 之 H,H-COSY (500 MHz,

d

6-DMSO) 光譜圖。

表三、¹H and ¹³C Chemical Shifts (



), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H (Hz) of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N⁶

-SFO-dAdo 12.

proton^[a]  (ppm) multiplicity J_H,H (Hz) carbon  (ppm)^[a]

Unresolved multiplet due to a mixture of diastereomers. [c] Signals of 2’-H and ”-H were overlapped. [d]

Signals of 4’-H and -H were overlapped. [e] n.d. denotes not detected. [f] Signals were overlapped with solvent. [g] Signals of 5’-H and -H were overlapped. [h] Signals of 8-H and HCOO^ were overlapped. [i]

Selective decoupling of 2’-H or 2”-H. [j] Proton NMR spectra measured in an 800 MHz spectrometer.

1.2.2.2 黃樟素代謝產物(R)-(+)-Enriched-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 之反應

黃樟素代謝產物(±)-3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 所生成之 DNA 加成產物

N1-SFO-dAdo 11 的碳譜訊號有些會分裂成兩組，主要是因為環氧代謝產

物與核苷酸反應後生成之加成產物為非對映異構體 (diastereomer)，造成 NMR 訊號的不同，這樣的結果也與文獻上所得到的結果一致 (Olsen et al., 2005)。為了清楚區別這些分裂的訊號哪一組是屬於 (R)-或(S)-的 3 反應 所得加成產物的訊號，進一步嘗試合成具光學活性的 3 進行核磁共振光譜 的探討。

1.2.2.2.1 合成具光學活性之(R)-(+)-enriched-SFO 3

式圖四、(R)-(+)-enriched SFO 3 的合成。

我們參考文獻合成具有光學活性的黃樟素代謝產物 3 (Mohan and Rao, 1998) ，合成之流程圖如式圖四。首先利用 Sharpless asymmetric dihydroxylation 合成化合物 13，[²⁵ = +21.7^o (c, 0.003, CH2Cl2)，再利用手性高效液相層析(chiral HPLC)分離決定其對映體過量百分率為 96.0%

(percent enantiomeric excess)（附圖三(a)）。但是在化合物 14 ，[²⁵ = +12.5^o (c, 0.002, CH2Cl2)對映體過量百分率只有 39.7% (附圖三(b))。同樣利用手 性高效液相層析來分離化合物 3 (附圖三(c))，得到之層析峯面積比為 2:1，

optical rotation 分別為[²⁵ = +11.8^o (c, 0.003, CH2Cl2)、 [²⁵ = -11.6^o (c,0.003, CH2Cl2)，對映體過量百分率為 39.3%的黃樟素代謝產物 3。

1.2.2.2.2 2’-去氧腺嘌呤 DNA 加成產物 (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 與 (R)-enriched-N⁶

-SFO-dAdo 12 之結構鑑定

式圖五、2’- 去氧腺嘌呤 10 與 (R)-(+)-enriched SFO 3 之加成產物 (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 與(R)-enriched-N⁶

- SFO-dAdo 12 的合成。

圖十二、DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11（下圖）與(R)-enriched-N1-SFO- dAdo 11（上圖）之¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO)光譜圖疊圖。

雖然只得到(R)/(S)為 2:1 的(R)-(+)-enriched-SFO 3 , 但是預期所得之 DNA 加成產物 (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 與 (R)-enriched-N⁶

-

SFO-dAdo 12 的 ¹³C NMR 光譜圖應該也會有 2:1 的訊號強度，因此利用 (R)-(+)-enriched-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 反應。

圖十三、 DNA 加成產物 (A) N1-SFO-dAdo 11 與 (B) (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 之手性高效液相層析圖。

從圖十二可以看到 (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 碳譜分裂的訊號具 有 2:1 的訊號強度，可以定出 N1-SFO-dAdo 11 分裂的碳譜中屬於 (R) 或 (S) 的訊號，除此之外我們也嘗試利用 Chiral HPLC 搭配 AS-H (4.6*250 mm, 5

m) 之手性層析管柱，在 isopropanol/hexane 為動相的條件下成功

的分離非對映異構體 N1-SFO-dAdo 11 與(R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11，

並分別得到 1:1 與 2:1 之訊號強度 (圖十三)。

不過很可惜，N⁶

-SFO-dAdo 12 與 (R)-enriched-N

⁶

-SFO-dAdo 12 不論

在 ¹³C NMR 光譜（圖十四）或手性高效液相層析都無法區分。

(R)-11

(S)-11 (R)-11

(S)-11

圖十四、DNA 加成產物 N⁶

-SFO-dAdo 12 (下圖）與(R)-enriched-N

⁶

-

SFO-dAdo 12（上圖）之¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖疊圖。

1.2.2.3 N1-SFO-dAdo 11 經由 Dimroth rearrangement 重排形成

N

⁶

-SFO-dAdo 12

根據過去文獻上環氧黃樟素代謝產物 (propylene oxide, butadiene oxide, styrene oxide)與 2’-去氧腺嘌呤 10 反應的研究中知道，2’-去氧腺嘌 呤 10 上的 N1 是進行親核反應形成 N1-dAdo 加成產物的主要位置，再經 由 Dimroth rearrangement 形成 N⁶-dAdo 加成產物。Dimroth rearrangement 反應機制主要是經由鹼催化打開 2’-去氧腺嘌呤 10 的六員環再重新合環

(recyclization)使得環上的氮原子(N1)與環外的氮原子(N⁶)位置交換 (圖十 五) 形成 N⁶-dAdo 加成產物 (Kim et al., 2000)。

圖十五、Dimroth rearrangement 反應機制圖。

圖十六、N1-SFO-dAdo 11 在 0.2N K2HPO4 (pH 7.4)，37 ^oC 下進行 Dimroth rearrangement 反應轉換成 N⁶

-SFO-dAdo 12 之高效液相層析圖譜。

為了印證 Dimroth rearrangement 的反應，我們將 N1-SFO-dAdo 11 配 製在 0.2 N K₂HPO4 (pH 7.4) 的溶液，並在 37 ^oC 下利用高效液相層析儀監控其重排反應（圖十六），實驗結果顯示在此條件下反應 24 小時後會有 一半量的 N1-SFO-dAdo 11 經由重排反應轉換成 N⁶

-SFO-dAdo 12。

在 styrene oxide (SO)與 2’-去氧腺嘌呤反應所形成不同的方位異構物 (regioisomer) 加成產物中，不同於 styrene oxide，此反應中 2’-去氧腺嘌呤並無攻擊 SFO 的位置與去氨基 N1-肌嘌呤(N1-inosine, N1-dIno) 的加成產

在文檔中 2',3'-環氧黃樟素所形成DNA加成產物之體外與體內研究 (頁 33-0)