1. 探討夏枯草抑制非小細胞肺癌細胞轉移機制 2.篩選以細胞自噬去除神經細胞堆積多麩胺酸的小分子新穎化合物

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 1. 探討夏枯草抑制非小細胞肺癌細胞轉移機制 The effect of aqueous extract of Prunella vulgaris in suppressing invasion and migration in human non-small cell lung cancer cells. 2. 篩選以細胞自噬去除神經細胞堆積多麩胺酸的小分子新穎化合物 Identification of novel small chemicals with autophagic clearance of polyglutamine aggregation in human neuroblastoma cells.. 研究生：黃中岳 Chung-Yueh Huang. 指導教授：方剛 Kang Fang. 中華民國一○一年八月二十七日.

(2) 1. 探討夏枯草抑制非小細胞肺癌細胞轉移機制. 摘要............................................................................................................. 1. 緒論............................................................................................................. 3. 研究背景................................................................................................... 13. 研究目的................................................................................................... 15. 研究問題................................................................................................... 16. 材料與方法............................................................................................... 17. 結果........................................................................................................... 24. 討論........................................................................................................... 28. 參考資料................................................................................................... 32. 圖表........................................................................................................... 38.

(3) 2. 篩選以細胞自噬去除神經細胞堆積多麩醯胺酸的小分子新穎化合物. 摘要........................................................................................................... 59. 緒論........................................................................................................... 61. 研究背景................................................................................................... 63. 研究目標................................................................................................... 65. 研究問題................................................................................................... 66. 材料與方法............................................................................................... 67. 結果........................................................................................................... 70. 討論........................................................................................................... 72. 參考文獻................................................................................................... 74. 圖表........................................................................................................... 75.

(4) 1. 探討夏枯草抑制非小細胞肺癌細胞轉移機制.

(5) 摘要癌症是由於體細胞複製脫離正常的調控而不斷快速複製異常細胞的現象。異常增生的細胞形成腫瘤侵入週邊組織持續擴大並影響原發部位的器官功能及壓迫周遭器官；而癌細胞進入人體的血液循環以及淋巴系統轉移至其它部位增生，更是具有威脅性。癌細胞的轉移，與分解細胞外基質(extracellular matrix, ECM)，以及促進血管新生的能力有很大的關聯。而在這些過程中，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)扮演了一個十分重要的角色。本研究利用中草藥處理人類肺腺癌細胞株(A549、H460 及 H1299) 以及以化學合成藥物處理 p53 mutation 之肝癌細胞株(Huh7)。實驗首先利用 gelatin zymography assay 篩選出具有抑制 MMP-9 與 MMP-2 活性能力之藥物，並以 western blot 觀察細胞懸浮液 MMP-9 與 MMP-2 的表現量。接著觀察藥物是否對細胞有毒性，再以 wound healing assay 觀察癌細胞移動能力的影響；最後以 invasion assay 觀察中藥對腫瘤細胞的侵入能力的影響。綜合以上的實驗結果看出，夏枯草能夠對肺癌細胞的 MMP-9 與 MMP-2 活性產生抑制效果，而且可以抑制肺癌細胞的入侵以及移動能力，在 H460 細胞株上的效果較為顯著，且藥效不會因 p53 的狀態而受到影響。另外本次實驗並沒有在所試驗的化學合成藥物中觀察到具抑制 MMP 活性的合成藥物。. 1. 關鍵字：肺癌、轉移、中藥、夏枯草、MMP-9、MMP-2、p53.

(6) Abstract Cancer cells grow and duplicate unregulated that form malignant tumors. The capability of cell invasion and migration from the origin site (metastasis) to nearby parts is the most threating. Cancer metastasis starts with the degradation of extracellular matrix (ECM). Both invasion to nearby tissue of cancer cell and inducement to angiogenesis relies on the matrix metalloproteinase (MMP) activity for ECM degradation. The thesis focused on treating cell lines, A549 (wild type p53 human adenocarcinoma), H460 (human large cell lung carcinoma) and H1299 (p53 deleted human adenocarcinoma) with Chinese herb medicine (CHM), and then detect changes of MMP-9 and MMP-2 activities by evaluating gelatin zymography. Both gelatin zymography and western blot to find out whether CHM can inhibit the MMP-9 and MMP-2 expression. The work is also to figure out whether MMP-9 and MMP-2 inhibition affects the migration and invasion capacity of the cancer cells. We have found that the aqueous extract of Prunella vulgaris can affects MMP-9 and MMP-2 activities in human lung carcer cells, and inhibit the invasion and migration of cancer cells. The other goal of this thesis is to find out new CHM‘s that are capable of inhibiting tumor angiogenesis and metastasis by evaluating MMP-9 and MMP-2 activities in human hepatocarcinoma cells.. 2. Keywords：lung cancer、metastasis、Chinese herb medicine、Prunella vulgaris、 MMP-9、MMP-2、p53.

