國立交通大學
應用化學系博士班
博士論文
2’,3’-環氧黃樟素所形成 DNA 加成產物
之體外與體內研究
In vitro and in vivo studies of safrole 2’,3’-oxide induced
DNA adducts
研究生：沈瑮卿
指導教授：鍾文聖 博士
共同指導：吳焜裕 博士
2’,3’-環氧黃樟素所形成 DNA 加成產物
之體外與體內研究
In vitro and in vivo studies of safrole 2’,3’-oxide induced
DNA adducts
研究生：沈瑮卿 Student : Li-Ching Shen 指導教授：鍾文聖 博士 Advisor : Wen-Sheng Chung 共同指導：吳焜裕 博士 Co-advisor : Kuen-Yuh Wu
國立交通大學 應用化學系博士班
博士論文 A Thesis
Submitted to Ph. D. Program, Department of Applied Chemistry College of Science
National Chiao Tung University
in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of
Doctor of Philosophy in
Applied Chemistry
September 2012
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
i
2’,3’-環氧黃樟素所形成 DNA 加成產物之體外與體內研究
學生：沈瑮卿 教授 教授 國立交通大學應用化學系博士班 摘 要 本論文第一部份首先合成黃樟素代謝產物 3 分別與 2’-去氧腺嘌呤 (2’-deoxyadenosine, 2’-dAdo 10)、腺嘌呤 (adenine, Ade 15)、2’-去氧鳥糞嘌呤 (2’-dexoyguanosine, 2’-dGuo 18)、2’-去氧胞嘧啶(2’-de oxycytidine, 2’-dCyt 20) 和胸腺嘧啶 (2’-thymidine, 2’-dThd 22)以及[15N5]-10 和 [15N5]-18 進行反應之
加 成 產 物 的 單 離 與 鑑 定 。 分 離 且 鑑 定 的 產 物 分 別 有 N1-SFO-dAdo 11 (4.2%)、N6-SFO-dAdo 12 (4.5%)、N3-SFO-Ade 16 (1.0%)、N9-SFO-Ade 17 (2.4%)、N7-SFO-Gua 19 (16%)、N3-SFO-dUrd 21 (3.8%) 和 N3-SFO-dThd
ii
為了探討黃樟素代謝產物 3 是否會攻擊 DNA 形成 DNA 加成產物，選擇 文獻上較先探討的嘌呤加成產物 11、12、16 和 19 當成生物指標，利用同位 素 稀 釋 (isotope dilution) 高 效 液 相 層 析 電 噴 灑 游 離 串 聯 質 譜 法 (liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry, LCESI-MS/MS)定量這些加成產物體內與體外的生成量。體外實驗，將黃樟 素代謝產物 3 與小牛胸腺 DNA (Calf thymus DNA)反應，得到每 106個核苷酸
(nucleotides) 中有 2000 個加成產物 11、170 個加成產物 12、660 個加成產物 16 以及 2670 個加成產物 19。接著以靜脈注射方式給予老鼠單一劑量之黃樟 素代謝產物 3 (30 mg/kg body weight)並成功分析到尿液中加成產物 19，證實 了黃樟素代謝產物 3 在體內會攻擊 DNA 產生 DNA 加成產物。 本論文第二部份是製備 2’-去氧腺嘌呤模版高分子。本研究將模版分子 10、甲基丙烯酸 27 單體、二甲基丙烯酸乙二醇酯 28 交聯劑與偶氮二異丁腈 29 在乙氰/水 (4/1, v/v)之混合液，在 0 oC 下利用波長 365 nm 之紫外光燈源 照射，進行聚合反應並利用索氏萃取(Soxhlet extraction)將模版分子移除得到 具吸附 2’-去氧腺嘌呤專一性之模版高分子。
iii
In vitro and in vivo studies of safrole 2’,3’-oxide induced DNA adducts
Student : Li-Ching Shen Advisor : Wen-Sheng ChungCo-advisor : Kuen-Yuh Wu Ph. D. Program, Department of Applied Chemistry
National Chiao Tung University ABSTRACT
In the first part of this thesis, we synthesized SFO 3 and characterized the DNA adducts from the reactions of 3 with 2’-deoxyadenine (2’-dAdo, 10), adenine (Ade, 15), 2’-deoxyguanosine (2’-dGuo, 18), 2’-deoxycytidine (2’-dCyt,
20), and thymidine (Thd, 22) to investigate the SFO-DNA adducts formed in
vivo and in vitro. The reactions of 3 with 10, 15, 18, 20, and 22 were carried out
under physiological conditions (pH 7.4, 37 oC) which gave five adducts
N1-SFO-dAdo (11) (4.2%), N6-SFO-dAdo (12) (4.5%), N3-SFO-Ade (16) (1.0%), N9-SFO-Ade (17) (2.4%), N7-SFO-Gua (19) (16%), N3-SFO-dUrd (21) (3.8%), and N3-SFO-Thd (23) (1.6%). Moreover, 15N labeled analogs of adducts [15N5]-11, [15N5]-12, and [15N5]-19 were synthesized to serve as internal
iv
A newly-developed isotope-dilution high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLCESI-MS/MS) was developed to investigate the SFO-DNA adducts in
vitro and in vivo. In vitro study, the reaction of 3 with Calf thymus DNA showed
that the levels of 11, 12, 16, and 19 were determined to be 2000, 170, 660, and 2670 adducts per 106 nucleotides. Subsequently, we measured the amount of adduct 19 in the urine of mice after intraperitoneally treatment with a single dose of 3 (30 mg/kg body weight). These results suggested that 3 can cause in
vivo formation of DNA adducts.
In the second part of this thesis, we attemped to prepare a molecularly imprinted polymer (MIP) for 2’-deoxyadenosine 10. A mixture of 2’-deoxyadenosine 10, methacrylic acid (MAA, 27), ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA, 28), and 2, 2’-azoisobutyonitrile (AIBN, 29) in acetonitrile/water (4/1) was initiated by UV light (365 nm) at 0 oC for 16 houres to obtain a polymer. The polymer after Soxhlet extraction to remove the 2’-deoyxadenosine was found to be a specific receptor for 2’-deoxyadenosine.
v 謝誌 會唸博班最先要感謝的是台大吳焜裕老師，因為吳老師的支持、鼓勵 與引導，我來到了鍾文聖老師實驗室，挑戰了我最害怕的有機化學。感謝 吳焜裕老師的指導有了這個研究，感謝鍾文聖老師的指導讓整個研究跨出 了第一步，感謝江素瑛老師動物實驗的指導與協助讓研究更完整，尤其感 謝這三位老師在文章發表的過程中，大家接力賽般不厭其煩的幫我修改， 讓文章順利被接受。 駑頓的我這一路走來除了要比別人更加努力，也多虧一路上幫助我的 人，其中特別要感謝學妹佳蓁與台大職衛所學弟明煥。佳蓁，一個陪我哭 陪我笑的朋友，在這幾年不論研究上或生活上都會給我意見與幫忙；明煥 體諒我通車到台北做實驗，總是事先幫我準備實驗器材，事後幫我收拾善 後，為的就是幫我爭取更多的實驗時間，每當離開公衛大樓已經接近十二 點時，也陪著我在冷清的台北街頭走到車站才離開，真的非常謝謝他們兩 位。 要感謝的人真的太多太多了，實驗室羅鈞博士、怡婷學姐、豪志學長、 永育、雨筠、小華、冠彰、偉新、孟榆、英材、映蓉、亨哲、亭伶，在我 遇到困難時給我幫忙，心情低落時陪伴我，真的謝謝你們。 最後也要感謝老公至賢的支持，婆婆幫忙照顧小孩才能讓我專心的完 成學業。
vi 目錄 中文摘要 ··· i 英文摘要 ... iii 謝誌 ... v 表目錄 ... xii 圖目錄 ... xiv 式圖目錄 ... xxi 附圖目錄 ... xxii 第一章 2’,3’-環氧黃樟素與 DNA 鹼基反應所形成加成產物之探討 1.1 緒論 ... 1 1.1.1 DNA 加成產物 ... 1 1.1.2 DNA 加成產物的修復和癌症的關係... 2 1.1.3 黃樟素 (Safrole) 1 ... 4 1.1.4 黃樟素 (Safrole) 1 致癌機制的相關研究 ... 5 1.1.5 DNA 加成產物的分析方法 ...10 1.1.6 研究動機 ... 11 1.2 結果與討論 ...14
vii
1.2.1 合成黃樟素代謝產物 2’,3’-環氧黃樟素(safrole 2’,3’-oxide, SFO 3) ...14 1.2.2 2’,3’-環氧黃樟素 DNA 加成產物之合成、純化、結構鑑定 ...14 1.2.2.1 黃樟素代謝產物(±)-3 與 2’-去氧腺嘌呤 (2’-deoxyadenosine, 2’-dAdo 10)之反應 ...14 1.2.2.1.1 DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 之結構鑑定 ...17 1.2.2.1.2 DNA 加成產物 N6-SFO-dAdo 12 之結構鑑定 ...21 1.2.2.2 黃樟素代謝產物(R)-(+)-enriched-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 之反應 ...24 1.2.2.2.1 合成具光學活性之 (R)-(+)-enriched-SFO 3 ...24 1.2.2.2.2 2’- 去 氧 腺 嘌 呤 DNA 加 成 產 物 (R)-enriched-
N1-SFO-dAdo 11 與(R)-enriched-N6-SFO- dAdo 12 之 結構鑑定 ...25 1.2.2.3 N1-SFO-dAdo 11 經 由 Dimroth rearrangement 重 排 形 成
