苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯會誘導人類前列腺癌細胞株(DU-145)細胞週期停滯和造成細胞凋亡; Benzyl Isothiocyanate and Phenethyl Isothiocyanate Induce Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Human Prostate Cancer DU-145 Cells
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(2) 誌 謝 首先要感謝我的父母，因為他們的支持，我才能無憂無慮的專心唸 碩士班。接著，要感謝的人就是我的指導教授鍾景光教授，因為鍾老 師出錢出力我才能順利完成我的研究，以及感謝鍾老師的教導，才能 讓我對於抗癌藥物的研究有一點點的成績。 能夠完成這篇論文要感謝的人實在太多了，一路上幫助我的人也太 多了，當然還要感謝來幫我口試的委員們，包括我的指導教授鍾景光 教授、醫技系系主任林振文教授以及台灣大學食品科技研究所沈立言 教授，因為他們的耐心指導，讓我的論文能夠修改的更完整。 最後，我要感謝實驗室的學長姐、同學以及學弟妹們，感謝你們在 實驗上的幫助，我才能順利完成我的研究，以及許多已經畢業的學長 姐，因為有你們的幫忙，我才能突破寫論文的困境。這篇論文真的有 太多人的幫忙才能完成，我衷心的感謝那些幫助我的人，謝謝你們， 讓我的碩士學業交了一張漂亮的成績單！. 民國九十八年六月 黃雅婷 於中國醫藥大學醫技所 謹致.
(3) 總目錄 總目錄…………………………………………………………………….I 圖目錄…………………………………………………………..………IX 表目錄………………………………………………………...……….XX 中文摘要……………………………………………………………...XXI 英文摘要…………………………………………………………..…XXII 第一章 前言…………………………………………………….….……1 第一節 研究背景…………………………………………………...2 一､苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯的介紹…….…..…..2 (一) 苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯的來源……….…….2 (二) 苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯的相關文獻探討…..3 二､前列腺癌的介紹……………………………………………….4 (一) 前列腺癌的成因………………………………………………..4 (二) 前列腺癌目前的臨床治療………………..……………………5 三､細胞週期的調控……………………………………………….6 (一) 細胞週期的介紹………………………………………………..6 (二) 細胞週期的相關調控分子……………………………………..9 (a) 細胞週期素(Cyclins) …………………………………….…..9 (b) 細胞週期素依賴性激酶(cyclin dependent kinases；CDKs)..11. I.
(4) (c) CDK 抑制蛋白(CDK inhibitors；CDKIs)…………………..11 四､細胞凋亡………………………………………………………13 (一)細胞凋亡的定義………………………………………..…..….13 (二)細胞凋亡的調控機轉………………………………………….13 (1) 外在路徑，又稱為死亡接受體路徑（Death receptor pathway） (a) TNFR1（Tumour Necrosis Factor Receptor-1）……………14 (b) TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）………….14 (c) Fas/FasL (CD95/CD95L)……………………………….....14 (2) 內在路徑，又稱為粒線體路徑（Mitochondrial pathway）....15 (a) Bcl-2 family...........................................................................15 (b) 細胞凋亡誘導因子（Apoptosis inducing factor；AIF）......16 (c) 內核酸酶 (Endonuclease G; Endo G)………………...…..17 (d) Caspase enzyme family…………………………....………17 (3) 內質網壓力(Endoplasmic Reticulum Stress; ER Stress).........19 (4) 活性氧化物質 (Reactive oxygen species; ROS)………...….21 第二節 研究目的…………………………………………….……22 第二章 研究方法………........................................................................23 第一節 研究設計………………………………………………….23 第二節 研究材料……………………………………………….…24 一､細胞株………………………………………………………….24. II.
(5) 二､實驗藥物……………………………………………………….24 三､藥品試劑……………………………………………………….24 四､儀器設備……………………………………………………….28 第三節 實驗方法……………………………………………….…30 一､實驗藥品配置…………………………………………………30 二､細胞培養…………………………………………………...…..30 (一) 配置細胞培養基………………………………………………30 (二) 細胞株培養條件………………………………………..……..30 (三) 活化冷凍細胞…………………………………………………31 (四) 細胞計數…………………………………………………...….32 (五) 冷凍細胞株………………………………………………..…..33 三､流式細胞儀的應用………………………………………..….33 (一) 細胞存活率的分析……………………………………………34 (二) 細胞週期的分析………………………………………………36 (三) 細胞內粒線體膜電位的分析…………………………...…….38 (四) 細胞內活性氧化物質的分析………………………….……...40 (五) 細胞內鈣離子濃度的分析………………………………...….42 (六) 細胞內 Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 活性的分析…….....44 四､DNA 損傷的檢測……………………………………………..46. III.
(6) (一)DAPI (4-6-diamidine-2-phenyl indole)染色法………………..46 (二)彗星試驗 (Comet assay)…………………………….…….…..47 (三) DNA 斷裂電泳分析………………………………………..…50 五､西方點墨法…………………………………………………….51 (一)細胞蛋白的抽取技術………………………………………….51 (二)細胞蛋白濃度的定量………………………………………….52 (三)SDS-PAGE 電泳分析…………………………………...……..53 六､間接免疫螢光染色法(Indirect immunofluorescence)…….….58 七､共軛焦顯微鏡觀察…………………………………………….60 八､細胞轉移偵測試驗…………………………………………….61 九､活性氧化物抑制劑對於細胞存活率的影響……………...…..61 十､Caspase 抑制劑對於細胞存活率的影響……………….…….63 十一､統計方法……………………………………………...……..64 第三章 實驗結果………………………………………………...…….64 第一節 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞 型態的影響………………………………...……………64 第二節 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 存活 率的影響……………………………………….……..…65 第三節 苯甲基異硫氰酸酯對於人類前列腺癌細胞株 DU-145 細. IV.
(7) 胞週期的影響……………………………………...……66 第四節 苯甲基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 粒 線體膜電位的改變………………………………...……66 第五節 苯甲基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 產 生活性氧化物(Reactive Oxygen Species)………………67 第六節 苯甲基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 鈣 離子的釋放……………………………………………...67 第七節 苯甲基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 Caspase-3, Caspase-9 活性的上升…………………...…68 第八節 苯甲基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 DNA 的損傷………………………………………..……68 第九節 苯甲基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 凋 亡相關蛋白的表現…………………………..……………70 (一)利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺 癌細胞株 DU-145 調控細胞週期蛋白的表現………70 (二)利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列 腺癌細胞株 DU-145 細胞凋亡路徑蛋白的表現……71 1. 粒線體路徑相關蛋白的表現………………………...71 2. 內質網壓力（ER stress）調控細胞凋亡路徑相關蛋白的. V.
(8) 表現……………………………………………………72 3. 活性氧化物(ROS)相關蛋白的表現………….…….…72 (三) 利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列 腺癌細胞株 DU-145 細胞轉移相關調控蛋白的表 現……………………………………………………..73 第十節 利用共軛焦顯微鏡觀察苯甲基異硫氰酸酯對於人類前列 腺癌細胞株 DU-145 凋亡相關蛋白的細胞分布情形….73 第十一節 苯甲基異硫氰酸酯對於人類前列腺癌細胞株 DU-145 轉移的影響………………………………………...……74 第十二節 苯甲基異硫氰酸酯加入 N-acetylcysteine 會抑制人類前 列腺癌細胞株 DU-145 存活率的下降………………….74 第十三節 苯甲基異硫氰酸酯加入 caspase 抑制劑會抑制人類前 列腺癌細胞株 DU-145 存活率的下降……………….…75 第十四節 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細 胞型態的影響……………………………………...……75 第十五節 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 存 活率的影響…………………………………...…………76 第十六節 苯乙基異硫氰酸酯對於人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞週期的影響…………………………………..….…77. VI.
