第三章 實驗材料與方法
第三節 樣品製備
將乾燥山萵苣粉碎，將山萵苣粉末（600 g）以 1：20 比例加入 甲醇 12L，靜置 24 小時後，用濾紙過濾，將濾液進行減壓濃縮，得 到山萵苣粗萃物 72.07g。
二、分配層析
濃縮所得之萃取物以二次水與乙酸乙酯進行分層，加入 500 mL 二次水與粗萃物溶解均勻後倒入 500 mL 乙酸乙酯均勻混合，靜置使 其分層，上層液為乙酸乙酯層，下層液為水層，重複加入乙酸乙酯與 二次水進行分配萃取，此動作重複四次，分別將水層與乙酸乙脂層進 行減壓濃縮，得到山萵苣乙酸乙酯層粗萃物 12.90 g，水層初萃物 57.98 g。
三、乙酸乙酯層之管柱層析
1.樣品前處理：取10 g山萵苣乙酸乙酯層粗萃物，加入適量溶劑（Ethyl acetate）使其溶解。
2.秤取適量 silica gel 60， 加入適量溶劑（Ethyl acetate：n-Hexane＝7：
3）， 攪拌成泥狀後倒入管柱中，選用管柱直徑為6 cm，管柱中填充 矽膠高度約42 cm，敲打管柱使氣泡消失。
3.載入樣品，沖提液從 H：E＝7：3→ H：E＝5：5 → H：E＝3：7 →
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E → E：M＝7：3 → E：M＝5：5 → E：M＝3：7→M，每個沖提比 例皆加入 500 mL，最後再加入 500 mL Methanol，將殘留於在管柱中 的樣品全部沖出。
備註：H：n-Hexane，E：Ethyl acetate，M：Methanol。
4.每100 mL收集一瓶，共收集40瓶。
四、水層之管柱層析
1.樹脂前處理：秤取適量的Diaion HP 20 ，加入約樹脂5倍量的乙醇 沖洗，再以二次水沖洗至無乙醇味即可使用，待管柱層析結束後，須 將樹脂清洗乾淨並保存於 75％的乙醇中。
2.填充管柱：將Diaion HP 20與二次水混合均勻，填入管柱中，選用 管柱直徑為6 cm，管柱中填充高度約42 cm。
3.載入樣品：取 55 g 山萵苣水層粗萃物，加水回溶，並載入管柱內，
充提液從 100％ H2O → 20％ EtOH → 40％ EtOH → 60％ EtOH → 80％ EtOH → 95％ EtOH，每個沖提比例皆加入 500 mL，最後再加 入 95％ EtOH 1000 mL，將殘留於在管柱中的樣品全部沖出。
4.每 100 mL 收集一瓶，共收集 35 瓶。
五、薄層色層分析（Thin-Layer Chromatography）
方法：
將管柱層析法所得山萵苣的樣品點在 TLC 片進行成分分離，放
24 diphenylborate 100 μL，最後總體積為 200 μL，在室溫下避光振盪 10 分鐘，混合均勻後，測量吸光值 405 nm。以 Rutin 為標準品，並作一
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以 Gallic acid 為標準品，並作一校正曲線，換算每克萃取物中所含相 當於 Gallic acid 毫克數。
3.DPPH 自由基清除試驗 操作：
以適當的樣品濃度，在 96 微孔盤中加入樣品溶液，再依序加入 甲醇和40 μL DPPH 甲醇溶液（1 mM），最後總體積為 200 μL，在同 一 96 微孔盤中加入一槽控制組（160 μL 甲醇、40 μL DPPH 甲醇溶液）
及對照組（Quercetin）。
檢測：
在室溫下避光震盪10分鐘混合均勻後，使用微量盤光度計測量吸 光值其吸光為540 nm，吸光值越低，表示DPPH自由基被清除能力越 佳。
清除率(％) =【1－（ODsample值 / ODcontrol值）】*100 4.ABTS 自由基清除試驗
操作：
ABTS 配製完成後，需避光室溫下靜置反應 1 小時，使其產生穩 定藍綠色 ABTS．+自由基水溶液。以適當的樣品濃度，在 96 微孔盤 中加入適當濃度的樣品溶液20 μL，再加入 180 μL ABTS．+自由基溶 液，最後總體積為200 μL，在同一 96 微孔盤中加入一槽控制組（20 μL
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二次水、180 μL ABTS．+自由基溶液）及一槽對照組（Quercetin）
檢測：
在室溫下避光震盪10分鐘混合均勻後，使用微量盤光度計測量吸 光值其吸光為620 nm，吸光值越低表示抗氧化能力越強。
清除率(％) =【1－（ODsample值 / ODcontrol值）】*100 5.還原力測定試驗
操作：
以適當的樣品濃度，在微量離心管中加入樣品溶液，並依序加入 160 μL Phosphate bufer pH 6.6（0.2 M）、200 μL 赤血鹽（K3Fe(CN)6，
Potassium ferricyanide，1 ％），總體積為 400 μL，混合均勻後於 50 ℃ 水浴中反應 20 分鐘，之後迅速冷卻 10 分鐘，再加入 200 μL TCA
（Trichloroacetic acid）（10 ％），混合均勻，以 3000 rpm 離心 10 分 鐘，取75 μL 上清液加入 96 微孔盤，再加入 75 μL 二次水，最後加 入30 μL FeCl3 .6H2O（Ferric chloride）（0.1 ％）混合均勻，在同一盤 中加入控制組及對照組（Quercetin）。