N6-SFO-dAdo 12 ...28 1.2.2.4 黃樟素代謝產物(±)-3 與腺嘌呤 (Adenine, Ade 10)之反應 ...32 1.2.2.4.1 DNA 加成產物 N3-SFO-Ade 16 之結構鑑定 ...34 1.2.2.4.2 DNA 加成產物 N9-SFO-Ade 17 之結構鑑定 ...38 1.2.2.5 黃樟素代謝產物(±)-3 與 2’-去氧鳥糞嘌呤(2’-deoxyguanosine,
viii 2’-dGuo 10)之反應 ...40 1.2.2.5.1 DNA 加成產物 N7-SFO-Gua 19 之結構鑑定 ...42 1.2.2.6 黃樟素代謝產物(±)-3 與 2’-去氧胞嘧啶 (2’-deoxycytidine, 2’-dCyt 20) 之反應 ...45 1.2.2.6.1 DNA 加成產物 N3-SFO-dUrd 21 之結構鑑定 ...47 1.2.2.7 黃樟素代謝產物(±)-3 與胸腺嘧啶(thymidine, 2’-dThd 22) 之 反應 ...51 1.2.2.7.1 DNA 加成產物 N3-SFO-dThd 23 之結構鑑定 ...53 1.2.2.8 利用穩定同位素稀釋高效液相層析電噴灑游離串聯質譜法 定量黃樟素代謝產物 SFO 3 之 DNA 加成產物體外與體內的 生成量 ...55 1.2.2.8.1 合成同位素標定之內標準品[15N5]-N1-SFO-dAdo 11、 [15N5]-N 6 -SFO-dAdo 12、[15N5]-N7-SFO-Gua 19 ...56 1.2.2.8.2 利用同位素稀釋高效液相層析 電噴灑游離串聯質譜 (LC-ESI-MS/MS) 儀定量(±)-SFO 3 與小牛胸腺 DNA (Calf thymus DNA)反應之 DNA 加成產物 ...58 1.2.2.8.3 利用穩定同位素稀釋高效液相層析電噴灑游離串聯質
譜法定量老鼠尿液中 N7-SFO-Gua 19 之分析方法開發 與方法確校 ...63
ix
1.2.2.8.4 利用穩定同位素稀釋高效液相層析電噴灑游離串聯質
譜法定量老鼠尿液中之 N7-SFO-Gua 19 ...65
1.3 結論 ...68
1.4 實驗方法 ...70
1.4.1 Purification of DNA Adducts ...70
1.4.2 Spectroscopic and Spectrometric Methods...71
1.4.3 Synthesis of (±)-SFO 3 ...71
1.4.4 Enantioselective Synthesis of (R)-(+)-enriched-SFO 3 ...72
1.4.4.1 Synthesis of (R)-(+)-5-(2,3-Dihydroxypropyl)-1,3-benzodioxole 13 ...72
1.4.4.2 Synthesis of (R)-(+)-5-(2-Hydroxy-3-tosyloxypropyl)-1,3- benzodioxole 14 ...73
1.4.4.3 Synthesis of (R)-(+)-5-Oxiranylmethyl-1,3-benzodioxole 3 ...74
1.4.5 Synthesis of N1-SFO-dAdo 11, (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11, N6-SFO-dAdo 12, and (R)-enriched-N6-SFO-dAdo 12 ...75
1.4.6 Rearrangement of N1-SFO-dAdo 11 to N6-SFO-dAdo 12 ...78
1.4.7 Synthesis of N3-SFO-Ade 16 and N9-SFO-Ade 17 ...78
1.4.8 Synthesis of N7-SFO-Gua 19 ...80 1.4.9 Synthesis of N3-SFO-dUrd 21 ...81 1.4.10 Synthesis of N3-SFO-dThd 23 ...82 1.4.11 Synthesis of [15N5]-N1-SFO-dAdo 11, [ 15 N5]-N 6 -SFO-dAdo 12, and [15N5]-N7-SFO-Gua 19 ...83
x
Tandem Mass Spectrometry (HPLCESI-MS/MS) for Quantification
of DNA Adducts in Calf Thymus DNA ...84
1.4.13 Reaction of (±)-SFO 3 with Calf Thymus DNA ...85
1.4.14 Animal Experiments ...86
1.4.15 High Performance Liquid ChromatographyElectrospray Ionization– Tandem Mass (HPLC-ESIMS/MS) Spectrometryic Method for Mice Urine Analysis...87
1.4.16 Analysis of N7-SFO-Gua 19 in Urines of Mouse Treated with (±)-SFO 3 ...88
第二章 製備 2’-去氧腺嘌呤模版分子 2.1 ...89
2.1.1 分子模版的發展歷史 ...89
2.1.2 分子模版高分子(molecularly imprinted polymer, MIP)設計計概念 ...90
2.1.3 模版與單體間的作用力 ...91
2.1.4 研究動機 ...93
2.2 ...97
2.2.1 2’- 去 氧 腺 嘌 呤 (2’-deoxyadenosine, 2’-dAdo 10) 與 甲 基 丙 烯 酸 (methacrylic acid, MAA 27) 結合之變溫 NMR 量測 ...97
xi 2.2.2 2’-去氧腺嘌呤模版高分子之聚合 ...99 2.2.3 2’-去氧腺嘌呤模版高分子之鍵結能力 ...101 2.3 未來工作 ...103 2.4 ...104 2.5 ...105
2.4.1 Preparation of Molecularly Imprinted Polymer ...105
2.4.1 Batch Rebinding Studies ...105
第三 ...106
xii 表目錄
表一、 DNA 鹼基上不同親核位置之相對反應性...12 表二、 1
H and 13C Chemical Shifts (), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H(Hz)
of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N1-SFO- dAdo 11 ...20 表三、 1
H and 13C Chemical Shifts (), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H(Hz)
of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N6-SFO- dAdo 12 ...23 表四、 1
H and 13C Chemical Shifts (), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H(Hz)
of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N3-SFO- Ade 16 ...37 表五、 1
H and 13C Chemical Shifts (), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H(Hz)
of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N9-SFO- Ade 17 ...39 表六、 1
H and 13C Chemical Shifts (), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H(Hz)
of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N7-SFO- Gua 19 ...44 表七、 1
H and 13C Chemical Shifts (), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H(Hz)
of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N3-SFO- dUrd 21 ...49 表八、 1
H and 13C Chemical Shifts (), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H(Hz)
of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N3-SFO- dThd 23 ...55
xiii
表九、 小牛胸腺 DNA 與黃樟素代謝產物 SFO 3 在 pH 7.4，37 o
C 下反應 72 小時之 DNA 加成產物 11、12、16 及 19 的生成量 ...61
xiv 圖目錄 圖一、 去氧核醣核酸的基本構造 ... 1 圖二、 DNA 加成產物之形成與修復和癌症的關係 ... 3 圖三、 黃樟素 1 之代謝 ... 6 圖四、 1’-hydroxysafrole 2 的 DNA 加成物 ... 7 圖五、 32P 同位素標記分析 safrole-DNA 加成產物 ... 7 圖六、 32P 同位素標記分析 SFO-DNA 加成產物 ... 9 圖七、 (A) (±)-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 在 pH 7.4, 37 oC 下反應 72 小 時與(B) (±)-SFO 3 在 pH 7.4, 37 oC 下反應 72 小時之高效液相層 析 圖 譜 。 (C) 加 成 產 物 N1-SFO-dAdo 11 與 (D) 加 成 產 物 N6-SFO-dAdo 12 之 UV 吸收光譜圖 ... 15
圖八、 DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 和 N6-SFO-dAdo 12 正離子模 式下之電噴灑游離質譜圖 ... 16
圖九、 DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖 ... 17
圖十、 C2-endo 與 C3-endo 構形示意圖 ... 19
圖十一、 DNA 加成產物 N6 -SFO-dAdo 12 之 H,H-COSY (500 MHz, d6-DMSO)光譜圖 ... 22 圖十二、 DNA 加 成 產 物 N1-SFO-dAdo 11 ( 下 圖 ) 與 (R)-enriched-
xv
N1-SFO-dAdo 11 (上圖) 之13C NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光
譜圖疊圖 ... 26 圖十三、 DNA 加 成 產 物 (A) N1-SFO-dAdo 11 與 (B) (R)-enriched-
N1-SFO-dAdo 11 之手性高效液相層析圖 ... 27 圖十四、 DNA 加 成 產 物 N6 -SFO-dAdo 12 ( 下 圖 ) 與 (R)-enriched- N6-SFO-dAdo 12 (上圖) 之 13C NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光 譜圖疊圖 ... 28 圖十五、 Dimroth rearrangement 反應機制圖 ... 29 圖十六、 N1-SFO-dAdo 11 在 0.2 N K2HPO4 (pH 7.4)，37 o C 下進行 Dimroth rearrangement 反應轉換成 N6-SFO-dAdo 12 之高效液相 層析圖譜 ... 29 圖十七、 Styrene oxide (SO) 與 2’-去氧腺嘌呤反應所形成之 DNA 加成產