(9) 第十七節 苯乙基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 粒線體膜電位的改變……………………………..….…78 第十八節 苯乙基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 產生活性氧化物(Reactive Oxygen Species)……………78 第十九節 苯乙基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 鈣離子的釋放………………………………………...…78 第二十節 苯乙基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 Caspase-3, Caspase-8 活性的上升………………………79 第二十一節 苯乙基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 DNA 的損傷……………………………………79 第二十二節 苯乙基異硫氰酸酯影響人類前列腺癌細胞株 DU-145 凋亡相關蛋白的表現……………………….…81 (一)利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前列 腺癌細胞株 DU-145 調控細胞週期蛋白的表現…81 (二)利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前 列腺癌細胞株 DU-145 細胞凋亡路徑蛋白的表現 82 1. 粒線體路徑相關蛋白的表現……………...…………82 2. 死亡接受器路徑相關蛋白的表現量……………...…83 3. 內質網壓力（ER stress）調控細胞凋亡路徑相關蛋白. VII.
(10) 的表現…………………………...…………..………83 4. 活性氧化物(ROS)相關蛋白的表現…………………84 (三)利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前 列腺癌細胞株 DU-145 細胞增生相關調控蛋白的表 現……………………………………..…………….84 第二十三節 利用共軛焦顯微鏡觀察苯乙基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 凋亡相關蛋白的細胞分布情 形…………………………………………...……………84 第二十四節 苯乙基異硫氰酸酯加入 N-acetylcysteine 會抑制人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的下降………………85 第二十五節 苯乙基異硫氰酸酯加入 caspase 抑制劑會抑制人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的下降………………86 第四章 討論………………………………………..…………………134 第五章 結論……………………………………………………..……138 第六章 參考文獻……………………………………………….…….142. VIII.
(11) 圖目錄. 圖 1-1 前列腺的生理位置…………………………………………...….4 圖 1-2 細胞凋亡的內在路徑與外在路徑圖…………………….…….19 圖 1-3 內質網壓力與細胞凋亡路徑圖………………………………..20 圖 1-4 ROS 造成細胞凋亡的相關路徑………………………………21 圖 2-1 流式細胞儀 PI 染色之細胞存活率分析圖..................................34 圖 2-2 流式細胞儀 PI 染色之細胞週期分析圖…………………….…37 圖 2-3 粒線體膜電位軟體分析圖…………………………….……….40 圖 2-4 ROS 軟體分析圖………………………………………..…….....42 圖 2-5 鈣離子濃度軟體分析圖…………………………….………….44 圖 2-6 Caspase-3, 8, 9 活性軟體分析圖………………………….…….46 圖 2-7 轉漬夾的內部組成……………………………………………..57 圖 2-8 無菌膠帶黏貼載玻片於培養皿中的示意圖…………………..58 圖 2-9 覆蓋 parafilm 於載玻片上細胞區域示意圖…………….……..59 圖 2-10 脫除載玻片上覆蓋的 parafilm 示意圖………………………..60 圖 3-1-A 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞形態 的影響………………………………………………...………87 圖 3-1-B 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞形態 的影響…………………………………………………...……87 IX.
(12) 圖 3-2-A 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞存活 率的影響……………………………………………….……..88 圖 3-2-B 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞存活 率的影響……………………………………………….……..89 圖 3-3-A 不同濃度的苯甲基異硫氰酸酯對於人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞週期的影響………………………….…………90 圖 3-3-B 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同 時間後對於細胞週期的影響………………………….……..91 圖 3-3-C 不同濃度的苯乙基異硫氰酸酯對於人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞週期的影響…………………………….………92 圖 3-3-D 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同 時間後對於細胞週期的影響…………………………..…….93 圖 3-4-A 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞粒線體膜電位的改變，此為電腦 分析結果的重疊圖…………………………………….……..94 圖 3-4-B 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞粒線體膜電位的改變，此為粒線 體膜電位相對量之統計圖………………………..…….……94 圖 3-4-C 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145. X.
(13) 作用不同時間後，分析細胞粒線體膜電位的改變，此為電腦 分析結果的重疊圖……………………………………..…….95 圖 3-4-D 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞粒線體膜電位的改變，此為粒線 體膜電位相對量之統計圖…………………………….……..95 圖 3-5-A 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 ROS 的產生，此為電腦分析 結果的重疊圖………………………………………..……….96 圖 3-5-B 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 ROS 的產生，此為 ROS 相對 表現量之統計圖…………………………………….………..97 圖 3-5-C 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，儀分析細胞內 ROS 的產生，此為電腦分 析結果的重疊圖………………………………...……………97 圖 3-5-D 以 10 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 ROS 的產生，此為 ROS 相對 表現量之統計圖……………………………………….….….98 圖 3-6-A 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內鈣離子的產生，此為電腦分析. XI.
(14) 結果的重疊圖…………………………………….……….….99 圖 3-6-B 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內鈣離子的產生，此為鈣離子相 對表現量之統計圖…………………………………………...99 圖 3-6-C 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內鈣離子的產生，此為電腦分析 結果的重疊圖……………………………………...…..……100 圖 3-6-D 以 10 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內鈣離子的產生，此為鈣離子相 對表現量之統計圖………………………………………….100 圖 3-7-A 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-3 的活性，此為電腦 分析結果的重疊圖………………………………………….101 圖 3-7-B 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-3 的活性，此為 caspase-3 的活性相對表現量之統計圖…………………….102 圖 3-7-C 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-3 的活性，此為電腦 分析結果的重疊圖………………………………………….102. XII.
(15) 圖 3-7-D 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-3 的活性，此為 caspase-3 的活性相對表現量之統計圖…………………….103 圖 3-7-E 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-9 的活性，此為電腦 分析結果的重疊圖……………………………………….…104 圖 3-7-F 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-9 的活性，此為 caspase-9 的活性相對表現量之統計圖……………….……104 圖 3-7-G 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-8 的活性，此為電腦 分析結果的重疊圖……………………………………...….105 圖 3-7-H 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-8 的活性，此為 caspase-8 的活性相對表現量之統計圖…………………….105 圖 3-7-I 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-9 的活性，此為電腦 分析結果的重疊圖………………………………………….106 圖 3-7-J 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145. XIII.
