2-1： 材料與方法
2-1-1： 檢體與取樣(tissues)
本實驗檢體取自在中國醫藥學院附設醫院婦產科接受子宮內膜異 位囊腫切除手術所之檢體，選擇三位患者，年齡分別為 23、28、32 歲，開 刀前三個月未曾使用過賀爾蒙藥物。取出之檢體剝取內膜囊腫的裏層子宮 內膜異位組織，而子宮腔內之子宮內膜的組織則以刮匙刮取少許子宮腔內 之子宮內膜，部份以液態氮急速冷凍隨即保存於-80°C 冰箱中，另一部份以 4% formaldehyde/2% glutaraldehyde 固定，以 hematoxylin & eosin 染色，
確定子宮內膜的組織是處於增殖期或分泌期，其中增殖期為 2 位，分泌期 1 位。
2-1-2. RNA 之萃取(Trizol RNA extraction)：
2-1-2-A： 儀器
1. Source capture system (Germfree Laboraties) 2. Centrifuge 5810R (Eppendorf, Germany) 3. Microcentrifuge (Uover Laboratories, USA) 4. Spectrafuge 16M (National Labnet, USA) 5. TM firestek B206 (Firstek Scientific)
6. Minigel Migration Trough Mupid-2 (Cosmo Bio Co LTD, USA) 7. Rocker platform (Bellco Biotechnology, USA)
8. UV box TFX 20 M (vukber Lourmat, France) 9. DS34 Polaroid Electrophoresis hood (UK) 2-1-2-B： 試劑
1. Trizol Reagent (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) 2. 1X TBE Buffer
3. 2 % Agarose 4. Chloroform 5. Isopropanal 6. Ethyl glycol
7. Diethyl pyrocarbonate
8. Ethidium bromide (10mg/ml)
u Ethidium bromide 1 g
u Dissolved in 100 ml distilled H2O ， store at room temperature，避光。
2-1-2： 反轉錄(Reverse transcription, Promega)：
2-1-2-A：儀器：
1. TM firestek HB-100 (Firstek Scientific) 2. TM firestek B206 (Firstek Scientific) 2-1-2-B： 試劑：
1. Random primer (0.5
µ
g/µ
l of Promega) 2. Oligo-dT primer (0.5µ
g/µ
l of Promega) 3. MMLV RT buffer (Promega)4. 0.1 M DDT(dithiothreitol)
5. dNTP(100 mM, 25mM each, Protech) 6. RNAsin (Invitrogen, 10 units/
µ
l)â 置於-80°C 冰箱中保存。
2-1-3：Polymerase chain reaction using degenerate primers 2-1-3-A：儀器：
1. PCR system 2400 (Perkin Elmer, USA)
2. Minigel Migration Trough Mupid-2 (Cosmo Bio Co LTD, USA) 3. Rocker platform (Bellco Biotechnology, USA)
4. UV box TFX 20 M (vukber Lourmat, France) 5. DS34 Polaroid Electrophoresis hood (UK) 2-1-3-B：試劑
1. 10 X PCR buffer 2. 2.5 mM dNTP 3. MgCl2
4. 20
µ
M cadherin degenerate forward primer (sequence 見 Table 1) 5. 20µ
M cadherin degenerate forward primer (sequence 見 Table 1) 6. Taq polymerase7. DNA- Gel-loading buffer (6X)
u Bromophenol blue 0.25 ml u Xylene cyanol FF 0.25 ml u Ficoll 15 ml u Add H2O to 100 ml
2-1-3-C：步驟：
â 將 2-4
µ
l cDNA 加入 ddH2O 至 35µ
lâ 加入 5
µ
l of 10X PCR buffer、5µ
l of 2.5 mM dNTP、2µ
l of MgCl2、 1µ
l of 20µ
M forward primer、1µ
l of 20µ
M reverse primper、1µ
l of Taq polymerase，總共 50µ
l。â 以聚合連鎖反應(PCR)之儀器進行反應。(反應條件見 Table 2) â 將所得的 DNA 產物將用來植入 PCR-II vector。(見 Figure 3)
Table 1. Primers used in degenerate and semiquantitative RT-PCR assays
Gene primer sequence size
Degenerate cadherin Forward 5’-GAATTCACNGCNCCNCCNTAYAYGA 170 bp Reverse 5’-GAATTCTCNGC NARYTTYTTRAAR*
E-cadherin Forward 5’-TCCATTTCTTGGTCTACGCC 361 bp Reverse 5’-CACCTTCAGCCAACCTGTTT
P-cadherin Forward 5’-GACCAACGAGGCCCCTTTTGTGCTG 357 bp Reverse 5’-GTGGTGGGAGGGCTTCCATTGTCCA
N-cadherin Forward 5’-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC 373 bp Reverse 5’-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG
Cadherin-6 Forward 5’-TTCTTGCTGCTCTTTTGGGT 275 bp Reverse 5’-CCTGCTCCATCTCCTGAAAG
Cadherin-9 Forward 5’-CAAAACCTGGGCAGTTGATT 416 bp Reverse 5’-CCTCTTCAATGCAGCAAACA
Cadherin-11 Forward 5’-ACCAGATGTCTGTGTCAGA 742 bp Reverse 5’-GTCATCCTTGTCATCTGCA
GAPDH Forward 5’-CCAGCCGAGCCACATCGCTC 359 bp Reverse 5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT
*R = either A or G, Y = either C or T, N = either A, C, G, or T
Table 2, PCR conditions
2-1-5：Ligation、transformation and bacterial growth 2-1-5-A：儀器
1. TA cloning Kit Dual Promoter 2. Microcentrifuge
4. Luria-Bertani (LB) medium and agar 5. Dimethylformamide (DMF)
6. 40 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3indolyl-
β
-galactoside (X-Gal) in DMF 7. 50 mg/ml ampicillin stock8. 50 mg/ml kanamycin
9. 100 mM isopropyl-
β
-D-thiogalactoside (IPTG)10. One Shot cells ( INVáF’ One Shot Competent Cells & TOP10F’
One Shot Competent Cells ) 2-1-5-C： 步驟
[ Ligation (Clone into PCR II vector )
â 離心一瓶(vial)PCR II (見 Figure 3. )，然後收集上清液。
â 計算 PCR product 所需的量(公式 X ng PCR product = Y bp PCR product 乘以 x 50 ng PCR vector 除以 size in bp of the PCR II vector：~3900)
â 轉換成為體積 X
µ
lâ PCR product X
µ
l 加入 10 X ligation buffer 1µ
l 再加入 PCR II vector(25ng/µ
l) 2µ
lâ 加入無菌的純水(sterile water)至 9
µ
lâ 加入 T4 DNA ligase (4.0 Weiss units) 1
µ
總共 10µ
lâ 放置於 14
°
C 水槽(water bath)至少 4 小時，最好 overnight â store -20°
C 冰箱中。Figure 3. Schematic representation of PCR-II vector
[ Transformation 50
µ
g/ml kanamycin or ampicillin)â 每種至少放入兩種不同量，至少有一種 well-spaced colonies â 確定凝固後，將 plates 顛倒置於 37
°
C 的 incubator 至少 18 小時
â 置於 4
°
C 冰箱 2~3 小時以利顏色之形成。(見 Figure 4)Figure 4. Agar plate for transformed bacterial selection. 當 被 含 有 cadherin product 所 clone 的 PCR II vector 轉植成功的 TOP10F’細胞則形 成白色菌落，若不含有 cadherin product 所 clone 的 PCR II vector 轉植成 功的 TOP10F’細胞則形成藍色菌落，若轉植不成功的 TOP10F’細胞則無法 成長形成菌落。
[ Bacterial growth
â 取出至少 10 個白色菌落(white colonies)(本篇為 30 個)
â 置於 2~5 ml LB broth ( 加入 50
µ
g/ml ampicillin or 50µ
g/ml kanamycin) overnight 日後做 plasmid 分析。2-1-6：Plasmid DNA extraction and DNA sequence 2-1-6-A：儀器
1. Microcentrifuge
2. Gene-spin Miniprep Purification Kit( Beckman CEQ2000, ABI377, LICOR IR2, Pharmacia A.L.F.)
2-1-6-B：藥劑
1. Gene-Spin Kit reagents u Solution I
u Solution II u Solution III u Wash Solution
2. Restriction Enzyme 10 X buffer H
[ Plasmid DNA extraction
â 取 1~2 ml 放置 overnight 的 culture â 置於 12000~14000rpm 離心 30~60 秒
â 加入 200
µ
l Solution I，Vortex 直至細胞完全溶解 â 加入 200µ
l Solution II，輕輕上下搖晃 5~6 次 â 加入 200µ
l Solution III，輕輕上下搖晃 5~6 次â 置於 12000~14000rpm 離心之 5 分鐘
â 將 spin column 放入收集管(collection tube)，小心將上清液移 入 spin column
â 再將新的 microcentrifuge tube 放入 column
â 加 50~100
µ
l H2O or TE 至 column ( 若 plasmid > 7kb 則使用 60~70°
C 的 H2O or TEâ 離心 1 分鐘，以移出 DNA，置於-20
°
C 冰箱保存。â 重覆上述兩個步驟可多得 10~15% DNA [ DNA sequencing
â 將所得到的 plasmid DNA 取出 1
µ
g â 加入 EcoR I restriction Enzyme 1µ
l â 加入 assay buffer 50µ
lâ 加入 Acetylated BSA 直至 0.1 mg/ml â 置於 37
°
C 1 小時â 將所得的產物以電泳分析是否含有約 170 bp 的典型鈣粘蛋白 (見 Fig 5)
â 使用 automated DNA sequncer 分析 DNA sequence
â 得到的 sequence 利用網路上 BLAST computer program 與 Genbank/EMBL 的資料比對以確認找到的鈣粘蛋白亞型
2-2： 結果
第一階段實驗我們發現在子宮內膜異位組織共有六種典型鈣粘蛋 白亞型：分別為 E-cad、N-cad、P-cad、Cad-6、Cad-9、Cad-11 其出現 比例如 Table 3。
Figure 5. A representative photomicrographs of ethidium bromide-stained gels containing plasmid DNA (3.9 kb of PCR II vector) and PCR products (~170 bp) generated by using degenerate primers, which extracted from transformed cell and digested by using the restriction enzyme EcoRI.
~3.9 kb
~170 bp
Table 3. Analysis of cadherin cDNA clones generated from