物 ... 30 圖十八、 Styrene oxide (SO) 之 DNA 加成產物 N1-SO-dAdo 去氨基形成
N1-SFO-dIno 之反應機制 ... 31 圖十九、 (A) (±)-SFO 3 與腺嘌呤 15 在 pH 7.4, 37 o C 下反應 72 小時與(B) (±)-SFO 3 在 pH 7.4, 37 oC 下反應 72 小時之高效液相層析圖譜。 (C)加成產物 N3-SFO-Ade 16 與 (D)加成產物 N9-SFO-Ade 17 之 UV 吸收光譜圖 ... 33
xvi
圖二十、 DNA 加成產物 N3-SFO-Ade 16 和 N9-SFO-Ade 17 正離子模式 下之電噴灑游離質譜圖 ... 34 圖二十一、 DNA 加成產物 N3-SFO-Ade 16 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO)
光譜圖 ... 36 圖二十二、 DNA 加成產物 N9-SFO-Ade 17 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO)
光譜圖 ... 38 圖二十三、 (A) (±)-SFO 3 與 2’-去氧鳥糞嘌呤 18 在 pH 7.4, 37 o C 下反應 72 小時與(B) (±)-SFO 3 在 pH 7.4, 37 o C 下反應 72 小時之高效液相 層析圖譜 ... 41 圖二十四、 DNA 加成產物 N7-SFO-Ade 19 正離子模式下之電噴灑游離質 譜圖 ... 42 圖二十五、 DNA 加成產物 N7-SFO-Gua 19 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO)
光譜圖 ... 43 圖二十六、(A) (±)-SFO 3 與 2’-去氧胞嘧啶 20 在 pH 7.4, 37 o C 下反應 72 小 時與(B) (±)-SFO 3 在 pH 7.4, 37 o C 下反應 72 小時之高效液相層 析圖譜 ... 46 圖二十七、 DNA 加成產物 N3-SFO-dUrd 21 正離子模式下之電噴灑游離質 譜圖 ... 46 圖二十八、DNA 加成產物 N3-SFO-dUrd 21 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO)
xvii 光譜圖 ... 48 圖二十九、 (A) (±)-SFO 3 與胸腺嘧啶 22 在 pH 7.4, 37 o C 下反應 72 小時與 （B）(±)-SFO 3 在 pH 7.4, 37 o C 下反應 72 小時之高效液相層析 圖譜 ... 52 圖三十、 DNA 加成產物 N3-SFO-dThd 23 正離子模式下之電噴灑游離質 譜圖 ... 52 圖三十一、DNA 加成產物 N3-SFO-dThd 23 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO)
光譜圖 ... 54 圖三十二、 (a) N1-SFO-dAdo 11 (430314) 與 [15N5]-N1-SFO-dAdo 11
(435319) 和 (b) N6-SFO-dAdo 12 (430314) 與 [15N5]-N 6 -SFO-dAdo 12 (435319) 正離子模式下之子離子掃 瞄質譜圖 ... 57 圖三十三、 N7-SFO-Gua 19 (330152) 與 [15N5]-N7-SFO-Gua 19 (335157) 正離子模式下之子離子掃瞄質譜圖 ...58 圖三十四、 小牛胸腺 DNA 與 SFO 3 反應之高效液相層析電噴灑游離串聯
質譜圖。(A)小牛胸腺 DNA 與 SFO 3 不進行水解的反應液：(1) 熱不穩定的自發性去嘌呤 DNA 加成產物 N3-SFO-Ade 16 與內 標 準 品 N9-SFO-Ade 17 ， (2) 除 了 內 標 準 品 [15N5]-N1-SFO-dAdo 11 和[ 15 N5]-N 6 -SFO-dAdo 12 的訊號，並
xviii
無偵測 DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 和 N6-SFO-dAdo 12， (3)熱不穩定之自發性去嘌呤 DNA 加成產物 N7-SFO-Gua 19 及 內標準品[15
N5]-N7-SFO-Gua 19；(B)小牛胸腺 DNA 與 SFO 3
反應液，利用中性加熱水解 (反應液於 70 o
C 加熱一小時)結合 酵 素 水 解 ： (1) 熱 不 穩 定 的 自 發 性 去 嘌 呤 DNA 加 成 產 物
N3-SFO-Ade 16 與內標準品 N9-SFO-Ade 17，(2)DNA 加成產 物 N1-SFO-dAdo 11 和 N6-SFO-dAdo 12 與 [15N5]-N1-SFO-dAdo 11 和[ 15 N5]-N 6 -SFO-dAdo 12，(3)熱不穩定 之自發性去嘌呤 DNA 加成產物 N7-SFO-Gua 19 及內標準品 [15N5]-N7-SFO-Gua 19 ... 60 圖三十五、 N7-SFO-Gua (1 ng/mL) 與 [15N5]-N7-SFO-Gua (1.1ng/mL) 配 製在(a) H2O 與 (b) 未暴露老鼠尿液中分析之高效液相層析電 噴灑游離串聯質譜圖 ... 64 圖三十六、 將 不 同 濃 度 之 N7-SFO-Gua 19 (0.255 ng/mL) 分 別 加 入 [15N5]-N7-SFO-Gua 19 (1.1 ng/mL) 配製在未暴露老鼠尿液中 分析所得之校正曲線 ... 65 圖三十七、 (a)未暴露老鼠尿液 (控制組) 與 (b) 靜脈注射 SFO 3 (30 mg/kg body wt) 之老鼠尿液 (實驗組) 分別加入[15N5]-N7-SFO-Gua 19 (1.1 ng/mL) 之內標準品後，分析所得之高效液相層析電噴灑
xix
游離串聯質譜圖 ... 66 圖三十八、 Emil Fischer 所提出“lock and key”的理論示意圖 ... 89 圖三十九、 可選擇性吸附不同取代基的染料之矽高分子(silica polymer) .. 90 圖四十、 分子模版高分子設計概念 ... 91 圖四十一、 Phenyl--D-mannopyranoside 24 之分子模版高分子 ... 92 圖四十二、 L-Phenylaniline anilide 25 模版高分子 ... 93 圖四十三、 模版分子 1-methyladenosine 26、甲基丙烯酸 27 單體與二甲基 丙烯酸乙二醇酯 28 交聯劑之構造 ... 94 圖四十四、 1-methyladenosine 26 分子模版高分子與不同核苷酸鹼基之結合 常數 ... 94 圖四十五、 高效液相層析圖譜。(A) 尿液樣品、(B) 加入 1-methyladenosine 26 的尿液樣品以及(C)將加入 1-methyladenosine 26 的尿液樣品 經過分子模版高分子萃取 ... 95 圖四十六、 DNA 加成產物 N6 -SFO-dAdo 12 分子模版高分子 ... 96 圖四十七、 利用熱化學法 (60 o C) 製備 2’-去氧腺嘌呤模版高分子之掃瞄式 電子顯微鏡圖 ... 98 圖四十八、 2’-去氧腺嘌呤 10 與甲基丙烯酸 27 以 1:14 之莫耳比例混合後， 進行變溫實驗之 1 H NMR 光譜(500 MHz, CD3CN/D2O = 4:1) ... 99
xx 圖四十九、 2’-去氧腺嘌呤 10、甲基丙烯酸 27、甲基丙烯酸乙二醇酯 28 以 1 : 14 : 75 和偶氮二異丁腈 29 反應監控之 1 H NMR 光譜圖 (300 MHz, CD3CN/D2O = 4:1)。（A）未光照之混合液、(B) 在 0 o C 下以 UV 燈（365 nm）進行光照 1 分鐘、（C）聚合反應 16 小時 ... 100 圖五十、 分子模版高分子的掃瞄式電子顯微鏡圖。(A) 2’-去氧腺嘌呤模 版高分子；(B)文獻之 1-Methyladenosin 模版高分子... 101 圖五十一、 2’-去氧腺嘌呤 10 (1 mM) 加入模版高分子 (20 mg、40 mg) 與
非模版高分子 (non-imprinting polymer, NIP 20 mg) 反應隔夜 後，注入 25 L 澄清液，溶液中未鍵結之 2’-去氧腺嘌呤 10 之 高效液相層析圖 ... 102
xxi 式圖目錄 式圖一、 實驗流程圖 ...13 式圖二、 黃樟素代謝產物(±)-SFO 3 的合成 ...14 式圖三、 2’-去氧腺嘌呤 10 與()-SFO 3 之加成產物 N1-SFO-dAdo 11 與 N6 -SFO-dAdo 12 的合成 ...14 式圖四、 (R)-(+)-enriched-SFO 3 的合成 ...24 式圖五、 DNA 加 成 產 物 (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 與
(R)-enriched-N6- SFO-dAdo 12 的合成 ...25 式圖六、 腺 嘌 呤 15 與 ()-SFO 3 之 加 成 產 物 N3-SFO-Ade 16 與 N9-SFO-Ade 17 的合成 ...32 式圖七、 DNA 加成產物 N7-SFO-Gua 19 的合成 ...40 式圖八、 2’-去氧胞嘧啶 20 與()-SFO 3 之加成產物 N3-SFO-dUrd 21 的合成 ...45 式圖九、 胸腺嘧啶 22 與()-SFO 3 之加成產物 N3-SFO-dThd 23 的合成 ...51 式圖十、 穩 定 同 位 素 標 定 之 內 標 準 品 [15 N5]-N1-SFO-dAdo 11 、 [15N5]-N 6 - SFO-dAdo 12、[15N5]-N7-SFO-Gua 19 的合成 ...56 式圖十一、 加成產物 N6 -SFO-dAdo 12 的合成 ...103
xxii 附圖目錄 附圖一、 黃樟素代謝產物(±)-SFO 3 之1 H NMR (300 MHz, CDCl3)光譜 圖。 ... 118 附圖二、 黃樟素代謝產物(±)-SFO 3 之 DEPT (75.4 MHz, CDCl3) 光譜 圖。 ... 119 附圖三、 化合物 (a) (R)-(+)-enriched-13、(b) (R)-(+)- enriched-14、(c) (R)-(+)-enriched-3 之手性高效液相層析圖譜。 ...120 附圖四、 化合物(R)-(+)-5-(2,3-Dihydroxypropyl)-1,3-benzodixole 13 之 1 H NMR (300 MHz, CDCl3) 光譜圖。 ...121 附圖五、 化 合 物 (R)-(+)-5-(2,3-Dihydroxypropyl)-1,3-benzodixole 13 之 DEPT (CDCl3, 75.4 MHz) 光譜圖。 ...122 附圖六、 化 合 物 (R)-(+)-5-(2-hydroxy-3-tosyloxypropyl)-1,3-benzo- dixole 14 之1H NMR (300 MHz, CDCl3) 光譜圖。 ...123 附圖七、 化合物(R)-(+)-5-(2-hydroxy-3-tosyloxypropyl)-1,3-benzodixole 14 之 DEPT (75.4 MHz , CDCl3) 光譜圖。...124 附圖八、 化合物 (R)-(+)-5-Oxiranylmethyl-1,3-benzodixole 3 之1 H NMR (300 MHz , CDCl3) 光譜圖。 ...125 附圖九、 化 合 物 (R)-(+)-5-Oxiranylmethyl-1,3-benzodixole 3 之 13 C NMR (75.4 MHz , CDCl3) 光譜圖。 ...126
xxiii
附圖十、 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 之1H NMR (500 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。 ...127 附圖十一、 加 成 產 物 N1-SFO-dAdo 11 之 13C NMR (125.7 MHz,