(16) 作用不同時間後，分析細胞內 caspase-9 的活性，此為 caspase-9 的活性相對表現量之統計圖………………….…107 圖 3-8-A 不同濃度的苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用後，利用 DNA 電泳來觀察 DNA 斷裂受損的情 形………………………………………………………….…107 圖 3-8-B 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，利用 DNA 電泳來觀察 DNA 斷裂受損的 情形…………………………………………………….……108 圖 3-8-C 不同濃度的苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用後，利用 DNA 電泳來觀察 DNA 斷裂受損的情 形………………………………………………………...…..109 圖 3-8-D 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用不同時間後，利用 DNA 電泳來觀察 DNA 斷裂受損的 情形……………………………………………………...…..109 圖 3-8-E 不 同 濃 度 的 苯 甲 基 異 硫 氰 酸 酯 對 人 類 前 列 腺 癌 細 胞 株 DU-145 作用 48 小時後，利用 DAPI 染色來觀察 DNA 斷裂 受損的情形………………………………………….…..…..110 圖 3-8-F 不 同 濃 度 的 苯 乙 基 異 硫 氰 酸 酯 對 人 類 前 列 腺 癌 細 胞 株 DU-145 作用 48 小時後，利用 DAPI 染色來觀察 DNA 斷裂. XIV.
(17) 受損的情形………………………………………………….110 圖 3-8-G 不同濃度的苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 24 小時後，利用彗星試驗(Comet assay)來觀察 DNA 斷裂受損的情形………………………………..…….111 圖 3-8-H 不同濃度的苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 24 小時後，利用彗星試驗(Comet assay)來觀察 DNA 斷裂受損的情形，此為利用 CometScore 量化後的統計 圖………………………………………………...…………..111 圖 3-8-I 不同濃度的苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 24 小時後，利用彗星試驗(Comet assay)來觀察 DNA 斷裂受損的情形…………………………………...….112 圖 3-8-J 不同濃度的苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用 24 小時後，利用彗星試驗(Comet assay)來觀察 DNA 斷裂受損的情形，此為利用 CometScore 量化後的統計 圖…………………………………………………………….113 圖 3-9-A 利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 調控細胞週期蛋白的表現…………………..114 圖 3-9-B 利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 粒線體路徑相關蛋白的表現………………...115. XV.
(18) 圖 3-9-C 利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 內質網壓力路徑相關蛋白的表現…………..116 圖 3-9-D 利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 活性氧化物相關蛋白的表現…………..……117 圖 3-9-E 利用西方墨點法探討苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 細胞轉移相關蛋白的表現…………………...118 圖 3-9-F 利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 調控細胞週期蛋白的表現…………………...119 圖 3-9-G 利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 粒線體路徑相關蛋白的表現………………..120 圖 3-9-H 利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 死亡接受器路徑相關蛋白的表現…………..121 圖 3-9-I 利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞 株 DU-145 內質網壓力路徑相關蛋白的表現…………..…122 圖 3-9-J 利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 活性氧化物相關蛋白的表現………………..122 圖 3-9-K 利用西方墨點法探討苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細 胞株 DU-145 細胞增生相關蛋白的表現…………………..123 圖 3-10-A 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145. XVI.
(19) 作用後，以共軛焦顯微鏡觀察 AIF 在 DU-145 細胞中的分佈 及表現量…………………………………………………….124 圖 3-10-B 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用後，以共軛焦顯微鏡觀察 Endo G 在 DU-145 細胞中的 分佈及表現量。……………………………………………...124 圖 3-10-C 以 5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用後，以共軛焦顯微鏡觀察 GADD153 在 DU-145 細胞中 的分佈及表現量…………………………………………. ...125 圖 3-10-D 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用後，以共軛焦顯微鏡觀察 Endo G 在 DU-145 細 胞中的分佈及表現量……………………………………….126 圖 3-10-E 以 10 μM 苯乙基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞株 DU-145 作用後，以共軛焦顯微鏡觀察 GADD153 在 DU-145 細胞中的分佈及表現量………………………………….....126 圖 3-11-A 以 2.5 μM、5 μM 苯甲基異硫氰酸酯對人類前列腺癌細胞 株 DU-145 作用 24 小時和 48 小時後，藥物對細胞轉移抑制 的情形……………………………………………………….127 圖 3-12-A 加入 N-acetylcysteine 能夠抑制苯甲基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的影響，藥物作用 24 小時後. XVII.
(20) 測其存活率………………………………………………….128 圖 3-12-B 加入 N-acetylcysteine 能夠抑制苯甲基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的影響，藥物作用 48 小時後 測其存活率…………………………………………….……128 圖 3-12-C 加入 N-acetylcysteine 能夠抑制苯乙基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的影響，藥物作用 24 小時後 測其存活率………………………………………………….129 圖 3-12-D 加入 N-acetylcysteine 能夠抑制苯乙基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的影響，藥物作用 48 小時後 測其存活率………………………………………………….129 圖 3-13-A 加入 caspase-3 抑制劑能夠抑制苯甲基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的影響，藥物作用 24 小時後 測其存活率……………………………………………….…130 圖 3-13-B 加入 caspase-9 抑制劑能夠抑制苯甲基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的影響，藥物作用 48 小時後 測其存活率……………………………………………….…130 圖 3-13-C 加入 caspase-3 抑制劑能夠抑制苯甲基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的影響，藥物作用 24 小時後 測其存活率 ……………………………………………..….131. XVIII.
(21) 圖 3-13-D 加入 caspase-8 抑制劑能夠抑制苯甲基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的影響，藥物作用 24 小時後 測其存活率 …………………………………..…………….132 圖 3-13-E 加入 caspase-9 抑制劑能夠抑制苯甲基異硫氰酸酯對於人類 前列腺癌細胞株 DU-145 存活率的影響，藥物作用 24 小時後 測其存活率 ……………………………………………..….132 圖 5-1 苯甲基異硫氰酸酯誘導人類前列腺癌細胞株 DU-145 走向細胞 凋亡的機轉…………………………………………………...140 圖 5-2 苯乙基異硫氰酸酯誘導人類前列腺癌細胞株 DU-145 走向細胞 凋亡的機轉…………………………………………………...140. XIX.
(22) 表目錄. 表 1-1 民國 96 年國人十大癌症死亡原因……………………….….…2 表 2-1 彗星試驗之 Lysis buffer 的配置…………………………….... 49 表 2-2 彗星試驗之 Alkaline buffer 的配置……………………………49 表 2-3 彗星試驗之 Tris buffer 的配置…………………………….…..49 表 2-4 蛋白質標準品的配置…………………………………………..52 表 2-5 下層膠的配置組成. 53. 表 2-6 上層膠的配置組成. 54. 表 2-7 Running buffer (1.5 M Tris-HCl) 的配置組成…………………54 表 2-8 Stacking buffer（0.5 M Tris-HCl）的配置組成…………………54 表 2-9 Transfer buffer 的組成……………………………………..........57 表 2-10 0.1% PBS-Tween20 的組成………………………….………...57. XX.
(23) 中文摘要 苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯是來自於十字花科蔬菜的 衍生物，常見的十字花科蔬菜包含了花椰菜、甘藍菜、芥菜…等。已 有文獻指出苯甲基異硫氰酸酯會造成多種人類癌細胞株的凋亡，例 如：卵巢癌細胞、乳癌細胞和胰臟癌細胞。另外，也有文獻指出苯乙 基異硫氰酸酯會造成人類非小細胞肺癌和前列腺癌細胞(PC-3)的凋 亡。但是苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細 胞株 DU-145 的凋亡機轉則尚未有較詳細的報導，所以本研究即是探 討苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 的相關凋亡機轉。由結果顯示，苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基 異硫氰酸酯確實會造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 細胞週期停滯以 及誘導細胞凋亡的產生。除此之外，苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫 氰酸酯也會造成人類前列腺癌細胞株 DU-145 粒線體膜電位的改變， 活性氧化物質和鈣離子的釋放以及造成 DNA 的損傷。接著，由西方 點墨法的結果發現苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯會造成人 類前列腺癌細胞株 DU-145 凋亡蛋白的增加和 Caspase 活性的上升。 由此可知，苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯會造成人類前列腺 癌細胞株 DU-145 走向凋亡的命運，值得更進一步研究發展為抗癌藥 物。. XXI.
