水稻細菌性基腐病之研究

水稻細菌性基腐病為近來台灣地區發生之水稻新病害，可造成水稻莖基 部產生黑褐色腐爛病徵，已於台灣新竹縣、嘉義縣、苗栗縣、雲林縣及台南 市等地發現。本分所自嘉義疑似水稻罹病株經分離純化一種細菌分離株，經 水稻接種試驗可產生與田間相似之病徵，並完成柯霍氏法則，確認為此細菌 引起。此細菌經 Biolog 鑑定系統鑑定及多種基因 (16S rDNA、gyrB 及 dnaX) 之序列比對，確認為 Dickeya zeae。將此病原菌接種至不同作物，發現除了 水稻之外，亦對玉米、馬鈴薯、蘿蔔、白菜及洋蔥等作物具有致病性。該菌 於不同溫度下進行液態培養，結果發現此菌可於 10–40℃生長，30–35℃為最 適溫度。此外，選用 26 種不同的水稻品種進行對水稻細菌性基腐病菌之感 受性試驗，結果顯示所有品種皆可被感染，其中以「台稉 8 號」最為感病，

罹病率可達 94.44%。利用濾紙圓盤法測試 10 種市售藥劑對此病原菌之生長 抑制能力，結果以 20%歐索林酸可濕性粉劑之抑制效果最佳。而溫室藥效試 驗結果也顯示，以 20% 歐索林酸可濕性粉劑 1,000× 稀釋液，於接種前施用 可有效防治水稻細菌性基腐病，顯示歐索林酸可做為農政單位未來推薦防治 水稻基腐病藥劑之參考。

三、病毒病害研究 1. 甘藷病毒病害研究

(1) 臺灣甘藷毒素病之研究-甘藷黃斑型毒素病

從葉部出現黃色斑點之甘藷品種臺農 63 號，分離得三類型之病毒：(1) SPV-N 可經機械傳播，能感染供試旋花科植物 8 種中之 Ipomoea nil 及 I.

setosa 2 種，藜科植物 4 種中之 Chenopodium amaranticolor , C. quinoa ， 及 C. murale 等 3 種 ， 茄 科 植 物 23 種 中 之 Nicotiana debneyi , N.

benthamiana , N. megalosiphon , N. rependa, N. tabacum , ‘Xanthi’ , N. tabacum

‘Havana’, N. tabacum ‘Judy’s Pride’ , N. tabacum ‘Hicks’ 及 N. tabacum

‘Samsun 15A’ 等 9 種。同接於健全臺農 63 號莖頂培養苗約四週後呈輕微 斑駁，此病毒不經 Ipomoea nil 及甘藷種子傳播，在 N. benthamiana 汁液 中，病毒稀釋終點濃度介於 10^-2 ~10^-3，不活化溫度介於 60~65℃，活體外 保存時間 (25 )℃ ，不超過 24 小時，尚未能經綠桃蚜傳播成功，用陰染法 電子顯微鏡檢查，病毒顆粒呈長絲狀。(2) SPV-A 可經機械傳播及綠桃蚜以 非永續性方式傳播，不經 I. nil 及甘藷種子傳播，可感染供試旋花科植物 8 種中之 Ipomoea nil, I. setosa, I. hederacea, I. obscura，及 I. ramouri 等 5 種，

藜科植物 4 種中之 Chenopodium amaranticolor , C. quinoa 及 C. murale 3 種，但不能感染茄科各供試植物。回接於健全臺農 63 號莖頂組織培養苗，

約 8-10 天產生黃色斑點並使葉脈黃化。在 I. nil 汁液中，病毒之稀釋終點 濃度介於 10^-3~ 10^-4 之間，不活化溫度介於 55-60 ℃ 之間，活體外保存時 間 (25 ) ℃ 不超過 24 小時，用陰染法電子顯微鏡檢查，病毒顆粒呈長絲狀 (3) SPV-B ；可經菸草粉蝨傳播，感染 I. nil 和 I. setosa 引起嚴重捲葉病徵，