d6-DMSO)光譜圖。 ...128 附圖十二、 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 之 DEPT (125.7 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。 ...129 附圖十三、 加 成 產 物 N1-SFO-dAdo 11 之 H,H-COSY (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...130 附圖十四、 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 之 HMQC (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...131 附圖十五、 加成產物(R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 之1H NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...132 附圖十六、 加成產物(R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 之 13C NMR (125.7 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...133 附圖十七、 加成產物 N6 -SFO-dAdo 12 之 1H NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...134 附圖十八、 加 成 產 物 N6 -SFO-dAdo 12 之 13C NMR (125.7 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...135 附圖十九、 加成產物 N6
xxiv 光譜圖。 ...136 附圖二十、 加成產物 N6 -SFO-dAdo 12 之 HMQC (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...137 附圖二十一、 加成產物 N6 -SFO-dAdo 12 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...138 附圖二十二、 加成產物 (R)-enriched-N6 -SFO-dAdo 12 之 1H NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...139 附圖二十三、 加成產物 (R)-enriched-N6 -SFO-dAdo 12 之13C NMR (125.7 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...140 附圖二十四、 加成產物 N3-SFO-dAdo 16 之1H NMR(500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...141 附圖二十五、加成產物 N3-SFO-dAdo 16 之13C NMR(125.7 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...142 附圖二十六、 加成產物 N3-SFO-dAdo 16 之 DEPT (125.7 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。 ...143 附圖二十七、 加 成 產 物 N3-SFO-dAdo 16 之 H,H-COSY (300 MHz,
d6-DMSO)光譜圖。 ...144 附圖二十八、 加成產物 N3-SFO-dAdo 16 之 HMQC (500 MHz, d6-DMSO)
xxv
附圖二十九、 加成產物 N9-SFO-Ade 17 之1H NMR (500 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。 ...146 附圖三十、 加成產物 N9-SFO-Ade 17 之13C NMR (125.7 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。 ...147 附圖三十一、 加成產物 N9-SFO-Ade 17 之 DEPT (125.7 MHz, d6-DMSO)光
譜圖。 ...148 附圖三十二、加成產物 N9-SFO-Ade 17 之 H,H-COSY (300 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。 ...149 附圖三十三、 加成產物 N9-SFO-Ade 17 之 HMQC (500 MHz, d6-DMSO) 光 譜圖。 ...150 附圖三十四、 加成產物 N7-SFO-Ade 19 之1H NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...151 附圖三十五、 加成產物 N7-SFO-Ade 19 之13C NMR (125.7 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...152 附圖三十六、 加成產物 N7-SFO-Ade 19 之 DEPT (125.7 MHz, d6-DMSO)光
譜圖。 ...153 附圖三十七、加成產物 N7-SFO-Ade 19 之 H,H-COSY (500 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。 ...154 附圖三十八、 加成產物 N7-SFO-Ade 19 之 HMQC (500 MHz, d6-DMSO)光
xxvi 譜圖。 ...155 附圖三十九、加成產物 N3-SFO-dUrd 21 之1H NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...156 附圖四十、 加 成 產 物 N3-SFO-dUrd 21 之 13C NMR (125.7 MHz, d6-DMSO)光譜圖。 ...157 附圖四十一、 加成產物 N3-SFO-dUrd 21 之 DEPT (125.7 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。 ...158 附圖四十二、 加 成 產 物 N3-SFO-dUrd 21 之 H,H-COSY (300 MHz, d6-DMSO)光譜圖。 ...159 附圖四十三、 加成產物 N3-SFO-dUrd 21 之 HMQC (500 MHz, d6-DMSO)光 譜圖。 ...160 附圖四十四、 加成產物 N3-SFO-dThd 23 之 1H NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...161 附圖四十五、 加 成 產 物 N3-SFO-dThd 23 之 13C NMR (125.7 MHz, d6-DMSO)光譜圖。 ...162 附圖四十六、 加成產物 N3-SFO-dThd 23 之 DEPT (125.7 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。 ...163 附圖四十七、 加 成 產 物 N3-SFO-dThd 23 之 H,H-COSY (300 MHz,
xxvii 附圖四十八、 加成產物 N3-SFO-dThd 23 之 HMQC (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖。 ...165 附圖四十九、 文獻上 3’,5’-di-O-(triisopropylsilyl)-7-15 N-2’-deoxyadenosine 與 醋酸(1:4)在 CDClF2/CDF3 (Freon solution)溶劑中變溫實驗的 1 H NMR 光譜圖。 ...166
1
第一章 2’,3’-環氧黃樟素與 DNA 鹼基反應所形成加成產物之探討
1.1 緒論 1.1.1 DNA 加成產物
去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA)主要是由去氧核醣、磷 酸 、 與 四 個 含 氮 鹼 基 (base) 組 成 。 腺 嘌 呤 (adenine) 、 鳥 糞 嘌 呤 (guanine)、胞嘧啶 (cytosine)與胸腺嘧啶 (thymine) 彼此間會以氫鍵鍵結 並組成雙股螺旋 DNA (圖一)，鹼基之間的特定配對組合則蘊藏了生物遺 傳訊息。 圖一、去氧核醣核酸的基本構造。 在癌症的發展過程中會因為基因上單一鹼基發生錯誤而活化原致 癌基因或使腫瘤抑制基因活性降低，而導致癌症的生成(Chen, 2001)。根 據化學致癌的理論，化學致癌物質在體內會被代謝活化，成為親電子性 的活性代謝物質。這些代謝物會攻擊蛋白質與基因鹼基的親核性基團而 形成共價鍵，產生穩定共價鍵結的產物，又稱為 DNA 加成產物 (DNA
2
adducts)。這些被修飾的基因鹼基會使得 DNA 結構發生變化而改變正常 鹼基的配對關係，如果 DNA 加成產物無法在基因複製前有效的被修復， 導致基因複製過程中發生錯誤，就會造成基因突變最後有可能導致癌症 (Groopman and Kensler, 1999)。
1.1.2 DNA 加成產物的修復和癌症的關係
DNA 加成產物在體內的兩種修復機制（圖二）(Chen and Hong, 2001) (1) 核酸切除修復機制(nucleotide excision repair, NER)：可從 3’端將去鹼 基位置含去氧核醣之磷酸骨架單獨切除或整段切除之後形成 DNA 鏈斷 裂 (DNA strand breakage)，再由 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 進行修 補；(Cleaver et al., 2001) (2) 鹼基切除修復機制 (base excision repair, BER)：在修復過程中， DNA 加成產物會先被切除下來形成無嘌呤 DNA (abasic site DNA/apurinic site DNA, AP site DNA)，再由 3’端將去鹼基位 置含去氧核醣之磷酸骨架單獨切除或整段切除之後形成 DNA 鏈斷裂 (DNA strand breakage)，經 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 進行修補， 或由 DNA 聚合酶直接由 5’端進行複製將去鹼基位置 DNA 直接取代之 修復路徑 (Boiteux and Guillet, 2004)，不論何種修復路徑最後這些被修 復之 DNA 加成產物會經由尿液排出體外。因此不論 DNA 加成產物直接 導致基因複製的錯誤，或者修復過程中導致基因突變都是誘導癌症形成
3
主因(Singh and Farmer, 2006)。所以 DNA 加成產物的生成量被認為是生 物有效劑量的指標（biologically-effective doses），DNA 加成產物量愈高 可能會有較高的致癌風險 (Chen, 2001; Swenberg et al., 2007)。
圖二、 DNA 加成產物之形成與修復和癌症的關係 (Chen and Hong, 2001)。
4
1.1.3 黃樟素(Safrole) 1
