第三章 實驗結果
第二節 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 存活
4. 活性氧化物(ROS)相關蛋白的表現
將人類前列腺癌細胞株DU-145加入10 μM苯乙基異硫氰酸酯作用不 同時間後（6, 12, 24, 48小時），以西方墨點法觀察蛋白相對表現量，
觀察細胞受到藥物的刺激後，是否會產生大量的ROS來誘導細胞走向 凋亡。由圖3-9-J所示，Catalase和SOD(Mn)的表現量隨著給藥時間的 增加而增加，表示細胞經過給藥確實會誘發大量的ROS產生，而進一 步誘導細胞走向凋亡。
(三) 利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞 株 DU-145 細胞增生相關調控蛋白的表現:
將人類前列腺癌細胞株DU-145 加入 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯作用不 同時間後（6, 12, 24, 48 小時），以西方墨點法觀察蛋白相對表現量，
觀察給藥後是否有抑制細胞增生的作用。由圖3-9-K 所示，PI3K、
NF-κB (p65)和 GRB2 的表現量隨著給藥時間的增加而下降，而 PKC (Protein kinase C)的表現量隨著給藥時間的增加而增加，這些結果顯 示細胞的增生作用確實有因為給藥而受到抑制。
第二十三節 利用共軛焦顯微鏡觀察苯乙基異硫氰酸酯對於人類前列
腺癌細胞株DU-145 凋亡相關蛋白的細胞分布情形
將人類前列腺癌細胞株DU-145 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯作用 24 小時後，加入Endo G 和 GADD153 的抗體辨識這兩種蛋白，再以特 定FITC 之螢光抗體辨識各蛋白抗體，最後在以 PI 染細胞核，在共軛 焦顯微鏡下觀察。由圖3-10-D, 3-10-E 所示，發現 Endo-G 和 GADD153 的表現量皆上升，且紅色和綠色螢光 merge 在一起產生橘色螢光，表 示蛋白有translocate 到細胞核內。
第二十四節 苯乙基異硫氰酸酯加入N-acetylcysteine 會抑制人類前列 腺癌細胞株DU-145 存活率的下降
利用N-乙醯基半胱胺酸(N-acetylcysteine；NAC)作用於細胞 2 小時 後，再加入苯乙基異硫氰酸酯，觀察其細胞內活性氧化物（Reactive oxygen species；ROS）的上升被抑制後，其細胞的存活率是否會上升。
人類前列腺癌細胞株DU-145 加入 N-acetylcysteine (NAC) 1 mM 作用 2 小時之後，再加入 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯共同作用 24, 48 小時，
由圖3-11-C 所示，藥物作用 24 小時後，有事先加入 NAC 的細胞存 活率比沒加入NAC 的細胞存活率還高，而圖 3-11-D 所示，藥物作用 48 小時後，有事先加入 NAC 的細胞存活率明顯比沒加入 NAC 的細 胞存活率還高，且存活率的差距更為明顯，結果顯示加入ROS 的抑
制劑，降低了細胞因為藥物所產生的ROS，而提升了細胞的存活率，
表示ROS 確實是影響細胞存活的關鍵。
第二十五節 苯乙基異硫氰酸酯加入caspase 抑制劑會抑制人類前列 腺癌細胞株DU-145 存活率的下降
利用caspase 抑制劑作用於細胞 2 小時後，再加入苯乙基異硫氰酸酯，
觀察其細胞內caspase 活性的上升被抑制後，其細胞的存活率是否會 上升。人類前列腺癌細胞株DU-145 加入 caspase 抑制劑 20 μM 作用 2 小時之後，再加入 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯共同作用 24, 48 小時，
由圖3-13-C 所示，藥物作用 24 小時後，有事先加入 caspase-3 抑制 劑的細胞存活率比沒加入caspase-3 抑制劑的細胞還高，由圖 3-13-D 所示，藥物作用24 小時後，有事先加入 caspase-8 抑制劑的細胞存活 率比沒加入caspase-8 抑制劑的細胞還高，由圖 3-13-E 所示，藥物作 用24 小時後，有事先加入 caspase-9 抑制劑的細胞存活率比沒加入 caspase-9 抑制劑的細胞還高，結果顯示加入 caspase 的抑制劑，降低 了細胞因為藥物所活化的caspase，而提升了細胞的存活率，表示 caspase 的活化確實是影響細胞存活的關鍵。
0 μM 2.5 μM
7.5 μM 10 μM 15 μM
0 μM 2.5 μM 5 μM
7.5 μM 10 μM 15 μM
5 μM
圖3-1-A 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株DU-145細胞形態 上的影響。用不同濃度（2.5 ~15 μM）的苯甲基異硫氰酸酯 處理人類前列腺癌細胞株DU-145細胞48小時後之形態變化
（200 X）。
0 μM 1 μM 5 μM
10 μM 15 μM 20 μM
0 μM 1 μM 5 μM
10 μM 15 μM 20 μM
圖3-1-B 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株DU-145細胞形態 上的影響。用不同濃度（1 ~20 μM）的苯乙基異硫氰酸酯處 理人類前列腺癌細胞株DU-145細胞48小時後之形態變化
（200 X）。
Concentration of BITC (μM)
0 1 5 10 15 20
100 24 hour
48 hour
Concentration of PEITC (μM)
*
圖3-3-A 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞週 期的影響。不同濃度的苯甲基異硫氰酸酯（0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 μΜ）對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 24 小時後，
以流式細胞儀分析對細胞週期的影響（n = 3），觀察細胞 週期間各期細胞比例變化。圖中顯示隨著藥物濃度越高，
G0 / G1期減少，G2 / M 期增加，S 期的比例也是減少，
Apoptosis 的細胞比例則逐漸增高。
c 2.5 5 7.5 10 15
0 10 20 30 40 50 60
G0 / G1 G2 / M S Apoptosis
G2/M phase arrest