同接於臺農 63 號實生苗，12 株中有一株呈捲葉，下表面葉脈突起等病徵，

尚未機械接種成功。 I. nil 及 I. setosa 病株以陰染法電子顯微鏡檢查，未發 現病毒顆粒。

(2) 甘藷無病毒苗之培育及病毒檢定

感染毒素病葉部出現黃色斑點病徵之甘藷品種臺農 63 號，經 38~42 ℃ 熱處理 30~90 天，切取莖頂 5 cm 長，扦插於培養土或熱處理 28 天以上，

切取莖頂 5 mm 長，培養於改良式 Murashige and Skoog 培養基，均不能去 除 病 毒 。 熱 處 理 28 天 以 上 ， 切 取 莖 頂 0.3-0.6 mm 培 養 於 含 BAP ( 6-benzylaminopurine ) 4-8 ppm 及 IAA ( Indole-3 -acetic acid ) l ~2 ppm 之 改良式 MS 培養基，溫度維持 25 士 1 ℃ ，光度 0~150 lux，經 30~50 天後 移置於不含生長素或含 Kinetin 2 ppm 之相同培養基，每日光照 16 小時，

光度 3300 lux 以上，照光時溫度在 28~32 ℃ 之間，未照光時溫度為 25 士 1℃ ，於 65~120 天可生長成一完全之小苗。以指示植物 Iponoea nil 採用 機械傳播及嫁接法檢定，66.7% (16/24) 呈無病毒反應。經檢定結果之無病 毒試管苗，切取長度約 0.6~0.8 cm 包括一個節之莖，將葉片切除，扦插於 改良式 MS 培養基，於 10~30 天內可生長成一完全之小苗。

(3) 毒素病對甘藷產量及品質之影響

熱處理配合莖頂組織培養所得到的無病毒甘藷台農 57 號，沖繩 100 號，

紅心尾及台農 63 號與田間複合感惑染甘藷病毒之病株，在田間或防蟲網室 內分別進行農藝性狀比較結果顯示：田間試驗，上述四品種自然感染病毒者，

塊根產量分別降低 24.5%、30.5%、31.8% 和 35.6%。網室試驗，台農 63 號 及沖繩 100 號感染病毒之植株塊根產量比健株分別降低 34.2%及 55.9%。乾 物率及曲折計示度均以病株為高。田間試驗結果，病株粗蛋白質含量雖顯著 提高，但網室試臉結果差異不顯著。病毒對莖葉產量之影響，在田間試驗為

不顯著，但網室內，病株較低，達顯著標準。

(4) 甘藷捲葉病病原的分離傳播及寄主範圍

經菸草粉蝨 (Beinisia tabaci Genn.) 之媒介，從病毒複合感染之甘藷葉 片中，分離出甘藷捲葉病病原。罹病甘藷沿葉緣或葉尖向上捲曲，下表面葉 脈有輕微突起現象。此病徵在甘藷生育初期及高溫季節較明顯，低溫或生育 中、後期則有病徵消失現象。菸草粉蝨獲毒吸食一天即可傳播本病。蟲體吸 食一天後，持續至第六天仍能傳播本病。每株接種蟲數達 20 隻以上時，其 發病率連 75-100％。本病不經蚜蟲和機械接種方式傳播，亦不經種子傳播。

寄主範圍限於旋花科植物，能感染 Ipomoea nil, I. setosa 及 I. quamoclit 等造 成嚴重的捲葉，縮葉及矮化病徵。罹病的甘藷葉片以超薄切片法行電子顯微 鏡檢查結果，在靭皮細胞之細胞質中觀察到寬約 18 nm，桿狀之顆粒集團，

顆粒之斷面具中心孔，可能為本病原之病毒顆粒。

(5) 甘藷潛伏病毒中台灣分離株鞘蛋白基因序列分析及於檢測上之應用

於嘉義地區，自呈現黃斑及葉脈斑駁的甘藷葉片可分離到似 potyvirus 的長絲狀病毒 (potyvirus-like isolate CY)。利用對應 Potyvirus 屬病毒基因體 核糖核酸 3'端之簡併式引子及寡合腺嘌呤引子，可由呈現局部斑之奎藜總量 核糖核酸 (total RNA) 以反轉錄聚合酣連鎖反應增幅出約 1.9 kb 核酸片段。