(24) Abstract Benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate, are derived isothiocyanates from cruciferous vegetable, including watercress, broccoli and cabbage. Benzyl isothiocyanate has been shown that to induce cell cycle arrest and apoptosis in many human cancer cell lines, such as ovarian cancer cells, breast cancer MDA-MB-231 and MCF-7 cells and pancreatic cancer Capan-2 cells. Phenethyl isothiocyanate also has been shown that to induce cell cycle arrest and apoptosis in many human cancer cell lines, such as human non-small lung cancer cells, prostate cancer PC-3 cells (Prostate cancer metastasized to bone). In this study, we investigate the effect of benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate on human prostate cancer DU-145 cells, the results demonstrate that benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate induced cause G2 / M phase arrest and apoptosis. These effects are in a dose- and time-dependent manners. Besides, benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate also decreased the levels of mitochondria membrane potential, induced reactive oxygen species and calcium ion production in examined DU-145 cells. Benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate induced apoptosis of DU-145 cells which also were confirmed by DAPI staining and DNA gel electrophoresis. Western blotting show that benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate treatment gradually decreased the level of anti-apoptotic proteins, but increased the level of pro-apoptotic proteins. Besides, benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate increased caspase-3 activity. Therefore, benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate XXII.
(25) induce apoptosis in human prostate cancer DU-145 cells.. XXIII.
(26) 第一章 前言 根據台灣衛生署的統計，惡性腫瘤為 97 年國人十大死亡原因的第 (1). 一位 ，惡性腫瘤的死亡人數占率超過百分之二十八，已經連續蟬聯 二十五年的十大死因榜首，平均每十三分三十秒就有一人死於癌症， 所以惡性腫瘤為目前臨床醫療上相當重要的研究課題。 (1). 前列腺癌占 95 年台灣國人十大癌症死亡原因第七位 ，除了在台灣 具有相當的重要性以外，在美國 2007 年所統計的男性癌症十大死因 (2). 中 ，前列腺癌更是高居第二位，所以治療前列腺癌是全球醫療的重 要課題。 前列腺癌是出自前列腺的惡性腫瘤，前列腺是屬於男性生殖系統的 一個腺體，若其中有細胞的基因突變導致細胞增生失控，就可能會形 成癌症。但是目前臨床上對於前列癌的治療方法，都還未有能夠完全 治癒又不會產生副作用的治療方法，治療前列腺的方法往往會導致患 者產生副作用，所以目前臨床醫學上需要有更有效的前列腺癌治療方 法。. 1.
(27) 順位. 癌症死亡原因. 死亡率(％). 1. 肺癌(Trachea, bronchus, and lung cancer). 27.9. 2. 肝癌(Liver and intrahepatic bile ducts cancer). 28.1. 3. 結腸直腸癌(Colon and rectum cancer). 15.6. 4. 女性乳癌(Female breast cancer). 11.1. 5. 胃癌(Stomach cancer). 8.5. 6. 口腔癌(Oral cavity cancer). 8.3. 7. 攝護腺癌(Prostate cancer). 6.7. 8. 子宮頸癌(Cervix uteri cancer). 5.8. 9. 食道癌(Oesophagus cancer). 5.2. 10. 胰臟癌(Pancreas cancer). 4.8. 表 1-1 民國 96 年國人十大癌症死亡原因. (1). 第一節 研究背景 一､苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯的介紹 (一) 苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯的來源 苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯的主要結構是來自十字花科 蔬菜的衍生物，常見的十字花科蔬菜有甘藍菜、綠花椰菜、水田芥… 等. (3)(4). 。. 苯甲基異硫氰酸酯(benzyl isothiocyanate；BITC) 分子式：Ph-CH2-N=C=S 分子量：149.22 化學結構式. (87). ：. 2.
(28) 苯乙基異硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate；PEITC) 分子式：Ph-CH2-CH2-N=C=S 分子量：163.24 化學結構式. (88). ：. (二) 苯甲基異硫氰酸酯和苯乙基異硫氰酸酯的相關文獻探討 目前已有相關文獻證實苯甲基異硫氰酸酯能夠造成人類胰臟癌細 胞株的 DNA 損傷，並且使細胞週期停滯在 G2/M phase，而使細胞走 (5). 向凋亡 ，除此之外，苯甲基異硫氰酸酯也被證實對於人類乳癌細胞 (6). 株也會誘導其細胞凋亡 。而苯乙基異硫氰酸酯也有研究指出會造成 (7). 人類非小型細胞肺癌的凋亡 ，以及會誘導人類血癌細胞株. 3. (8). 、子宮.
(29) 頸癌細胞株. (9). 和乳癌細胞株. (10). 的凋亡。. 二､前列腺癌的介紹 (一)前列腺癌的成因 前列腺癌是出自前列腺的惡性腫瘤，前列腺又稱為攝護腺，是屬於 男性生殖系統的一個腺體，所以只有男性會罹患前列腺癌，最常發生 於 50 歲以上的人。惡性癌細胞除了體積擴大或侵犯鄰近器官，也可 能轉移到身體其他部位，尤其是骨頭和淋巴結。前列腺癌可能造成疼 痛、排尿困難、勃起功能不全等症狀。會導致前列腺癌的原因，目前 尚未清楚，但是研究指出可能跟年齡、飲食、遺傳、環境…等有相關 (11). 。. 圖 1-1 前列腺的生理位置. (89). 年齡：前列腺癌多發生在 65 歲以上的高齡男性，可見這是一種老年 4.
(30) 人的癌症，根據病理學家的研究，這種癌症和人類組織老化有關。 種族：一般來說，黃種人較不易罹患前列腺癌。據美國的統計，美國 的黑人是世界前列腺癌最好發的人種。 遺傳：有前列腺癌的家族史時，前列腺癌的發生危險度會明顯升高， 若有一等親患有前列腺癌，則發生前列腺癌的機會是一般人的 2~4 倍。有家族史的人罹患前列腺癌的年齡都較年輕，約在 45~60 歲之間。 荷爾蒙：人體雄性素的來源，百分之九十以上來自於睪丸，因此前列 腺癌與荷爾蒙是有密切關係的。 飲食：高脂肪和缺乏緑色蔬菜的攝取是前列腺癌的促進因子。由於西 方人的飲食習慣長久以來以高脂肪的漢堡速食為主，可能因此導致高 前列腺癌的罹患率. (12). 。. (二)前列腺癌目前的臨床治療 前列腺癌目前的臨床治療方法包括手術、放射治療、荷爾蒙治療， 有時也做化學治療，這幾種療法可以合併運用. (13). 。. 手術：前列腺切除術常用於早期前列腺癌，或放射治療效果不佳的患 者。前列腺根除術對於癌細胞侷限於前列腺內的患者相當有效，但是 手術過程中難免會傷到一些神經，而影響到患者的生活品質，最常見 的併發症是尿失禁和陽萎。. 5.