Concentration of BITC（μM）
Time (hour)
Percentage (%) of cell
Time (hour)
Percentage (%) of cell
圖3-3-B 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞週
Apoptosis 的細胞比例則逐漸增高。
圖3-3-C 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞週 期的影響。不同濃度的苯乙基異硫氰酸酯（0, 1, 5, 10, 15, 20 μΜ）對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 24 小時後，
以流式細胞儀分析對細胞週期的影響（n = 3），觀察細胞 週期間各期細胞比例變化。圖中顯示隨著藥物濃度越高，
G0 / G1期無明顯變化，G2 / M 期增加，S 期逐漸減少，
Apoptosis 的細胞比例則逐漸增高。
C 1 5 10 15 20
0 10 20 30 40 50 60 70
G0 / G1 G2 / M S
Apoptosis
Concentration of PEITC (μM)
G2/M phase arrest
Time (hour)
Percentage (%) of cell
Time (hour)
Percentage (%) of cell
圖3-3-D 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞週
Apoptosis 的細胞比例則逐漸增高。
12 H
Percentage (%) of MMP
0
與控制組比較p < 0.01；c 組為控制組）。
Percentage (%) of MMP
0
分析細胞粒線體膜電位的改變，此為粒線體膜電位相對量 之統計圖（n = 3；＊表示與控制組比較 p < 0.05；＊＊表示 與控制組比較p < 0.01；c 組為控制組）。
12 H 24 H
48 H 72 H Control 12 H
24 H 48 H
72 H Control
圖3-5-A 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株
DU-145 作用不同時間（0, 12, 24, 48, 72 小時）後，以流 式細胞儀分析細胞內 ROS 的產生，此為電腦分析結果的 重疊圖。
Time (hour)
C 12 24 48 72
Percentage(%) of ROS product
0
Percentage(%) of ROS product
0
Control 6 H
12 H 24 H
48 H Control
圖3-5-C 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株
DU-145 作用不同時間（0, 6, 12, 24, 48 小時）後，以流 式細胞儀分析細胞內 ROS 的產生，此為電腦分析結果的 重疊圖。
Time (hr)
c 6 12 24 48
Percentage of ROS produce
0
Percentage of ROS produce
0
0.5 H
Percentage of Ca2+ release
0
Percentage of Ca2+ release
0
細胞儀分析細胞內鈣離子的產生，此為鈣離子相對表現
Percentage of calcium release (%)
0
Percentage of calcium release (%)
0
圖3-6-D 以 10 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間（0, 0.5, 1, 3, 6 小時）後，以流式 細胞儀分析細胞內鈣離子的產生，此為鈣離子相對表現 量之統計圖（n = 3；＊表示與控制組比較 p < 0.05；＊＊
表示與控制組比較 p < 0.01；c 組為控制組）。
Control
12 H 24 H
48 H
72 H
Caspase 3
圖3-7-A 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株
DU-145 作用不同時間（0, 12, 24, 48, 72 小時）後，以流 式細胞儀分析細胞內 caspase-3 的活性，此為電腦分析結 果的重疊圖。
Time (hour)
c 12 24 48 72
caspase 3 activity (%)
0
caspase 3 activity (%)
0 式細胞儀分析細胞內 caspase-3 的活性，此為 caspase-3 的活性相對表現量之統計圖（n = 3；＊表示與控制組比
圖3-7-C 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株
Caspase-3 activity (%)
0
Caspase-3 activity (%)
0 胞儀分析細胞內caspase-3 的活性，此為 caspase-3 的活性 相對表現量之統計圖（n = 3；＊表示與控制組比較 p <
0.05；＊＊表示與控制組比較 p < 0.01；c 組為控制組）。
Control
Caspase-9 activity (%)
0
Caspase-9 activity (%)
0
DU-145 作用不同時間（0, 12, 24, 48 小時）後，以流式細 胞儀分析細胞內caspase-9 的活性，此為 caspase-9 的活性 相對表現量之統計圖（n = 3；＊表示與控制組比較 p <
Caspase-8 activity (%)
0
Caspase-8 activity (%)
0 20 40 60
80 *
圖3-7-H 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間（0, 12, 24, 48 小時）後，以流式細 胞儀分析細胞內caspase-8 的活性，此為 caspase-8 的活性 相對表現量之統計圖（n = 3；＊表示與控制組比較 p <
0.05；＊＊表示與控制組比較 p < 0.01；c 組為控制組）。
Control
12 H 48 H 24 H
Caspase 9
Control
12 H 48 H 24 H
Caspase 9
圖3-7-I 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株
DU-145 作用不同時間（0, 12, 24, 48 小時）後，以流式細 胞儀分析細胞內caspase-9 的活性，此為電腦分析結果的 重疊圖。