此核酸片段經選殖及核酸序列分析，全長含 1880 個核苷酸序列。由 5'端起 此序列對應的肢基酸共 561 個，分別為 268 個肢基酸於細胞核內含體 b (nuclear inclusion b, NIb)、及 293 個肢基酸之全長度鞘蛋白 (coat protein, CP) 基因。3'端非轉譯區 (3' non-coding region, 3'-NCR) 則由 197 個核酸組成。

兩者之間蛋白酶切位落於 VHHQ/A 之間，且由鞘蛋白 N 端起第 7-9 個肢基 酸位置其有被蚜蟲傳播能力之 DAG 序列，不同於 SPLV-TW 之 DTG。與登

錄於 GenBank 之 SPLV 分離株比對核酸序列，與親緣最近之 SPLV-TW 病毒 其 CP 及 3'-NCR 區域之核苷酸序列相同度分別有 96.5% 及 100%。鞘蛋白 基因演化關係分析此病毒和台灣及中國人陸分離株較為親近而與日本分離 株較為疏遠。根據解得 SPLV-CY 鞘蛋白基因序列，設計之專一性引子對 L166/L841，可由 SPLV-CY 感染之奎藜、煙草及甘藷等病株檢測出專一性 675 bP 核酸片段。

(6) 甘藷病毒 G (Sweet potato virus G) 之研究

似病毒病徵之甘藷在 2009–2010 年間於台灣之南投及花蓮甘藷田區陸 續發生。罹病甘藷沿葉緣或葉尖向下捲曲，表面葉脈有透化現象。本分所除 鑑定病原種類為 Sweet potato virus G 首次於台灣發生外，並根據解得之基因 序列，設計之專一性引子對 SPVGup/SPVGdw，可由受感染之奎藜、煙草及 甘藷等病株檢測出專一性之核酸片段。

(7) 利用嫁接接種方式分析甘藷對病毒的抗性

病毒病害對台灣的甘藷栽培產業是一大威脅，在田間多呈現病毒複合感 染的狀態，使得甘藷病徵更形嚴重外，且會造成甘藷減產。本研究選出 10 種甘藷栽培種 (Ipomoea batatas)，包括台農 57、64、66、67、68、69、70、

71、72 及 73 號等，以及 10 種組織培養保存之野生種甘藷 (Ipomoea trifida) (T1、T2、T3、T4、 T5、T6、IT7-1、IT8-1、PI-1 和 PI-2)，針對台灣常見 的 3 種馬鈴薯 Y 病毒屬 (Potyvirus) 的病毒，包括甘藷羽狀斑駁病毒 (Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)、甘藷潛伏病毒 (Sweet potato latent virus, SPLV) 及甘藷 G 病毒 (Sweet potato virus G, SPVG)，利用嫁接接種的方式分 析 甘 藷 對 病 毒 的 抗 性 ， 觀 察 病 徵 並 以 反 轉 錄 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 確認病毒之感染與否，以找

出可能存在的抗病品系。10 個台農栽培種甘藷在接種三種病毒 30-40 天後，

除了台農 68 外，其餘 9 個品種皆出現嵌紋、斑駁、葉部扭曲等病徵，且以 RT-PCR 檢測出這 9 個品種已受上述 1-3 種病毒之感染。而台農 68 甘藷雖病 徵不明顯，但檢測到 SPFMV 及 SPVG 之感染。10 種野生種甘藷在嫁接接 種 50-60 天仍未呈現明顯而典型的病毒感染病徵，經 RT-PCR 分析結果顯示 10 種野生種甘藷對三種病毒均呈陰性反應，顯示野生種甘藷中可能存在有 天然的抗病基因，可當做抗病毒病害育種之材料，並做為培育健康種苗之參 考。