黃樟素 1 是黃樟油 (sassafras oil) 的主要成分，同時也存在於一些 香料中，如：羅勒 (basil) 、豆蔻 (nutmeg)、肉桂 (cinnamon)、黑胡椒 (black pepper)中(Munerato et al., 2005; Ueng et al., 2004)。目前被國際癌 症研究署 （International Agency for Research on Cancer, IARC）歸類為 2B（可能對人類造成致癌）的化合物 (IARC, 1976)。歐盟共同體食物科 學委員會 (The Scientific Committee for Food of the European Union) 估 計每人 (以體重60 kg計) 每日黃樟素平均攝取量0.3 mg，而聯合國糧農 組織與世界衛生組織的食品添加物聯合專家委員會 (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) 則是估計每人每日最大攝取量為 879 g (Martati et al., 2011)。值得注意的是台灣檳榔 (areca quid) 中的荖 花 (Inflorescence Piper betle ) 每克就含有 15 mg 的黃樟素 1，在嚼食的 過程中唾液裏黃樟素 1 的濃度可以高達420 M (Martati et al., 2011)。由 於國人有許多嚼食檳榔者，不僅因嚼食檳榔導致口腔癌患者眾多，研究 也顯示在台灣原住民當中發現嚼檳榔產生慢性肝病的風險比起未嚼檳 榔者大(Lin, 2002)，因此近年來對於嚼食檳榔與口腔癌(Hsieh et al., 2001) 或肝癌之間的相關性是否與黃樟素 1 的暴露有關一直是生物學家所感 興趣的課題。
5
1.1.4 黃樟素 1 致癌機制的相關研究
黃樟素 1 被攝取進入人體後，在體內會被代謝成1’-羥基黃樟素 (1’-hydroxysafrole 2) (Borchert et al., 1973b; Stillwell et al., 1974)、2’,3’-環氧黃樟素(safrole 2’,3’-oxide, SFO 3) (Wislocki et al., 1976)、3’-羥基黃 樟素(3’-hydroxysafrole 4) (Benedetti et al., 1977) 與1,2-羥基-4-烯丙基苯 (1,2-dihydroxy-4-allylbenzene 5) (Benedetti et al., 1977)（圖三）。從生理為 基礎的動力學 (physiologically based biokinetic, PBBK) 模式代入體外代 謝參數計算，給予黃樟素 1 (300 mg/kg body weight) 的老鼠黃樟素代謝 產物 2、4、5與 7 的量分別為黃樟素 1 的10.0%、7.7%、74.0%與6.9% (Martati et al., 2011)。
過去的文獻報導，給老鼠餵食黃樟素 1 之後，發現老鼠的尿液中 有1’-羥基黃樟素 2 的生成(Borchert et al., 1973b; Stillwell et al., 1974)。 1976 年 ， Wislocki 等 人 (Wislocki et al., 1976) 給 予 老 鼠 服 用 [2’, 3’-3
H]-1’-hydroxysafrole，發現肝臟內之DNA (hepatic DNA)、核醣體RNA (ribosomal RNA) 和蛋白質含有3H的衍生物，而這些主要是親電基在體 內反應產生的致癌物質，因此黃樟素代謝產物 2 一直被認為是黃樟素
1 代謝過程中與體內DNA反應活性最大之致癌物，也是黃樟素的最終代
6
圖三、黃樟素 1 之代謝 (Martati et al., 2011)。
當黃樟素代謝產物 1’-羥基黃樟素 2 與 2’-去氧鳥糞嘌呤(2’-deoxy- guanosine, 2’-dGuo) 反應，主要形成 N2-(trans-isosafrole-3’-yl)-2’-deoxy- guanosine 8 與 N2-(safrole-1’-yl)-2’-deoxyguanosine 9 (圖四)兩個 DNA 加 成產物(Chung et al., 2008)。
7
圖四、1’-羥基黃樟素 2 的 DNA 加成產物：N2
-(trans-isosafrole-3’-yl) - 2’-deoxyguanosine 8 (Phillips et al., 1981) 與 N2
-(safrole-1’-yl)-2’- deoxyguanosine 9 (Chung et al., 2008)。
圖五、32
P 同位素標記分析黃樟素 DNA 加成產物，Spot 1:加成產物 8 與 Spot 2: 加成產物 9，關於 spots 3 和 4 仍然不清楚其構造。(A)在 HepG2 細胞中加入 1’-羥基黃樟素 2 (400 mM) 培養 24 小時; (B)未加入 1’-羥基 黃樟素 2 的控制組; (C, D) 嚼食檳榔者之白血球細胞(對照組) (Liu et al., 2004)。
8 2004 年，Liu 等人在 HepG2 細胞中加入黃樟素的代謝產物 1’-羥基 黃樟素 2 一起培養，利用 32 P-後標籤法分析得到圖五-A，與有嚼食檳榔 病史者的白血球細胞圖五-C、D 的自動放射顯影片比較，確定嚼食檳榔 者的白血球細胞會有 1’-羥基黃樟素 2 的 DNA 加成產物: N2 -(trans-iso safrole-3’-yl) -2’-deoxyguanosine 8 (spot 1)生成 (Liu et al., 2004)。除此之 外，2008 年 Liu 等人也利用 32
P-後標籤法分析 28 位嚼食檳榔 10 年之久 的肝腫瘤患者，並在其中 2 位病患肝組織中分析到加成產物 8 (Chung et al., 2008)。
而另一具親電反應之黃樟素代謝產物 2’,3’-環氧黃樟素 3，雖然在沙 門氏菌(Salmonella typhimurium) TA1535 和 TA100 的安姆氏試驗(Ames Test)中發現黃樟素代謝產物 3 具有中度致突變性 (moderate mutagenicity) (Swanson et al., 1979; Wislocki et al., 1977)，並且會造成人類肺癌細胞 A549 (A549 human lung cancer cells)的細胞凋亡(apoptosis) (Du et al., 2006a; Du et al., 2006b)，除此之外，暴露黃樟素代謝產物 3 的 CD-1 母鼠 會生成不同的腫瘤(Miller et al., 1983)，而我們與中國醫藥大學江素瑛老 師合作，發現給予黃樟素代謝產物 SFO 3 的老鼠也會造成紅血球細胞中 微核 (micronuclei) 的增加以及 DNA 的斷裂(Chiang et al., 2011)。
但是在 1995 年 Qato 等人(Qato and Guenthner, 1995) 將黃樟素代謝 產物 3 分別與小牛胸腺 DNA (calf thymus DNA) 和 2’-去氧鳥糞嘌呤進行
9 體外反應，利用 32 P-後標籤法分析發現至少有九個加成產物生成 (圖六 -A 與圖六-B)。 圖六、32 P 同位素標記分析 2’,3’-環氧黃樟素 DNA 加成產物。 （A）2’,3’-環氧黃樟素 3 與小牛胸腺 DNA 之反應;（B）2’,3’-（A）2’,3’-環氧黃樟素 3 與 2’-去氧鳥糞核苷之反應；(C) 靜脈注射單一劑量黃樟素 1 (97.3 mg/kg body weight) 之老鼠肝臟 DNA:老鼠體內生成之黃樟素 DNA 加成產物分別以 a-d 標示; (D)正常老鼠之肝臟 DNA（控制組）; (E）靜脈注射單一劑量 2’,3’-環氧黃樟素 3 (106.9 mg/kg body weight)。(Qato and Guenthner, 1995)
同時在分析給予單一劑量黃樟素 1 (97.3 mg/kg body wt) 之老鼠肝 臟中，也有發現黃樟素 DNA 加成產物生成 (圖六-C)，但在同樣給予單
10
一劑量黃樟素代謝產物 3 (106.9 mg/kg body wt) 之老鼠肝臟 DNA (圖六 -E) 與沒有藥物暴露之老鼠肝臟 DNA 比較發現並無任何黃樟素代謝產 物 3 相關的 DNA 加成產物生成，作者推測此結果主要是因為黃樟素代 謝產物 3 可以經由麩胺基硫轉移酵素 (glutathione S-transferases, GSTs) 和環氧化合物水解酶 (epoxide hydrolases, EHs) 去毒化的過程代謝掉 ( Luo et al., 1992; Luo and Guenthner, 1994, 1995)，所以無法在體內形成 黃樟素代謝產物 3 相關的 DNA 加成產物，因此黃樟素代謝產物 3 一直 被認為不具有任何基因毒性。
1.1.5 DNA 加成產物的分析方法
32P-後標籤法（32P-postlabeling）、免疫分析法 ( immunoassays)、 電化學檢測法 (electrochemical detection, ECD)、螢光偵測 (fluorescence detection)與質譜法 (mass spectrometry)都是用來定量 DNA 加成產物的 方法 (Himmelstein et al., 2009)。在複雜的生物樣品中定量這些超微量的 DNA 加成產物，必須考慮方法之高專一性與高靈敏性 (Himmelstein et al., 2009; Koc and Swenberg, 2002)，32P-後標籤法是這些方法中最具高靈 敏度（～1 adduct per 109
normal base）卻缺乏高專一性，其他的方法則 是 具 高 專 一 性 缺 乏 高 靈 敏 度 ， 由 於 此 方 法 必 須 利 用 聚 核 苷 酸 激 酶 (polynucleotide kinase, PNK) 將 [-32P]ATP 上之32P-orthophosphate 轉移
11
到 2-deoxyribose 上 5’-OH 端 (Phillips and Arlt, 2007)， 因此此方法最大 的缺點就是不適合用於醣苷鍵不穩定（例如：N7-alkylguanine adducts） 之 DNA 加成產物的分析 (Himmelstein et al., 2009; Koc and Swenberg, 2002; Swenberg et al., 2007)。
從 1990 年 代 開 始 ， 同 位 素 稀 釋 質 譜 法 (isotope dilution mass spectrometry, IDMS)不僅可以提供化合物的構造，同時可採用同位素當 標準品在不同的質荷比 (m/z) 頻道測量，達到準確定量的目的，取代 32
P-後標籤法成為分析 DNA 加成產物的主流 (Koc and Swenberg, 2002)。用 同位素稀釋質譜法作定量分析的先決條件是要具備與分析物相同的同 位素，除了一些常用藥品的同位素已商品化之外，通常這些同位素必須 來自全合成或是半合成 (陳皓君, 2003)，因此合成 DNA 加成產物的同位 素標準品以及鑑定其結構，也是發展同位素稀釋質譜法定量 DNA 加成 產物上重要的一環。 1.1.6 研究動機 工業上常用的高分子原料苯乙烯 (styrene)、丁二烯 (butadiene)、乙 烯(ethylene) 與丙烯 (propylene) 其代謝過程中所形成的環氧代謝產 物，一樣是經由麩胺基硫轉移酵素和環氧化合物水解酶去毒化 (Luo et al., 1992; Krause et al., 1997; Faller et al., 2001;Csanady et al., 2003; Wu et
12 al., 2011)，卻仍然能夠在體內生成 DNA 加成產物，並與 2’-去氧腺嘌呤 反應形成 N1-、N6 - 和 N3-位置取代之腺嘌呤 DNA 加成產物，與 2’-去氧 鳥糞嘌呤反應形成 N7- 和 N2-位置取代之鳥糞嘌呤 DNA，與 2’-去氧胞 嘧啶反應形成 N3-和 N4-位置取代之胞嘧啶 DNA 加成產物以及與胸腺嘧 啶反應形成 N3-位置取代之胸腺嘧啶加成產物（表一）。( Pongracz et al., 1989; Tretyakova et al., 1997; Koskinen and Plna, 2000; Koskinen et al., 2000b; Munter et al., 2002; Boysen et al., 2009 )
表一、DNA 鹼基上不同親核位置之相對反應性(Boysen et al., 2009)。
Chemical
carcinogens N7-Gua O6-Gua N2-Gua N3-Ade N1-/ N6-Ade N3-Cyt N4-Cyt Propylene oxide 100 0.5 - 4.4/10 3.5 2 - Ethylene oxide 100 - - 10 10 1 - Butadiene oxide 100 - - 15 25 1.5 2 Styrene oxide 100 - 4.5 10 16 5 - 為了探討黃樟素代謝產物 3 是否也是黃樟素 1 致癌機轉之一，因此 我們必須先證實其在體內會攻擊 DNA 產生 DNA 加成產物，而非直接被 代謝成 1,2-羥基-4-烯丙基苯 5 排出體外。因此我們（式圖一）將合成並 鑑定黃樟素代謝產物 3 與 2’-去氧腺嘌呤 10、腺嘌呤 15、2’-去氧鳥糞 嘌呤 18、2’-去氧胞嘧啶 20 與胸腺嘧啶 22 反應之 DNA 加成產物，及其 15 N 同位素標定之類似物作為內標準品，並發展穩定同位素稀釋 (stable
