第三章 材料與方法
第四節 樣本分析
將採樣完畢之膠片從轉輪上取下，按採樣時間裁剪成七天份，每48mm 剪成 一段代表24 小時（一天）的暴露，以10% Mowiol 將剪好之膠片固定在標示好日 期的載玻片上，並使用Glycerin-jelly 染色後，再以光學顯微鏡於800 倍率下 進行鑑定及計數。真菌孢子之鑑定是參考美國過敏、氣喘及免疫學會(American Academy ofAllergy, Asthma & Immunology, AAAAI)的分類建議，所鑑定之真菌 孢子種類包括下列24種：
Ａscospores、Ｂasidiospores、
Alternaria、Arthrinium、
Aspergillus/Penicillium、Botrytis、Cercospora、Cladosporium、Curvularia、
Drechslera/Helminthosporium、Epicoccum、Fusarium、Nigrospora、
Oidium/Erysiphe、Periconia、Peronospora、Pithomyces、Polythrincium、
Rusts、Smuts
、Stemphylium、Tetraploa、Torula
以及Ulocladium
，不屬於上 述24 類者則歸類為unidentified spores 。Aspergillus/Penicillium
、Drechslera/Helminthosporium
及Oidium/Erysiphe
因為在型態上很難區分，故 合併成一類。每日真菌孢子濃度的計算公式如下：
貳、 真菌過敏原
採樣完畢之濾紙在經過裁剪後，將部份濾紙利用PBS（Phosphate Buffered Saline）震盪萃取6 小時（130 rpm/min）後，使用凍乾機（Freeze Drying FDU-1200, EYELA Tokyo RikakikaiCo., LTD, Japan）將萃取液凍乾成粉末狀，上機分析前 再以去離子水還原成液狀進行分析。真菌過敏原的分析使用酵素連結免疫分析法
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）進行，分析的過敏原為
Cladosporium herbarum
（Cla h
1）。分析方法參考Indoor Biotechnologies Inc.所提供的標準操作步驟（附錄壹至參），依序將抗原或抗體、標準品、樣本，加 入96 孔盤 （NUNC, Apogent Technologies Inc.,Denmark）中，利用Multiskan Ascent ELISA reader （Thermo Electron Co., MA, USA）在405 nm 之波長下 讀取樣本和標準品的吸光值，依照標準品的吸光值及濃度製成檢量線，最後將讀 取之吸光值利用檢量線推算出樣本濃度，再依照採樣器流量換算成採樣當天大氣 中的濃度。濃度計算公式如下：
此過敏原的偵測極限(LOD)為0.039 ng/m3。
1.13(m3/min)×60min/hr×24hr(採樣期間之流量)×分析濾紙比例
參、 細菌內毒素
將部份採樣完畢的濾紙以無熱原水(LAL Reagent Water, LRW) 震盪萃取6 小時（220 rpm/min），經前述凍乾程序後，將樣本保存於-20℃下，分析時再以 無熱原水還原成液狀。內毒素是利用馬蹄蟹變形細胞溶解試驗分析法(Limulus Amebocyte Lysate, LAL)進行。試驗的進行是將定量的Pyrochrome（熱質呈色劑）
加入樣本中，於37 ℃下培養混合液，利用Multiskan Ascent ELISA reader
（Thermo Electron Co., MA, USA）在405 nm 之波長下讀取樣本和標準品的吸 光值，依照標準品的吸光值及濃度製成檢量線，最後將讀取之吸光值利用檢量線 推算出樣本濃度，再依照採樣器流量換算成採樣當天大氣中的濃度。濃度計算公 式如下：
細菌內毒素標準品及分析套組是向Associates of Cape Cod, Inc.(MA, USA) 訂購。細菌內毒素在本研究中的最低偵測極限濃度為0.012 EU/m3。
1.13(m3/min)×60min/hr×24hr(採樣期間之流量)×分析濾紙比例
肆、 品質保證與控制 一、 採樣過程
(一)、真菌孢子
將透明膠片 (Melinex tape) 固定於轉輪上時，所有工具器皿使用前皆須清 潔消毒。每次採樣前以流量計校正Burkard連續性孢子採樣器之流量至10 LPM後 再開始進行採集。
(二)、真菌過敏原及細菌內毒素
採樣前石英濾紙 (Quartz filter, Pall Corporation, NY, USA)需先放入 灰化爐以512°C 烘5 小時，去除有機雜質，再用UV 進行2 小時殺菌後，裝進無 菌之乾淨夾鏈袋中，放至乾燥箱保存直到開始採樣。每次採樣會將裝有濾紙之乾 淨夾鏈袋，從實驗室和要進行採樣之濾紙一起攜至採樣地點，於現場不進行採樣 之濾紙，作為空白樣本(field blanks)，每三天需做一次空白樣本，空白樣本 數目不得低於總樣本數之10%，以確保在運送過程及採樣過程沒有受到汙染。採 集後的樣本立即存放於-20℃冷凍保存，避免在分析前有微生物生長影響結果。