(31) 放射治療：是以集中的輻射線破壞前列腺內的癌細胞，使癌細胞無法 持續增長 。 荷爾蒙治療：是用內科或外科的方法，使攝護腺癌細胞無法獲得二氫 睪固酮(DHT)，DHT 是在前列腺中產生的一種荷爾蒙、使大部份前列 腺癌細胞能夠生長與擴散。阻止二氫睪固酮(DHT)，通常使得攝護腺 癌停止生長甚至萎縮。但是荷爾蒙療法很少治癒攝護腺癌，因為癌症 最初對荷爾蒙療法有反應，但在一到二年以後癌症對治療有抗性。 由於早期前列腺癌沒有任何症狀，所以不易被察覺，可說是中老年 男性的隱性殺手，因此發現罹癌的年齡大多較晚，以 65 至 75 歲之間 的比率較高，當前列腺癌造成患者排尿不適的症狀時，多已是晚期， 也不適合施以手術治療了。對於大多數癌症患者來說，手術切除癌症 病灶是治療早期癌症最直接有效的方法，一旦癌症侵犯周邊組織或是 淋巴腺等器官，則手術切除就有可能殘留癌細胞在切除部位而可能引 起復發，造成患者在手術後還必須做局部放射線治療或是藥物治療， 這不僅增加了患者的痛苦，同時也不易將癌細胞完全清除。. 三､細胞週期的調控 (一) 細胞週期的介紹. (14)(15). 從親代細胞進行細胞分裂，分裂形成兩個子代細胞的過程時間，稱. 6.
(32) 為：細胞週期。簡單來說就是分裂細胞從有絲分裂結束到下次有絲分 裂結束的過程。細胞週期主要可分為三個時期：細胞生長期、DNA 複 製期、細胞分裂期。細胞週期可分為Interphase（包含G1、S和G2 phase） (16)(17). 及Mitosis（M）phase. ，而在整個細胞週期的過程中，則會有三. 個checkpoints來決定細胞週期能否進入下一個時期。 G0 phase：為細胞靜止期，又稱為senescence或quiescence，經由某些 分子刺激，可進行分化或進入G1 phase。 G1 phase：G意指為Gap，G1 phase介於M phase和S phase的中間，細 胞會複製本身胞器與蛋白質，增加體積，準備進入S phase，此期間可 長達數小時至數天之久，此時期細胞開始生長，同時產生RNA及合成 蛋白質，複製胞器，細胞體積增加，目的是為了DNA複製做準備， 而此時期的染色體數目為2N。由G1 phase要進入S phase為第一個 checkpoint。 S phase：S意指為Synthesis，此時期細胞主要是進行DNA複製的工作， 此時期所需10~12小時，而此時期的染色體數目介於2N~4N之間。 G2 phase：為S phase與mitosis的中間時期，為進入M phase做準備，此 時在細胞核內的DNA含量由G1 phase的2N變成了4N，由S phase要進 入M phase為第二個checkpoint。 M phase：M意指為Mitosis，為細胞週期最短的一期，此時期主要的. 7.
(33) 工作為進行細胞核與細胞質的分裂，又可細分為數個時期： Prophase ： 核 內 複 製 完 的 染 色 體 進 行 濃 縮 ， 胞 質 中 mitotic spindle進行組裝，兩個centrosome分別向兩側移動。 Prometaphase：centrosome移至spindle pole處，核膜破裂，染 色體藉由kinetochores附著到spindle microtubules上，並開始移 動。 Metaphase：染色體排列於spindle pole中間的赤道板上，準備 進行分裂，此時為第三個checkpoint。 Anaphase：複製完的染色體進行分裂成兩個子染色體，此時 kinetochore microtubules開始縮短，spindle pole往外側移動。 Telophase：分裂完的子染色體移至spindle pole處，染色體開 始decondense，新的核膜及細胞質中contractile ring開始形成。 Cytokinesis：核膜形成完全，細胞質分裂為二，細胞準備重新 回到interphase。 當一個正常的細胞其DNA受到損傷時，便會啟動細胞中的修復機 制，它們會使進行中的細胞週期停滯（cell cycle arrest）以緩衝正在 受到傷害的細胞，所以當細胞週期停滯時，此時細胞正在進行修補作 用，修復完全細胞便可順利進行運轉，倘若細胞無法修補已造成的損 傷，那麼便會促使細胞走向凋亡作用，以避免錯誤遺傳至下一代。. 8.
(34) (二) 細胞週期的相關調控分子. (a) 細胞週期素(Cyclins) Cyclins 和 CDKs 是主要調控細胞週期的蛋白，細胞週期的調控需要 CDKs 來活化 Cyclin，單獨的 CDKs 是無法使下游分子形成磷酸化， 故兩者需結合形成複合物才具有活性進行細胞週期的運轉. (18). 。. (19). 目前已發現 12 種 cyclins，分別命名為 cyclin A～H. 。Cyclins 的過. 度表達可以啟動 CDK 活性，造成細胞週期調節失控，導致腫瘤的形 成，因此 cyclins 也被稱為癌蛋白。細胞週期中的各時期都會有特定 的 Cyclin-CDK complex: G1 phase 為 Cyclin D-CDK4/6 complex 及 Cyclin E-CDK2complex, S phase 為 Cyclin A-CDK2 complex, G2/M phase 為 Cyclin B-CDK1complex。而 Cyclin H 與 CDK7 會形成一個 具有酵素活性的複合物，可以活化 CDK1（Cdc2）與 CDK2. (20). 。. G1 期的 cyclins 包括 cyclin C, D, E 等三型，其中後兩型是主要的 cyclins。cyclin D 至少有 D1, D2 , D3 等三個亞型，三型 cyclin D 的胺基 酸序列同源性達 53.1﹪～ 63.5﹪，它們的 c 末端有一個富含哺氨酸 （P）、谷氨酸（E）、天冬氨酸、絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）的殘 基序列，稱之為 PEST 序列，與蛋白質的降解有關；它們的 N 末端有. 9.
(35) 一個與某些轉化蛋白如 SV40 的 T 抗原、腺病毒 E1A 蛋白、乳頭瘤病 毒 E7 蛋白共同序列 Leu-X-Cys-X-Glu，此序列一樣可與 pRb 及 pRb 相關蛋白結合，隨後在 CDK4 / CDK6 的作用下，使 pRb 磷酸化，從 而使細胞從 G1 期進入 S 期。一些生長因子（growth factors, GFs）可 誘導它們的表達，一旦去除 GFs，cyclin D1 的水準會迅速下降，因此， 稱它為生長因子感受器（growth factor sensors）. (21). 。在 G1 期，給正. 常的成纖維細胞顯微注射抗 cyclin D1 抗體，能夠阻止細胞進入 S 期， 但在接近 G1 / S 交界處時則注射無效，這一結果表明 cyclin D1 在 G1 的中晚期發揮著重要作用。cyclin E 在 G1 期的表達晚於 cyclin D1，在 G1 / S 交界處達到高峰，進入 S 期後逐漸下降，給細胞顯微注射抗 cyclin E 抗體，可阻止細胞進入 S 期，因此被認為是調節 G1 / S 期轉 (22). 換的必需蛋白 。細胞進入 S 期後，cyclin E 降解，和它結合的 CDK2 被釋放出來和 cyclin A 結合。 S 期 cyclins 包括 cyclin A。它是 cyclins 中最早被發現的，在 G1 晚期 於 cyclin E 之後表達，但直到 S 期與 CDK2 結合後才被啟動。給細胞 顯微注射抗 cyclin A 抗體或反義 cyclin A 能抑制細胞 DNA 的合成， 表明 cyclin A 在 S 期有重要作用。另外，它在 G2 期與 M 期和 CDC2 （CDK1）結合，可能與有絲分裂有關，因此，cyclin A 也被稱為 M 期 cyclins。. 10.