13
isotope dilution) 高 效 液 相 層 析 電 噴 灑 游 離 串 聯 質 譜 法 (high performance liquid chromatographyelectrospray ionization-tandem mass, HPLCEIS-MS/MS) 定量體外與體內黃樟素代謝產物 3 之 DNA 加成產 物的量。
式圖一、實驗流程圖。
SFO 3 與 2’-deoxyadenosine (2’-dAdo, 10)、adenine (Ade, 15)、
2’-deoxyguanosine (2’-dGuo, 18)、2’-deoxycytidine (2’-dCyt, 20) 和 thymidine (dThd, 22)之 DNA 加成產物之合成、純化與結構鑑定
合成15N 同位素標定之 DNA 加成產物
發展穩定同位素烯釋高效液相層析電噴灑游離串聯質譜法定量 SFO 3 與小 牛胸腺 DNA 反應之 DNA 加成產物
14
1.2 結果與討論
1.2.1 合成黃樟素代謝產物 2’,3’-環氧黃樟素(safrole 2’,3’-oxide, SFO 3)
黃 樟 素 (safrole, 1) 代 謝 產 物 ( ± )-2’,3’- 環 氧 黃 樟 素 (( ± )-safrole 2’,3’-oxide, (±)-SFO 3) 並無法經由商業採購取得，因此參照文獻 (Noller and Kneeland, 1946) 之方法製備合成 (式圖二)。 式圖二、黃樟素代謝產物 ()-2’,3’-環氧黃樟素 3 的合成。 1.2.2 2’,3’-環氧黃樟素 DNA 加成產物之合成、純化與結構鑑定 1.2.2.1 黃 樟 素 代 謝 產 物 (±)-3 與 2’- 去 氧 腺 嘌 呤 (2’-deoxyadenosine, 2’-dAdo 10) 之反應 式圖三、2’-去氧腺嘧啶 10 與()-SFO 3 之加成產物 N1-SFO-dAdo 11 與 N6-SFO-dAdo 12 的合成。
15 圖七、(A) (±)-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 在 pH 7.4, 37o C 下反應 72 小時 與(B) (±)-SFO 3 在 pH 7.4, 37o C 下反應 72 小時之高效液相層析圖譜。(C) 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 與(D)加成產物 N6-SFO-dAdo 12 之 UV 吸收 光譜圖。
將黃樟素代謝產物()-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 (2’-deoxy- adenosine, 2’-dAdo 10) 在生理條件下 (pH 7.4, 37 o
C) (式圖三) 反應 72 小時，然後 利用高效液相層析儀分析會有兩個吸收峰生成： tR = 18.6 min 與 tR = 23.2
16
後利用電噴灑游離法 (electrospray ionization, ESI) 鑑定其分子量（圖 八）。得到 N1-SFO-dAdo 11 之質荷比為: m/z 430 ([M + H]+)、452 ([M + H + Na]+)與 314 ([M - 2’-deoxyribose + H]+)，而 N6-SFO-dAdo12 之質荷比 為：m/z 430 ([M + H]+
)、453 ([M + H + Na]+)與 314 ([M - 2’-deoxyribose + H]+)，可以確定兩者皆為 10 接上 (±)-3 之後的 DNA 加成產物，因此我們 利用高效液相層析儀分離上述二產物並收集樣品進行核磁共振結構鑑定。
圖八、DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 和 N6-SFO-dAdo 12 正離子模式 下之電噴灑游離質譜圖。
17
1.2.2.1.1 DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 之結構鑑定
圖九、DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO) 光
譜圖。
加成產物 11 之 1
H NMR 光 譜 上化學 位移 6.33 之三 重峰 是 2-deoxyribose 上的 1’-H， 因此從 HMQC 光譜圖 (附圖十四) 中將與 1’-H
18 ( 6.33) 偶合的碳 ( 83.44 and 83.52) 定為 C-1’，而在 HMBC 光譜中 (圖九) 1’-H 除了與 C-1’有1JCH的偶合之外，還跟腺嘌呤上的四級碳 C-4 ( 147.15 and 147.10) 與三級碳 C-8 (138.8) 分別有 3JCH 偶合 (圖九和 DEPT 附圖十二)，在確認 C-8 的化學位移後，從 HMQC 光譜圖可以知 道 H-8 在 化 學 位 移8.34 ， 而 且 由 於 此 化 合 物 為 非 鏡 像 異 構 物 (diastereomers) 混合物，因此可以看到有些碳的訊號會分裂成兩組 (表 二)。 至於 2-deoxyribose 上的 2”-H (2.34) 和 2’-H ( 2.66)的訊號則是藉 由 H,H-COSY 光譜圖 (附圖十三) 與 1’-H 相關的交叉峰定出，根據 Wood 和 Cadet 的研究知道 2’-去氧腺嘌呤的 2-deoxyribose 部分在溶液狀態下主 要是以 C2-endo 的形式存在 (圖十) (Cadet et al., 1979)， 並且推測 2-deoxyribose 這樣的折疊方式，使得 2”-H 位在 purine 六員環的遮蔽區 (shielding zone)，相反的 2’-H 則是接近五員環的 imidazole，因此 2”-H 化 學位移會比 2’-H 位在高磁場 (upfield) 區域，同時會有特殊之偶合常數
J2”3’ = 3.1 Hz (cis) 與 J2’3’ = 6.1 Hz (trans) ( Wood et al., 1974; Cadet et al.,
1979)。所以從 800 MHz 高磁場核磁共振儀所測之氫譜計算所得到的偶合 常數，我們將高磁場化學位移2.312.36；3J2”3’ = 3.2 Hz (cis)定為 2”-H;而 低磁場 (down field) 化學位移2.632.70；3J2’3’ = 6.4 Hz (trans)定為 2’-H。
19 圖十、C2-endo 與 C3-endo 構形示意圖。 藉由已知的 C-4 在 HMBC 光譜上與三個氫： 6.33 (1’-H)、 8.26 (2-H)、 8.34 (8-H) 有3JCH之相關，可以知道化學位移 8.26 為 2-H，以 及 HMQC 的 1 JCH定出 C-2 ( 149.2)；而化學位移 156.0 的碳因為與 2-H (3JCH)有偶合但是並無與 8-H (4JCH)有偶合因此可以知道此四級碳是腺嘌呤 上的 C-6。最後利用 C-4 (147.15, 147.10) 和 C-6 (156.0) 與 2-H (8.34) 以及 C-4 (147.15, 147.10) 和 C-5 (123.6) 與 8-H (8.26) 的3JCH 偶合 可以再次驗證 2-H 和 8-H 在氫譜上訊號標定的正確性。同樣的我們從 HMBC 光譜上碳的訊號：C-a ( 109.6)、C-e ( 122.2)、C-f ( 132.13 and 132.11)，與化學位移 2.632.70 和 2.74 的氫訊號有偶合定出此兩組訊 號分別為化合物 11 上 1,3-benzodioxole 基團上的 ’-H 和 ”-H，如此我 們可以依照 H,H-COSY 光譜圖定出 -H (3.90) 與 '-H (3.673.72) 和
"-H (4.27)。最後從 C-2 和 C-6 與 '-H 和 "-H 確認加成產物 11 為 2’-去氧腺嘌呤上 N1 位置 alkylation 的 N1-SFO-dAdo (圖九和表二)。
20
表二、1
H and 13C Chemical Shifts (), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H (Hz) of Protons,
and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N1-SFO-dAdo 11.
protone (ppm) multiplicity JH,H (Hz) carbon (ppm) HMBC
(R)/(S) =1/1 (R)/(S) = 2/1 2-H 8.26 s C-2 149.2 149.2 2-H; -H 8-H 8.34 s C-8[e] 138.8 138.74; 138.79 1’-H; 8-H 6-NH n.d.[c] C-6 156.0 156.0 2-H; -H C-4[e] 147.15; 147.10 147.12; 147.07 1’-H; 8-H C-5 123.6 123.6 8-H 1’-H 6.33 t J1’2’ = 7.2[f] J1’2” = 6.4[f] C-1’[e] 83.44; 83.52 83.41; 83.48 2’-H; 1’-H 2”-H 2.312.36 ddd J1’2” = 6.4[g] J2’2” =12.8 [g] J2”3’ = 3.2[g] C-2’ 2’-H 2.632.70[d] m J1’2’= 7.2[g] J2’2” =12.8[g] J2’3’ = 6.4 [g] 3’-H 4.42 brs C-3’[e] 70.67; 70.65 70.6 2’-H; 5’-H 4’-H 3.90 brs[b] C-4’[e] 87.92; 87.94 87.9 2’-H 5”-H 3.533.56 m[b] C-5’ 61.6 61.6 5’-H 3.613.64 m[b] 3’-OH 5.37 brs 5’-OH 5.085.10 m[b] -OH 5.01 d 4.4 -H 2.632.70[d] m C- 40.7 40.7 e-H; d-H 2.74 dd 5.0; 14.0 -H 3.90 brs[b] C- 68.5 68.5 -H; -H -H 3.673.72 m[b] C- 51.4 51.4 2-H; -H 4.27 dd 2.4; 13.3
a-H 6.87 d 1.2 C-a 109.6 109.6 -H; e-H; d-H C-b 147.0 146.9 g-H; a-H C-c 145.4 145.4 g-H; e-H; a-H d-H 6.86 d 7.9 C-d 107.9 107.9 d-H
e-H 6.74 dd 1.1; 7.9 C-e 122.2 122.1 -H; e-H C-f[e] 132.13;
132.11
132.11; 132.09 -H; e-H
g-H 6.00 s C-g 100.6 100.6 g-H
[a] Diastereomeric mixture of racemic N1-SFO-dAdo 11 or (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11. [b] Unresolved multiplet due to a mixture of diastereomers. [c] n.d. denotes not detected. [d] Signals of H-2” and H- were overlapped. [e] Separated shifts due to a mixture of diastereomers. [f] Selective decoupling of H-2’ or H-2”. [g] Proton NMR spectra measured in an 800 MHz spectrometer.