Time (hours)
C 12 24 48
Caspase-9 activity (%)
0
Caspase-9 activity (%)
0 胞儀分析細胞內caspase-9 的活性，此為 caspase-9 的活性 相對表現量之統計圖（n = 3；＊表示與控制組比較 p <
圖3-8-A 苯甲基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞 DNA 損傷的情形。不同濃度的苯甲基異硫氰酸酯（0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 μΜ）對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 後，利用DNA 電泳來觀察 DNA 斷裂受損的情形。
M 0 12 24 48 72 （hours）
M 0 12 24 48 72 （hours）
1000 bp 500 bp
圖3-8-B 苯甲基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞 DNA 損傷的情形。以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前 列腺癌細胞株DU-145 作用不同時間（0, 12, 24, 48, 72 小 時）後，利用DNA 電泳來觀察 DNA 斷裂受損的情形。
M 0 1 5 10 15 20 （μM）
M 0 1 5 10 15 20 （μM）
1000 bp
500 bp
圖3-8-C 苯乙基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞 DNA 損傷的情形。不同濃度的苯乙基異硫氰酸酯（0, 1, 5, 10, 15, 20 μΜ）對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用後，
利用DNA 電泳來觀察 DNA 斷裂受損的情形。
M 0 12 24 48 72（hours）
1000 bp
500 bp
圖3-8-D 苯乙基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞 DNA 損傷的情形。以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前
列腺癌細胞株DU-145 作用不同時間（0, 12, 24, 48, 72 小 時）後，利用DNA 電泳來觀察 DNA 斷裂受損的情形。
0 μM 2.5 μM 5 μM
15 μM 10 μM
7.5 μM
圖 3-8-E 苯甲基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞 DNA 損傷的情形。不同濃度的苯甲基異硫氰酸酯（0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 μΜ）對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 48 小時後，利用DAPI 染色來觀察 DNA 斷裂受損的情形。
0 μM 1 μM 5 μM
15 μM
10 μM 20 μM
圖 3-8-F 苯乙基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞 DNA 損傷的情形。不同濃度的苯乙基異硫氰酸酯（0, 1, 5, 10, 15, 20 μΜ）對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 48
小時後，利用DAPI 染色來觀察 DNA 斷裂受損的情形。
Control 2.5 μM
15 μM 小時後，利用彗星試驗(Comet assay)來觀察 DNA 斷裂受 損的情形。
Concentration of BITC (μM)
C 2.5 5 7.5 10 15
Comet Length (px)
0
Concentration of BITC (μM)
C 2.5 5 7.5 10 15
Comet Length (px)
0
7.5, 10, 15 μΜ）對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 24 小 時後，利用彗星試驗(Comet assay)來觀察 DNA 斷裂受損的 情形，此為利用CometScore 量化後的統計圖（n = 3；＊表 示與控制組比較p < 0.05；＊＊表示與控制組比較 p <
0.01；c 組為控制組）。
Control 2.5 μM
15 μM 1 μΜ 5 μM
10 μM
5 μM
20 μM 15 μM
圖3-8-I 苯乙基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞 DNA 損傷的情形。不同濃度的苯乙基異硫氰酸酯（0, 1, 5, 10, 15, 20 μΜ）對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 24 小 時後，利用彗星試驗(Comet assay)來觀察 DNA 斷裂受損的 情形。
Concentration of PEITC (μM)
C 1 5 10 15 20
Comet Length (px)
0
Concentration of PEITC (μM)
C 1 5 10 15 20
Comet Length (px)
0 時後，利用彗星試驗(Comet assay)來觀察 DNA 斷裂受損的 情形，此為利用CometScore 量化後的統計圖（n = 3；＊表 示與控制組比較p < 0.05；＊＊表示與控制組比較 p <
0.01；c 組為控制組）。
圖3-9-A 利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株DU-145 調控細胞週期蛋白的表現。將人類前列腺癌 細胞株DU-145 加入 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯作用不同時 間後（6, 12, 24, 48 小時），以西方墨點法觀察蛋白相對
圖3-9-A 利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株DU-145 調控細胞週期蛋白的表現。將人類前列腺癌 細胞株DU-145 加入 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯作用不同時 間後（6, 12, 24, 48 小時），以西方墨點法觀察蛋白相對