高流量採樣器每次採樣前需進行流量校正，每採集兩季需更換馬達碳刷；每 更換三次碳刷則需進行一次保養以及更換馬達，確保儀器運作品質。
二、 樣本分析
(一)、真菌孢子
玻片樣本皆由一人進行鑑定，以避免人為造成之誤差(inter-person
variation)。鑑定時參考美國過敏、氣喘及免疫學會（American Academy of Allergy,Asthma & Immunology, AAAAI）分類圖鑑（Muilenberg, 1999）、行政 院農業委員會農業試驗所發行之台灣南部大氣真菌孢子圖鑑（行政院農業委員會 農業試驗所，2004），以及Sampling and Identifying Allergenic Pollens and Moulds (Smith, 2000)。
(二)、真菌過敏原
所使用之pipettes 及天秤定期請廠商做校正，以確保一致性、避免誤差產 生。在ELISA 分析時，留有兩個空白樣本，以確保藥品和分析過程中没有汙染。
檢量線為二重複（duplicate），且其相關係數須大於0.995 才可進行樣本濃度 分析。
(三)、細菌內毒素
1. 內毒素標準品
內毒素標準品在還原後，必須於五天內使用完畢，以確保濃度與檢量線的穩 定性。在配製標準品時，使用有適當體積的pipette 來減少稀釋次數，以達到最 大的準確度。
2. 正向控制（Positive controls）
如果內毒素標準品序列稀釋和positive product controls（正產品控制）
的製備方法不同，則必須做positive control （一個單一標準內毒素濃度）。
Positive control的內毒素濃度應該要等於檢量線中點的濃度值。若檢量線是由 4、5 或6 次二倍稀釋標準內毒素所產生，可以4λ（λ為內毒素標準序列稀釋中 的最低濃度，即偵測極限）做為positive control 的濃度。
3. 正產品控制（Positive product controls）
Positive product controls 為抑制/放大控制（inhibition/enhancement controls），是由添加內毒素標準品後的樣本或稀釋樣本所製成。測試樣本中所 加入的內毒素的濃度應該與positive control 的內毒素濃度相同。每次測試中 都有包含positive product controls。
4. 負向控制（Negative Controls）
每個測試都用無熱原水做負向控制，確保分析盤未受汙染。
三、 資料建檔
所有的資料建檔由兩位人員進行交叉比對，以避免建檔時產生的錯誤。
伍、 試劑與藥品 (一)、真菌孢子
1. Glycerin jelly
20 g Gelatin
60 ml Glycerin
70 ml Distilled water
4 g Phenol
適量Phenosafranin
2. Lubriseal stopcock grease (A.H. Thomas Inc., Philladelphia, PA) 3. 70 % Ethanol
4. Mowiol
(二)、真菌過敏原
1. 過敏原之ELISA kit (Indoor biotechnologies Inc., VA, USA & Greer Laboratories Inc., NC, USA)
Cla h 1：包括Cladosporium Herbarum antigen XPM9-D3A2.5 及 anti-Cladosporium herbarum ZA-CH-01。以上皆冷藏於4°C。
2. 50 mM carbonate-bicarbonate buffer
Na2CO3
NaHCO3
3. Phosphate buffered saline, containing 0.05% Tween 20 (PBS-T)
NaCl
KH2PO4
Na2HPO4
KCl
Thimerosal
Tween 20
4. 1mM ABTS in 70mM citrate-phosphate buffer
Anhydrous citric acid
Dibasic Na Phosphate·7H2O
5. H2O2
6. anti-rabbit IgG
7. Streptavidin-Peroxidase 8. bovine serum albumin
9. 2,2＇-Azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt
(三)、細菌內毒素
1. Pyrochrome
2. Pyrochrome Reconstitution Buffer 3. Control Standard Endotoxin, CSE 4. Microplates
5. Parafilm M® (American National Can) 6. LAL Reagent Water（LRW）
7. Nonpyrogenic test tubes (NUNC)