(36) (b) 細胞週期素依賴性激酶(cyclin dependent kinases；CDKs) (19). 目前已發現的 CDK 至少有九種 ，分別命名為 CDC2（CDK1）, CDK2 ～CDK9，它們在基因序列上的同源性高，超過 40﹪。活化的 CDK 包含 CDK 和一個 cyclin，前者還需要一個保守的 Thr 殘基上的磷酸 化和 Tyr 殘基上的去磷酸化。 CDK 被啟動後，可使其下游蛋白發生磷酸化。未磷酸化的 pRb 能夠 結合轉錄因數 E2F，並抑制 E2F 啟動 S 期相關基因的轉錄。磷酸化的 pRb 或 pRb 能導致 E2F 的游離。游離的 E2F 與 DP-1 形成異源二聚體， 能夠結合到 DNA 的特定位點，啟動 S 期相關基因轉錄，使週期越過 restriction point，細胞即從 G1 期進入 S 期. (23). 。. (c) CDK 抑制蛋白(CDK inhibitors；CDKIs) 1992 年，Xiong 等在分離純 cyclin-CDK 複合物時，得到了另外一些 蛋白質，後來證明其中某些蛋白是該複合物的抑制因子即 CDKIs. (24). 。. CDK inhibitors 就是抑制 CDK 活性的分子，CDKIs 在細胞週期中具有 負性調節作用及多數在人類腫瘤中會突變且失去活性。CDKIs 根據它 們序列同源性，主要可分為兩大家族： INK (Inhibitors of CDK4)家 族，包括 p16, p15, p18 和 p19，它們均包含四次錨蛋白（ankyrin）重. 11.
(37) 複結構和特異的調控 cyclin D-CDK4 或 cyclin D-CDK6 活性和 CIP/KIP 家族，包括 p21, p27 和 p57，它們抑制多種 cyclin-CDK 活性 (25). 。. CIP/KIP 家族中 p57 主要跟細胞的分化比較有相關，而 p21, p27 則對 (26). 於所有的 Cyclin-CDK complex 均有抑制作用 。p21 基因定位於染色 體 6p21.2，又稱為 cip1 （CDK-interacting protein 1） ，waf1 （wild-typep 53-activated fragment 1）。哺乳動物細胞中，p21 的功能至少有兩方 面：一是 CDK 的抑制因子，另一個是能結合和抑制增殖細胞核抗原 （PCNA），進而抑制 DNA 的複製。p21 能抑制多種 cyclin-CDK 活 性，推測其突變可能是腫瘤形成的主要原因之一。然而目前除了在膀 胱癌中發現一個終止密碼子的點突變外，尚未見到關於其他腫瘤細胞 中 p21 基因突變的相關研究。p21 在基因轉錄上主要受 p53 調節和啟 動，而 p53 基因突變在人類腫瘤中卻是常見的，故現認為 p21 基因主 要失活機制與 p53 失活有關. (27)(28). 。. 而 INK 家族則是對於 CDK4 和 CDK6 具有選擇性抑制，會與 cyclin D. 競爭 CDK4 和 CDK6 的結合區域，使 cyclin D 無法跟 CDK4 和 CDK6 (29). 形成有活性的 complex，而使得細胞週期停滯於 G1 phase. 12. 。.
(38) 四､細胞凋亡 (一)細胞凋亡的定義. (30). 細 胞 凋 亡 (Apoptosis) 又 稱 為 計 畫 性 死 亡 (programmed cell death; PCD)，是多細胞生物體受到刺激及發展過程中維持自我平衡的重要 機制。細胞凋亡會造成細胞型態的改變，細胞膜的皺縮和細胞核的塌 陷和瓦解，染色質濃縮成類似新月形碎片，胞內 DNA 被降解，細胞 會逐漸皺縮與聚集，磷脂醯絲胺酸(PS)從胞內向外翻出…等，但胞器 與細胞的膜仍維持完整，同時細胞凋亡體(apoptotic body)形成，並由 鄰近細胞或巨噬細胞所吞噬。. (二)細胞凋亡的調控機轉 細胞凋亡的路徑，主要可分為三大類. (31). ：. (1) 外在路徑，又稱為死亡接受體路徑（Death receptor pathway）： Death-receptor pathway 是指細胞膜表面存在著接受 apoptotic signals 的受器（receptor），例如： CD95（Fas）, TNFR1（Tumour Necrosis Factor Receptor-1）, TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）等 蛋白，而當這些死亡接受器蛋白與 death ligand（例如：Fas Ligand） 結合時，便會活化這些死亡接受器，而使細胞凋亡訊息傳遞到下游， (32)(33). 繼續活化 caspase cascade，而導致細胞很快走向凋亡. 13. 。.
(39) (a) TNFR1（Tumour Necrosis Factor Receptor-1） TNF 是由活化的巨噬細胞或是受感染的 T 細胞所產生的，TNF 和細 胞膜表面的 TNFR1 結合後，會吸引 TRADD (TNFR-associated death domain)結合至 TNFR1 膜內的 domain，進而活化 caspase-8，而使細 胞走向凋亡。. (b) TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）. (34). TRAIL 的 receptor 是 DR4 或 DR5，當 TRAIL 與 DR4 或 DR5 結合 後會吸引 DR4/DR5 death domain 結合，進而活化 caspase-8 和 caspase-10，而使細胞走向凋亡。TRAIL 所造成的細胞凋亡路徑跟 Fas 很相似，最大的差異在於 FasL 的表現需要 T 細胞和自然殺手細 胞(NK cell)的活化，而 TRAIL 的活化可以藉由許多組織的刺激來表 現。 (c) Fas/FasL (CD95/CD95L) Fas 是屬於 TNF (Tumour Necrosis Factor) receptor superfamily 中 typeΙ 的膜蛋白，FasL 則是屬於 TNF (Tumour Necrosis Factor) receptor superfamily 中 typeΙΙ的膜蛋白，當 Fas 與 FasL 結合時，會活化 Fas receptor，並且吸引 FADD (Fas-associated death domain)結合至 Fas receptor 位於細胞質中的 domain；另一方面，FADD 會進一步吸引多 分子 procaspase-8 形成的 DISC (Death-inducing signaling complex)， 14.