檢測：
使用微量盤光度計測量吸光值其吸光為 620 nm，吸光值愈高表 示還原能力越強。
製作檢量線：
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標準品為維生素 C，分別以個別濃度測其還原力，步驟同上檢測，
得到 OD620數據（y）和維生素 C 濃度（x, ppm）做出檢量線。將所 測得數值帶入檢量線中，求出相對於維生素 C 之濃度。
6.抑制 Liposome 脂質過氧化試驗 操作：
取 300 mg 之卵磷脂, 加入 30 mL 之 10 mM NaH2PO4緩衝溶液
（pH 7.4）, 以均質機攪拌成均質懸浮液, 製備成微脂粒溶液(10 mg/
mL)。反應液中含有 0.1 mL 的微脂粒懸浮液、0.1 mL 的 800 μM FeCl3、 0.1mL 的 1600 μM Ascorbic acid、10 mM NaH2PO4緩衝溶液（pH 7.4）
和不同濃度樣品，及不添加樣品之空白試驗同時進行。將此反應液置 於 37 ℃烘箱中 1 小時後，加入 0.2 mL 的 TCA-TBA-HCL，並於 90 ℃ 水浴加熱 15 分鐘，冷卻，以 10000 rpm 離心 10 分鐘，取 200 μL 上 清液加入 96 微孔盤。
檢測：
使用微量盤光度計測量吸光值，其吸光為540 nm，吸光愈低表示 抑制率愈好。
抑制率(％)= 【1－（ODsample值 / ODcontrol值）】*100 七、美白試驗
1.抑制酪胺酸酶活性試驗
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操作：
先配置 25 mM 的 NaH2PO（pH 6.8）4 ，7.6 mM 的 Dopa 和 100 uint/
mL 的酪胺酸酶。以適當的樣品濃度，在 96 微孔盤中加入適當濃度的 樣品溶液75 μL，再加入 25 μL 100 uint/ mL 的酪胺酸酶，最後以八爪 迅速加入100 μL7.6 mM 的 Dopa，總體積為 200 μL。
檢測：
使用微量盤光度計測量吸光值，其吸光為450 nm，利用0分及10 分的數值，計算抑制率。
抑制率(％)=｛1－【(ODsample-10 min－ ODsample-0 min) / ODcontrol 】｝ *100 八、高效能液相層析
1.指標成分之配置：
1.1 內標準品：
配置1,000 ppm的BPB（n-butyl p-hydroxy benzoate）70％乙醇溶液，
做為內標準品（IS）溶液。定量時，各樣品均含有10 ppm的BPB。
1.2 指標成分溶液之配置與製作檢量線：
指標成分Caffeic acid，Protocatechulic acid，Methyl p-hydroxybenzoate，
Luteolin 7-O-β-glucopyranoside，Quercetin 3-O-β-glucopyranoside，分 別配置為5 ppm、10 ppm、20 ppm、50 ppm和100 ppm之70％乙醇溶液，
以最適化條件，重複兩次注射，每次注入10 μL，取其平均值，作一
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檢量線。
1.3 HPLC分析最適條件：
(1) Column：RP-18 column（250mm×4.6mm，5μm）
(2) Mobil phase A： H2O（0.1％ H3PO4）
Mobil phase B：MeOH：H2O＝80：20（v/v）
(3) Detector：HITACHI L-7455，Photo-diode Array, PDA（254 nm）
(4) Flow rate：0.8 mL/ min (5) Injection volume：10 μL (6) 梯度沖提：
表1、山萵苣之HPLC沖提梯度
Time（min） Flow rate（mL/min） A（％） B（％）
0 0.8 100 0
40 0.8 20 80
45 0.8 0 100
65 0.8 0 100
70 0.8 100 0
(7) 指標成分檢量線：
以層峰面積與內標準品面積比值（y）對各成分濃度（x, ppm）作圖，
得各成分之檢量線及線性範圍。
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表2、山萵苣指標成分之檢量線
Compound Regression equation R2 Caffeic acid y=0.047x+0.037 R2=0.996 Methyl p-hydroxybenzoate y=0.094x-0.013 R2=0.999 Protocatechulic acid y=0.070x+0.002 R2=0.999 Luteolin 7-O-β-glucopyranoside y=0.072x-0.255 R2=0.997 Quercetin 3-O-β-glucopyranoside y=0.044x+0.317 R2=0.992
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第四章 結果與討論