21 1.2.2.1.2 DNA 加成產物 N6-SFO-dAdo 12 之結構鑑定 加成產物 12 的 HMQC (附圖二十) 光譜中出現一根化學位移 8.39 之 氫訊號與另外兩根化學位移 139.4 和164.6 之一級碳 (CH；附圖十九 之 DEPT 光譜圖) 訊號相關 1 JCH偶合， 其中C = 164.6 ppm 和 H = 8.39 ppm 未預期的訊號主要來自於甲酸銨 (HCOONH4 + ) 的干擾；並且從 HMBC (附圖二十一) 光譜圖 H = 8.39 ppm 與 C-4 ( 148.1) 和 C-5 ( 119.7) 的3JCH偶合，可以知道另一組關連訊號 C = 139.4 ppm 和 H = 8.39 ppm 則是腺嘌呤上的 C-8 與 8-H。 加成產物 12 上 1,3-benzodioxole 基團上 -H 的化學位移在 3.913.95 則 是 由 HMQC 光 譜 中 與 三 級 碳 C- ( 70.2) 的 偶 合 定 出 ， 同 時 在 H,H-COSY 的光譜中也出現了與-H 相鄰之’,”-H 和 ’,”-H 相關之交 叉峰。藉由 HMBC 光譜中與 C-a ( 109.7)、C-e ( 122.1) 與 C-f ( 132.9) 偶合之氫的訊號分別為’-H ( 2.582.63) 和 ”-H ( 2.732.80)，而另外 一組在 H,H-COSY (圖十一) 的光譜中與-H 相關之交叉峰可被定為 ’,”-H (3.46)。因為 HMBC 光譜中並無與 ',"-H 偶合的碳訊號出現， 因此無法確認 alkylation 的位置，但是從圖十一 H,H-COSY 光譜中 ’-H 和 ”-H 與 -NH ( 7.59) 交叉峰中確認加成產物 12 是 N6位置 alkylation 的 N6-SFO-dAdo 加成產物（表三）。
22 圖十一、DNA 加成產物 N6
-SFO-dAdo 12 之 H,H-COSY (500 MHz,
23
表三、1H and 13C Chemical Shifts ( ), Spin-Spin Coupling Constants, JH,H (Hz)
of Protons, and Long-Range C-H Correlations (HMBC) in N6-SFO-dAdo 12. proton [a] (ppm) multiplicity JH,H (Hz) carbon (ppm) [a]
(R)/(S) = 1/1 (ppm) [a] (R)/(S) = 2/1 HMBC Correlation(s) 2-H 8.24 s C-2 152.2 152.3 8-H [h] 8.39 s C-8 139.4 139.5 1’-H; 8-H 6-NH 7.58 s C-6 154.7 154.6 C-4 148.1 148.1 1’-H; 8-H C-5 119.7 119.7 8-H 1’-H 6.38-6.41 dd[i,j] J1’2’ = 7.2[i] J1’2” = 5.6 [i] C-1’ 84.0 84.0 2’-H; 1’-H 2”-H 2.30 ddd J1’2” = 5.6[j] J2’2” = 13.6[j] J2”3’ = 3.2[j] C-2’[f] 2’-H 2.732.80 [c] m 3’-H 4.444.47 m C-3’ 70.9 71.0 2’-H; 4’-H; 5’-H 4’-H 3.913.95[d] m C-4’ 88.0 88.0 2’-H; 5’-H 5”-H 3.56 dd 4.2; 11.8 C-5’ 61.9 61.9 5’-H 3.66 dd 4.4; 11.8 3’-OH n.d.[e] 5’-OH n.d.[e] -OH n.d.[e] -H 2.582.63[f] m C- 40.7 40.7 e-H; d-H 2.732.80[c] m -H 3.913.95[d] m C- 70.2 70.2 -H -H 3.46.[g] m C- 46.0 46.0 -H
a-H 6.85 d 0.61 C-a 109.7 109.8 -H; e-H; d-H C-b 146.9 146.9 g-H; a-H C-c 145.2 145.3 g-H; e-H; a-H d-H 6.83 d 7.9 C-d 107.8 107.9 d-H
e-H 6.71 dd 1.2; 7.9 C-e 122.1 122.2 -H; e-H C-f 132.9 133.0 -H; e-H
g-H 5.99 s C-g 100.5 100.6 g-H
HCOO[h] 8.39 s HCOO 164.6 HCOO [a] Diastereomeric mixture of racemic N6-SFO-dAdo 12 or (R)-enriched-N6-SFO-dAdo 12. [b] Unresolved multiplet due to a mixture of diastereomers. [c] Signals of 2’-H and ”-H were overlapped. [d] Signals of 4’-H and -H were overlapped. [e] n.d. denotes not detected. [f] Signals were overlapped with solvent. [g] Signals of 5’-H and -H were overlapped. [h] Signals of 8-H and HCOO were overlapped. [i] Selective decoupling of 2’-H or 2”-H. [j] Proton NMR spectra measured in an 800 MHz spectrometer.
24 1.2.2.2 黃樟素代謝產物(R)-(+)-Enriched-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 之反應 黃樟素代謝產物(±)-3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 所生成之 DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11 的碳譜訊號有些會分裂成兩組，主要是因為環氧代謝產 物與核苷酸反應後生成之加成產物為非對映異構體 (diastereomer)，造成 NMR 訊號的不同，這樣的結果也與文獻上所得到的結果一致 (Olsen et al., 2005)。為了清楚區別這些分裂的訊號哪一組是屬於 (R)-或(S)-的 3 反應 所得加成產物的訊號，進一步嘗試合成具光學活性的 3 進行核磁共振光譜 的探討。 1.2.2.2.1 合成具光學活性之(R)-(+)-enriched-SFO 3 式圖四、(R)-(+)-enriched SFO 3 的合成。
25
我們參考文獻合成具有光學活性的黃樟素代謝產物 3 (Mohan and Rao, 1998) ， 合 成 之 流 程 圖 如 式 圖 四 。 首 先 利 用 Sharpless asymmetric dihydroxylation 合成化合物 13，[25 = +21.7o (c, 0.003, CH2Cl2)，再利用手
性高效液相層析(chiral HPLC)分離決定其對映體過量百分率為 96.0% (percent enantiomeric excess)（附圖三(a)）。但是在化合物 14 ，[25 = +12.5o (c, 0.002, CH2Cl2)對映體過量百分率只有 39.7% (附圖三(b))。同樣利用手 性高效液相層析來分離化合物 3 (附圖三(c))，得到之層析峯面積比為 2:1， optical rotation 分別為[25 = +11.8o (c, 0.003, CH2Cl2)、 [25 = -11.6o (c,0.003, CH2Cl2)，對映體過量百分率為 39.3%的黃樟素代謝產物 3。 1.2.2.2.2 2’-去氧腺嘌呤 DNA 加成產物 (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 與 (R)-enriched-N6-SFO-dAdo 12 之結構鑑定 式 圖 五 、2’- 去 氧 腺 嘌 呤 10 與 (R)-(+)-enriched SFO 3 之 加 成 產 物 (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 與(R)-enriched-N6- SFO-dAdo 12 的合成。
26
圖十二、DNA 加成產物 N1-SFO-dAdo 11（下圖）與(R)-enriched-N1-SFO- dAdo 11（上圖）之13C NMR (500 MHz, d6-DMSO)光譜圖疊圖。
雖然只得到(R)/(S)為 2:1 的(R)-(+)-enriched-SFO 3 , 但是預期所得之 DNA 加 成 產 物 (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 與 (R)-enriched-N6- SFO-dAdo 12 的 13C NMR 光譜圖應該也會有 2:1 的訊號強度，因此利用 (R)-(+)-enriched-SFO 3 與 2’-去氧腺嘌呤 10 反應。
27
圖 十 三 、 DNA 加 成 產 物 (A) N1-SFO-dAdo 11 與 (B) (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 之手性高效液相層析圖。
從圖十二可以看到 (R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11 碳譜分裂的訊號具 有 2:1 的訊號強度，可以定出 N1-SFO-dAdo 11 分裂的碳譜中屬於 (R) 或 (S) 的訊號，除此之外我們也嘗試利用 Chiral HPLC 搭配 AS-H (4.6*250 mm, 5 m) 之手性層析管柱，在 isopropanol/hexane 為動相的條件下成功 的分離非對映異構體 N1-SFO-dAdo 11 與(R)-enriched-N1-SFO-dAdo 11， 並分別得到 1:1 與 2:1 之訊號強度 (圖十三)。