(40) 此時 procaspase-8 會因構形改變而活化成 caspase-8，而活化的 caspase-8 可以繼續活化下游的 caspase-3 和 caspase-7，而 caspase-3 又可以再活化 caspase-6，進而活化影響一連串的 caspase substrate； 除此之外，活化的 caspase-8 會促使 Bcl-2 family 中的 Bid 裂解成 tBid， tBid 會位移至粒線體中，而促使粒線體釋放出 cytochrome c，接著活 (35)(36). 化 caspase-9 和 caspase-3，最後也會使細胞走向凋亡. 。. (2) 內在路徑，又稱為粒線體路徑（Mitochondrial pathway）： 誘發細胞凋亡最具代表性的就是粒線體路徑，當細胞受到細胞外或細 胞內的壓力及傷害時，像是：放射性輻射、氧氣不足、藥物、DNA 損傷…等，會使細胞質的粒線體膜電位下降，膜孔打開促使 cytochrome c從粒線體的intermembrane space釋放到細胞質中，與 Apaf-1 (apoptotic protease actvating factor 1)與procaspase-9結合形成 apoptosome，在ATP或Datp的存在下，進而活化caspase-9，活化的 caspase-9也會促使下游的caspase-3、caspase-6、caspase-7活化，最後 誘導細胞走向凋亡. (a) Bcl-2 family. (37). 。. (38)(39)(40). Bcl-2 family在細胞凋亡中扮演著細胞存活調控的重要角色，可分為促 使凋亡蛋白分子（pro-apoptotic protein）及抑制凋亡蛋白分子 15.
(41) （anti-apoptotic protein）這兩類蛋白。 功能. 分類 Bcl-2 、 Bcl-xL 、 Bcl-w 、 Mcl-1 、 A1/Bfl-1 、. Anti-apoptosis. Boo/Diva、Bcl-B/Bcl-2L-10/Nrh Bax、Bak、Bok/Mtd、Bcl-xs、Bcl-GL、Bad、. Pro-apoptosis. Bid、Bik/Nbk、Blk、Hrk/DP5、Bim/Bod、Bmf、 Nip3/BNIP3、Nix/Bnip3L、Noxa/APR、PUMA、 MAP-1、Bcl-Gs. Bcl-2 family 這類的蛋白都含有 BH (Bcl-2 homology) domains，而且幾 乎 C-terminal 都含有 transmembrane domain，使其可以存在粒線體、 內質網、核膜上，但是促進凋亡的分子 Bad、Bid 則沒有，所以它們 平常存在細胞質中，如果接受到死亡訊息則會 translocation 到膜上， (41). 尤其是粒線體膜上 ，並且和促進凋亡分子結合，進而影響粒線體膜 電位的平衡，造成粒線體形成孔洞，粒線體的通透性改變而使 cytochrome c、AIF (apoptosis induced factor)、Endo G (Endonuclease G) 外留至細胞質. (42). ，cytochrome c 釋放至細胞質中會與細胞質中的. dATP、Apaf-結合後活化 caspase-9，而使細胞走向凋亡。. (b)細胞凋亡誘導因子（Apoptosis inducing factor；AIF） 細胞凋亡產生與細胞凋亡誘導因子（Apoptosis inducing factor;AIF） 16.
(42) 釋放具相關性，為caspase-independent cell death effector，其分子量57 kDa，存在粒線體內膜中，具有抑制Bcl-2 的能力。當粒線體的通道 發生改變時，會從粒線體膜間腔釋出，經細胞質最後到細胞核，之後 誘導染色質濃縮，最後造成DNA fragmentation而產生DNA裂解小片 段. (44). 。. (c)內核酸酶 (Endonuclease G; Endo G). (43). Endonuclease G是一種非專一性、非經Caspase活化的蛋白質，分子量 為30 kDa，也是一種在真核細胞中含量數最多的核酸水解酶 (nuclease)，在DNA單股及雙股皆具有活性，能夠裂解雙股DNA、單 股DNA、單股RNA，同時也具有多種生理活性包括：DNA修補、粒 線體DNA複製、參與細胞凋亡等等，當細胞凋亡機制被啟動時Bcl-2 家族被活化的pro-apoptosis蛋白，例如：Bax、Bid等，會增加粒線體 膜通透性導致Endo G蛋白由粒線體膜間腔釋放出來進入細胞核並且 執行nuclease的功能將DNA分解，而形成DNA fragmentation。. (d) Caspase enzyme family 在細胞凋亡過程當中必需要仰賴一群酵素，即為凋亡蛋白酵素 Caspase（cysteine aspartyl-specific protease），此種蛋白為一群具有專 一性的cysteine protease，專門切割aspartic acid residues，能夠進行一. 17.
(43) 連串的蛋白質脢解作用(proteolysis cascade)。Caspase蛋白系列均具有 相似的胺基酸序列、結構和專一性，都是以未活化的形式 （pro-caspase）存在細胞質裡，再經由裂解而活化，Caspase主要可分 為兩大類：initiator caspase 和effector caspase，initiator caspase受到外 來或細胞內凋亡訊息傳遞活化後，才會進一步活化effector caspase， initiator caspase：包含了caspase-2、8、9、10，而 effector caspase： 包括caspase-3、6、7。當粒線體凋亡機制被啟動時，此時存在粒線體 中的cytochrome c會被釋放出來和細胞質中的Apaf-1結合，形成一個 複合物進而活化caspase-9，進而活化caspase-3、6、7，而活化的caspase-3 又會去裂解具有DNA修復功能的PARP（Poly ADP-ribose polymerase） 蛋白，由116 kDa裂解成85 kDa，使得DNA損傷無法修復。活化的 caspase-3又會將ICAD (inhibitor of CAD)切除放出CAD (caspase-activated Dnase)造成DNA fragmentation，而使細胞走向凋亡 路徑。而其中的caspase-3又被認為是The point-of-no- return，意思是 指當細胞中的caspase-3蛋白一旦被啟動活化時，細胞便注定走向凋亡 (45). 作用，因此caspase-3又可當作是細胞凋亡作用晩期的重要指標 。. 18.
(44) 圖 1-2 細胞凋亡的內在路徑與外在路徑圖. (90). (3) 內質網壓力（Caspase-independent）： 一般來說細胞中的鈣離子（Ca2 ）會儲存在內質網中，當死亡訊息或 ＋. 藥物刺激下，會促使鈣離子從內質網釋放出來，導致細胞內外的鈣離 子恆定改變. (46). ，已有研究指出，鈣離子會影響粒線體膜電位，而使 (47). cytochrome c 釋出，以及產生大量 ROS，進而導致細胞凋亡 。而近 (48). 年來已有多篇文獻探討內質網和細胞凋亡作用兩者之間的關係 ，當 內質網受到外來環境的刺激，例如：藥物或是鈣離子濃度不平衡等 等，皆會造成 ER stress（內質網壓力） ，內質網(Endoplasmic Reticulum) 也是蛋白質合成與修飾的地方，因此，當內質網受到傷害時會使得蛋. 19.
(45) 白質無法順利摺疊，形成 Unfolded Protein Response (UPR)、 ER-associated degradation (ERAD)等一連串反應. (49). ，這時內質網上的. 功能蛋白 GRP78 便會被活化而與 Unfolded Protein 結合幫助蛋白質摺 疊，另一方面 ER stress 時，也會啟動內質網上的三個感應器蛋白： IRE1、PERK、ATF-6，促使這些蛋白被激發活化進而產生大量的 (50). GRP78 等蛋白 ，同時存在內質網中的鈣離子也會在 ER stress 發生 時，大量地被釋放出至細胞質，進而影響粒線體膜通透性導致膜電位 改變，最後誘發細胞產生凋亡，除此之外和 apoptosis 相關的 caspase-12 蛋白也會被 IRE1 活化，進而活化下游的 caspase 蛋白導致細胞 apoptosis。總之，大量的內質網壓力產生時，是會誘導細胞走向凋亡 (51). 路徑的 。. 圖 1-3 內質網壓力與細胞凋亡路徑圖 20. (52).
