活細胞顯微照相

收集細胞以 1x10⁴ cells/well 種入 12 孔盤中，並且加入 doxycycline 進行誘導，放入 37℃培養箱培養 96 小時。之後置換新的培養液並加

入藥物(西藥濃度：20、30μM)處理 72 小時後加入 AO 或是 lysotracker 加上 Hoechst 染色 30 分鐘後以 PBS 清洗，以活細胞顯微照相系統觀 察。

當使用螢光顯微鏡觀察時，為了避免 poly-EGFP 受 AO 發出的綠 色螢光干擾，因此使用 lysotracker 對 lysosome 進行具專一性的染色，

不容易對其它螢光的觀察造成干擾。

結果

1. Flow cytometry

論文使用數種小分子化合物處理 Q61 以及 Q79 細胞株，再進行 AO 染色後，以 flow cytomery 測試亮度變化，利用 AO 進入 lysosome 會激發出紅色螢光的特性，以控制組的紅色螢光讀取值作為基準，與 比較藥物處理後所得的紅色螢光讀取值，可以觀察經藥物處理後 lysosome 是否與 autophagosome 結合，判斷藥物是否能夠增加細胞自 噬作用。

實驗結果顯示，測試過的藥物之中(Table. 2)，只有編號

YAO-Ram-1-021、Yao-Ramesh-A001 以及 Yao-Ramesh-A005 這三種藥 物在 20μM 濃度下處理 Q61 (Figure. 1)與 Q79 (Figure. 2)兩種細胞株 72 小時後，其紅色螢光量增加。其中 Q61 經過藥物處理的紅光增加 量較 Q79 大，YAO-Ram-1-021 與 Yao-Ramesh-A001 處理後，紅光數 量超過背景值。其數值可以由全體的 3%提升至 33%，而

Yao-Ramesh-A005 處理後，可以自 3.77%提升至 27.9%。(Figure. 3)

2. 活細胞顯微照相

進一步將藥物處理後的以 AO 染色細胞，以活細胞顯微照相系統

觀察細胞中紅光的增加情形。實驗觀察到以 YAO-Ram-1-021 處理後 細胞後。紅色螢光顆粒量明顯多於控制組(Figure. 4)。

實驗進一步以 Yao-Ramesh-A001 及 Yao-Ramesh-A005 處理後的 細胞，以 lysotracker 染色，並且以 Hoechst 對細胞核染色，將觀察到 的紅色（lysosome）、綠色（polyQ 聚集體）及藍色（細胞核）螢光照 相相片疊合，觀察三者間的位置關係。結果可以看出 Q61 細胞株 (Figure. 5)及 Q79 細胞株(Figure. 6)經過藥物處理後，細胞紅色螢光數 量上升， polyQ 聚集體的綠色螢光團塊則移動到細胞核外，且與紅 色螢光重疊，顯示 polyQ 聚集體受到藥物誘導，可以進行細胞自噬。

討論

YAO-Ram-1-021、Yao-Ramesh-A001 及 Yao-Ramesh-A005 這三種化合 物，這些化合物能夠於 Q61 及 Q79 細胞株中誘導細胞自噬作用(Table.

2)。

接著將經 YAO-Ram-1-021 處理的細胞加入 AO 染色後，以活細 胞觀測系統觀察，相片中發現，經處理後細胞中的紅光顆粒較控制組 增加，顯示經藥物處理後，細胞中的 lysosome 確實增加(Figure. 4)。

為了避免 AO 的綠色螢光與 polyQ-EGFP 互相干擾，實驗設計經 過 Yao-Ramesh-A001 及 Yao-Ramesh-A005 處理過的細胞，改以 lysotracker 與 Hoechst 對進行染色，並以活細胞觀測系統觀察。結果 顯示，藥物處理後，細胞中紅光顆粒的數量與控制組相比明顯增加，

與在 AO flow cytometry 中觀察到的結果相符。顯示 polyQ 的聚集在

藥物處理後，會移到細胞核外，並與 lysosome 重疊。這顯示

Yao-Ramesh-A001 與 Yao-Ramesh-A005 可以誘導細胞自噬作用，並使 細胞將 polyQ 聚集體移出細胞核之後，進行分解。未來需要補足以 YAO-Ram-1-021 處理的細胞，繼續以 lysotracker 與 Hoechst 染色，並 以活細胞觀測系統觀察照相的結果。

經過本次實驗篩選出 YAO-Ram-1-021、Yao-Ramesh-A001 以及 Yao-Ramesh-A005 這三種小分子化合物，它們都具有能夠誘導細胞自 噬作用增加的效果，且不會導致細胞死亡。在以活細胞觀測系統觀察 到 Yao-Ramesh-A001 以及 Yao-Ramesh-A005 處理後的細胞，可以將 polyQ 聚集體移出細胞核，並與 lysosome 結合。本來希望未來能夠進 一步驗證這三種藥物對於細胞作用的路徑，並且測試藥效的最低濃 度，再進一步於動物模式中驗證以這三種藥物如何增加自噬作用，是 否可以降低神經細胞 polyQ 聚集體蛋白質的密度。