不過很可惜，N6
-SFO-dAdo 12 與 (R)-enriched-N6-SFO-dAdo 12 不論 在 13 C NMR 光 譜 （ 圖 十 四 ） 或 手 性 高 效 液 相 層 析 都 無 法 區 分 。 (R)-11 (S)-11 (R)-11 (S)-11
28 圖十四、DNA 加成產物 N6
-SFO-dAdo 12 (下圖）與(R)-enriched-N6- SFO-dAdo 12（上圖）之13C NMR (500 MHz, d6-DMSO) 光譜圖疊圖。
1.2.2.3 N1-SFO-dAdo 11 經 由 Dimroth rearrangement 重 排 形 成
N6-SFO-dAdo 12
根據 過去 文 獻上 環 氧 黃 樟素 代 謝產 物 (propylene oxide, butadiene oxide, styrene oxide)與 2’-去氧腺嘌呤 10 反應的研究中知道，2’-去氧腺嘌 呤 10 上的 N1 是進行親核反應形成 N1-dAdo 加成產物的主要位置，再經 由 Dimroth rearrangement 形成 N6
-dAdo 加成產物。Dimroth rearrangement 反應機制主要是經由鹼催化打開 2’-去氧腺嘌呤 10 的六員環再重新合環
29
(recyclization)使得環上的氮原子(N1)與環外的氮原子(N6)位置交換 (圖十 五) 形成 N6
-dAdo 加成產物 (Kim et al., 2000)。
圖十五、Dimroth rearrangement 反應機制圖。
圖十六、N1-SFO-dAdo 11 在 0.2N K2HPO4 (pH 7.4)，37 o
C 下進行 Dimroth rearrangement 反應轉換成 N6-SFO-dAdo 12 之高效液相層析圖譜。
30
為了印證 Dimroth rearrangement 的反應，我們將 N1-SFO-dAdo 11 配 製在 0.2 N K2HPO4 (pH 7.4) 的溶液，並在 37
o
C 下利用高效液相層析儀監 控其重排反應 （圖十六），實驗結果顯示在此條件下反應 24 小時後會有 一半量的 N1-SFO-dAdo 11 經由重排反應轉換成 N6-SFO-dAdo 12。
在 styrene oxide (SO)與 2’-去氧腺嘌呤反應所形成不同的方位異構物 (regioisomer) 加成產物中，不同於 styrene oxide，此反應中 2’-去氧腺嘌呤 並無攻擊 SFO 的位置與去氨基 N1-肌嘌呤(N1-inosine, N1-dIno) 的加成產 物生成 (圖十七）( Qian and Dipple, 1995; Selzer and Elfarra, 1996; Barlow et al., 1997; Barlow et al., 1998)。
圖十七、Styrene oxide (SO) 與 2’-去氧腺嘌呤反應所形成之 DNA 加成 產物。
31
去氨基化 (Deamination). 在 N1-alkyladenine 的 DNA 加成產物去氨基 化必須在 N1 氮取代基上的碳必須被質子化產生正電荷(Shapiro and Klein, 1966; Barlow et al., 1997)，但是對於簡單的 N1-alkyladenine 的結構去氨基 化的速率仍然是非常的慢 (Macon and Wolfenden, 1968)。可是 Styrene oxide 的 DNA 加成產物 N1-(2-hydroxy-1-phenylethyl)adenosine 卻非常容易 進行去氨基化（圖十八），因此推測烷基鍊上的羥基在去氨基化的過程中 扮演著鹼催化角色將水分子去質子化，雖然一級醇與二級醇的 pKa 相近 (Shapiro and Klein, 1966; Barlow et al., 1997)，因此 N1-SO-dAdo 上的一 級醇可以促進快速的去氨基化，而擁有二級醇的 N1-SO-dAdo 則是因為 立障(steric effect)大於一級醇而不利於去氨基化的進行 (Qian and Dipple, 1995; Barlow et al., 1997)。
圖十八、Styrene oxide (SO) 之 DNA 加成產物 N1-SO-dAdo 去氨基形成
32
N1-或 N6-腺嘌呤的 alkylation 通常與 AT 鹼基配對的突變有關，在 氧化苯乙烯 (styrene oxide) 主要因為 AT→GC 同類置放 (transition) 造 成 的 亞 黃 嘌 呤 一 鳥 糞 嘌 呤 磷 酸 核 糖 基 轉 基 酶 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, hprt) 突變 (Bastlova and Podlutsky, 1996) 以 及在 N-ras gene codon 61 發現苯乙烯氧化物的 N6
-腺嘌呤 DNA 加成產物 並造成 AT→GC 同類置放 (Latham et al., 1993)，而丁二烯 (butadiene) 暴露的動物實驗主要也是造成 AT 鹼基配對的錯誤 (Sisk et al., 1994; Recio and Meyer, 1995)。其中又以 N1-腺嘌呤 DNA 加成產物致突變性較
N6-腺嘌呤 DNA 加成產物高，此現象主要因為 N6-腺嘌呤的 DNA 加成產 物還是可以與 thymidine 作用，而 N1-腺嘌呤加成產物會破壞氫鍵作用。
1.2.2.4 黃樟素代謝產物 (±)-SFO 3 與腺嘌呤 (Adenine, Ade 15) 之反應
式 圖 六 、 腺 嘌 呤 15 與 ()-SFO 3 之 加 成 產 物 N3-SFO-Ade 16 與
33 圖十九、(A) (±)-SFO 3 與腺嘌呤 15 在 pH 7.4, 37o C 下反應 72 小時與(B) (±)-SFO 3 在 pH 7.4, 37oC 下反應 72 小時之高效液相層析圖譜。(C)加成產 物 N3-SFO-Ade 16 與 (D)加成產物 N9-SFO-Ade 17 之 UV 吸收光譜圖。 為了得到大量的 N3-腺嘌呤 DNA 加成產物，我們利用腺嘌呤 15 與 與 (±)-SFO 3 在生理條件下 ( pH 7.4, 37o C )反應 (式圖六) 72 小時，從高 效液相層析圖譜（圖十九）觀察到在滯留時間 tR = 18.6 min 與 tR = 22.7 min 會有兩個新生成的層析峯，分別收集後利用電噴灑游離法鑑定其分子量 （ 圖 二 十 ）， 可 以 得 知 兩 者 為 具 有 相 同 分 子 量 以 及 相 同 碎 片 (m/z =
34 314→136)，但不同 UV 吸收波長 [max = 271 nm (16)、260 nm (17)] 之 (±)-SFO 3 與腺嘌呤 15 反應的方位異構物 (regioisomer)，因此我們分別收 集這兩個 DNA 加成產物，並進一步利用核磁共振光譜進行結構鑑定。 圖二十、 加成產物 N3-SFO-Ade 16 和 N9-SFO-Ade 17 正離子模式下之 電噴灑游離質譜圖。 1.2.2.4.1 DNA 加成產物 N3-SFO-Ade 16 之結構鑑定 首先將加成產物 16 之 1 H NMR 光譜中(附圖二十四)化學位移 = 8.01 和 7.86 ppm 分別定為腺嘌呤上的 2-H 和 8-H，因為根據文獻的研究 指出腺嘌呤上 2-H 的化學位移比 8-H 的位在較低磁場區 (Iyer et al., 1994; Krouželka et al., 2008);接著再由 DEPT (附圖二十六) 和 HMQC (附圖二十
35 八) 之光譜圖可以定出13C NMR 光譜圖上化學位移= 143.3 和= 152.3 ppm 的次甲基 (methine, -CH) 分別為 C-2 和 C-8。化學位移 118.9 之四級 碳則是藉由加成產物 16 的 HMBC 光譜圖 (圖二十一) 上與 8-H (3 JCH;強) 及 2-H (4 JCH;弱) 的偶合(coupling)將其定為腺嘌呤 15 上的 C-5，此化學位 移與 styrene oxide 與腺嘌呤 15 的加成產物 3-(2-hydroxy-2-phenylethyl) adenine (C-5, 120.3)相近(Krouželka et al., 2008)。
進一步依據 3-(2-hydroxy-2-phenylethyl)adenine (C-4, 149.7; C-6, 155.0) (表四) 的結果將此化合物在碳譜上化學位移 148.2 定為 C-4 與另一個化學位移 156.7 定為 C-6，並且從 HMBC 光譜 C-4 ( 148.2) 與 2-H (3 JCH;強)的偶合; C-6 ( 156.7) 與 2-H (3JCH) 及 8-H (4JCH)的偶合 確認 C-4 與 C-6 的訊號的標定，而上述 C-4、C-5、C-6 與氫之間卻有一 些不常見的偶合訊號出現在 HMBC 光譜圖中：包括一組 3 JCH 偶合 (C-4 對 8-H) 消失以及出現兩組4 JCH (C-5 對 2-H；C-6 對 8-H) 偶合的訊號，這 現象的發生有可能是這些碳原子的特殊混成 (hybridizations) 或者其他未 知的因素所造成 (R. M. Silverstein)。
36
圖二十一、DNA 加成產物 N3-SFO-Ade 16 之 HMBC (500 MHz, d6-DMSO)
光譜圖。
由於有兩組氫在化學位移 2.582.60 以及 2.89 ppm 在 HMBC 光譜 上與 C-a、C-e、C-f 偶合因此分別定為’-H 和 ”-H，接著再藉由 DEPT, HMQC 以及 H,H-COSY (附圖二十七) 等光譜圖可以定出氫的化學位移 3.994.03 和 4.35 分別為另一組亞甲基 (methylene, -CH2) ’-H 和 ”-H，
![圖 三 十 三 、 N7 -SFO-Gua 19 (330 152) 與 [ 15 N 5 ]- N7 -SFO-Gua 19](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/9libinfo/7492104.115308/87.892.134.816.110.397/圖三十三N7SFOGua1933152與15N5N7SFOGua19.webp)