(46) (4)活性氧化物質 (Reactive oxygen species；ROS) 活性氧化物（Reactive oxide species；ROS）在誘導細胞凋亡的過程中 扮演相當重要的角色。ROS 誘導細胞凋亡有幾種主要路徑，第一， ROS 會活化 Fas/CD95，再繼續活化 caspase-8 使細胞凋亡進行；第二， ROS 攻擊內質網或粒腺體，誘導凋亡因子釋出讓細胞凋亡路徑產生； 第三，ROS 攻擊 DNA，讓 DNA 損害造成細胞週期停滯，誘導產生 細胞凋亡。近來有文獻指出，ROS 也會由粒線體所產生，於呼吸鏈 (53). 反應中產生大量的超氧陰離子 ，ROS 會造成細胞內 DNA 的損傷進 而誘導凋亡訊息的傳遞，許多外在的刺激皆會刺激細胞產生 ROS， 來誘導細胞產生凋亡. (54). 。ROS 的產生也可能會造成粒線體的通透性 (55). 改變，而導致粒線體膜電位下降 ，促使粒線體路徑的發生。. 圖 1-4 ROS 造成細胞凋亡的相關路徑. 21. (56).
(47) 第二節 研究目的 惡性腫瘤已經連續蟬聯二十五年的十大死因榜首，但是醫學上始終 沒有更有效的治療方法出現，「早期發現早期治療」是唯一的治療法 則，但是當癌細胞轉移至其他器官，甚至是蔓延全身時，難道患者就 只能坐以待斃。目前的臨床醫學就只能夠利用手術將癌細胞切除，如 果發生轉移的癌細胞，就只能利用放射線化療來毒殺癌細胞，但是放 射線化療不只是針對癌細胞，連正常細胞都會被毒殺，使得患者產生 相當大的副作用，而影響患者的生活品質。如果能夠研究出一種藥物 能夠使癌細胞自己產生凋亡，而不影響正常細胞的運作，而且只需服 用藥物，不需要利用手術即可達到治療效果，這將是癌症患者的一大 福音。 本論文的研究目的，就是以苯甲基異硫氰酸酯(benzyl isothiocyanate) 和苯乙基異硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate)進行體外癌細胞的研 究，探討對人類前列腺癌細胞株 DU-145 是否具有生長抑制，並且誘 導細胞凋亡的能力，並探討其誘導細胞凋亡的分子機轉。. 22.
(48) 第二章 研究方法 第一節 研究設計 DU-145 cells Added various concentrations of BITC or PEITC Incubate for different period Morphological changes examination by phase-light microscope Western blotting. Comet assay. Confocal microscope. Harvest cells. Flow cytometry. DAPI staining Viability examination Assay of cell cycle arrest. DNA electrophoresis. 23. Caspase activity. MMP、ROS and Calcium ion examination.
(49) 第二節 研究材料 一、 細胞株 本研究之實驗細胞株為人類前列腺癌細胞株（Human prostate carcinoma；DU-145）購自新竹食品發展工業研究所（Food Industry Research and Development Institute）。 二、 實驗藥物 苯甲基異硫氰酸酯（benzyl isothiocyanate） 苯乙基異硫氰酸酯（phenethyl isothiocyanate） 三、 藥品試劑 1. Dimethyl sulfoxide（DMSO）：購自 Sigma Chemical Co. 2. RPMI medium：購自 Gibco 3. Fetal bovine serum（胎牛血清；FBS）：購自 Gibco 4. L-Glutamine（麩胺酸；LG）：購自Gibco 5. Penicillum Streptomycin（PS）：購自 Gibco 6. Trypan blue：購自Sigma Chemical Co 7. Trypsin-EDTA：購自Amersco 8. Ethanol：購自TEDIA 9. Formaldehyde：購自 Merck 10. Methanol：購自TEDIA. 24.
(50) 11. Agarose Ⅰ：購自 Amresco 12. Acrylamide / Bis 40﹪solution（ACRYL / BIS. TM. 29:1）：購自. Amresco 13. Ammonium persulfate（APS）：購自 Amersco 14. ATP Determination Kit：購自 Blossom Biotechnologies,Inc. 15. BioMax Flim：購自 Kodak 16. Bovine serum albumin（BSA）：購自 Merck 17. 10X SDS buffer（Sodium dodecyl sulfate）：購自Amresco 18. Triton X-100：購自 Sigma chemical Co. 19. TEMED（N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine） ：購自 Amresco 20. Tris（Tris（hydroxymethyl）-aminomethane）：購自 Amresco 21. Tween 20：購自 Amresco 22. Sodium chloride （NaCl） ：購自 Merck Trypsin-EDTA：購自 Amersco 23. ECL kit（Enhanced chemiluminescent kit）：購自Amersham 24. Glycine：購自Amresco 25. 3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DioC6）：購自 Calbiochem 26. Disodium hydrogen phosphate（Na2HPO4）：購自 Merck ®. 27. PhiPhiLux -G1D1 kit：購自 OncoImmunin（Gaithersburg；MD；. USA）. 25.
(51) 28. Potassium dihydrogen phosphate（KH2PO4）：購自Merck 29. Potassium chloride（KCl）：購自 Merck 30. Protein assay-Dye reagent concentrate：購自 Bio-Rad 31. Protein marker：購自 Femantas 32. Propidium iodide（PI）：購自 Sigma Chemical Co. 33. RNase A（Ribonuclease A）：購自 Ameresco 34. 顯影劑：購自Kodak 35. 定影劑：購自 Kodak 36. 核酸純化試劑組（DNA purification kit）：購自 Gene Mark 37. 蛋白質萃取試劑（protein extraction solution）（PRO-PREP）：購. 自 iNtRON Biotechnology, INC. 38. 5X TBE buffer：購自 Amresco 39. Indo-1（calcium）：購自 Calbiochem 40. H2DCFDA（ROS 試劑）：購自 Calbiochem 41. Primary antibody （1°抗體）：.. A. anti-β-actin：購自 Sigma B. anti-Wee1：購自 Upstate C. anti-MMP-9：購自 Sigma D. anti-Bcl-xl：購自 BD. 26.
(52) E. anti-Bax：購自 Calbiochem F.. anti-Bid：購自 Sigma Chemical Co. G. anti-caspase 3：購自 Upstate H. anti-caspase 8：購自 Chemicon I.. anti-caspase 9：購自 Upstate. J.. anti-cytochrome c：購自 Sigma. K. anti-GADD153：購自 Santa cruz L. anti-GRP78：購自 Santa cruz M. anti-Cyclin B：購自 Upstate N. anti-Rock-1：購自 Santa cruz O. anti-PI3-Kinase：購自 BD P.. anti-Catalase：購自 Calbiochem. Q. anti-Cdc25C：購自 Calbiochem R. anti-p53：購自 Oncogene S.. anti-PARP：購自 BD. T. anti-PERK：購自 Santa cruz U. anti-Endo-G：購自 Sigma V. anti-MMP-7：購自 Sigma W. anti-GRB2：購自 BD. 27.
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