(7) 緒論文獻評述癌症可說是近代人類最大的健康威脅，伴隨著工業文明的興起，圍繞在人們周圍的致癌物也逐漸增加。癌症的轉移能力是對人體健康的一大威脅，患者癒後的存活率會隨著轉移的發生而大幅降低。. 1. Matrix metalloproteinase (MMP) Matrix metalloproteinase 是 zinc-dependent endopeptidase 的一種，在人體內具有調控、降解細胞外間質(extracellular matrix, ECM)的功能(Loffek et al., 2010)。MMP 在一般情況下只會在細胞進行損傷組織修補、著床以及血管新生時少量表現(Zitka et al., 2010)。但在腫瘤組織中可以發現會有異於正常細胞的過度表現，特別是在惡性腫瘤中更是常見(John and Tuszynski, 2001)。至今的研究總共發現了 23 種 MMP(Klein and Bischoff, 2011) MMP 對於癌細胞的轉移十分重要。透過過度表現 MMP，會降解周圍 ECM 向周圍浸潤以到達血管，降解血管基底膜誘發進一步的血管新生或是讓脫離腫瘤的癌細胞進入血管進行轉移。過去曾經觀察到以 ribozyme 抑制腫瘤細胞之 MMP-9 的表現，會抑制該腫瘤細胞在老鼠體內進行轉移(Hua and Muschel, 1996)。透過抑制 MMP-9、. 3.

(8) MMP-2 的製造能夠明顯抑制轉移(Kang et al., 2008)。 MMP 受到多重的調控。在轉錄階段是由 interleukin、growth factor、tumor necrosis factor 等因子控制。合成後的 MMP 分子必須先被移除一部份 pro-peptide domain，使該區域得以與鋅離子結合活化 MMP(Corcoran et al., 1996)。MMP 活化後則是由 Tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) 負責活性抑制，TIMPs 分為 TIMP-1、 TIMP-2、TIMP-3 與 TIMP-4 四種類，能夠藉由與 MMP 分子 1：1 的結合以抑制 MMP 分子的活性。其中 TIMP-1 以及 TIMP-2 分別能夠與活化前的 MMP-9 及 MMP-2 結合並封鎖其作用(Howard et al., 1991, Goldberg et al., 1992)。 MMP-9 也稱為 gelatinase B，在酶原狀態分子量為 92 kDa，經過處理活化後會裂解為 82kDa，主要在人體內降解 type IV 與 type V collagens。MMP-2 也稱為 gelatinase A，酶原的分子量為 72kDa，經過活化後裂解為 66kDa，在人體內主要分解 type IV collagen。同屬一個家族的 MMP-9 與 MMP-2，有類似的特性，能夠降解的受質大致相同，一般利用這個特性，可以採用 gelatin zymography 同時分析兩者活性。. 4.

(9) 2. 血管新生 (angiogenesis) 血管新生是生理上微血管增生並發展成一個血流供應系統的過程。在胚胎發育時、人體成長以及傷口癒合中等正常情況中都會發生，另一方面血管新生同時也能為腫瘤提供成長過程中的養份、氧氣供應以及進入血管進行轉移的管道(Chung and Ferrara, 2011)。血管新生的誘因主要是組織中的細胞處於缺氧狀態，此時細胞會製造 hypoxia-inducible factor (Jespersen et al.) vascular endothelial growth factor (VEGF)釋出，而誘發更多血管新生。VEGF 為一類促進血管或是淋巴管生成與分化相關的生長因子，其分類包括 VEGF-A、 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 以及 placenta growth factor (PLGF)(Clauss, 2000)。VEGF 會與內皮細胞表面的 VEGF receptor 結合，再透過 tyrosine kinase pathway 進行訊息的傳遞，誘發內皮細胞的增生 (Stuttfeld and Ballmer-Hofer, 2009)。腫瘤組織中由於細胞異常的增生，使腫瘤內部的細胞處於嚴重缺氧狀態。如此會促使癌細胞 hypoxia-infucoble factor (HIF)大量誘導，導致 VEGF 的濃度提高，刺激血管新生(Ahluwalia, 2012 #42389)。目前已知若是能夠阻斷 VEGF 的訊息路徑便能抑制血管新生的發生 (Zhang et al., 2011)。內皮細胞受到 VEGF 刺激同時也會釋出 MMP，它降解 ECM 製. 5.

(10) 造孔道並且降解血管的基底組織讓原本血管內的內皮細胞脫離，這些內皮細胞接著進入周圍 ECM 被降解產生的間隙中增生，形成微血管，並與原有的血管連接以構成一個有效的微血管網路(Maragoudakis et al., 2002)。腫瘤誘發的血管新生有利於腫瘤的擴散以及轉移(Rouhi et al., 2010)。而過去的驗顯示若是抑制 MMP 的表現也能夠間接地降低 VEGF 表現(Chetty et al., 2010)。. 3. 轉移轉移(metastasis)是部份癌細胞脫離原發部位移動到其它部位並再次增生、發展成腫瘤的生理現象。癌症治療所遭遇到的最大障礙，便是轉移能力。即使經由手術去除了患部的腫瘤，轉移到其它部位的癌細胞也可能會復發造成病人死亡。因此它也是評斷癌症發展程度以及治療難度的重要指標，同時也是治療後病人的存活以及腫瘤再發的可能性的指標(Chambers et al., 2002)。轉移代表著腫瘤組織與循環系統的連結。腫瘤起始時是由癌細胞接觸周圍組織，透過滲透作用，自周圍獲取養份。當腫瘤增長擴大到一定程度後，位於內部的癌細胞便會處於養份以及氧氣濃度皆偏低的環境，因此癌細胞會誘導血管細胞進行血管新生進入腫瘤中生成微血管網路以獲取血流中的資源。部份脫離腫瘤的癌細胞將能夠經由微血. 6.

(11) 管進入血管或是淋巴管並順著體液的循環移動。這些流動於人體中的癌細胞有機會突破免疫系統而存活於血管或是淋巴管中，並順著體液流動並進入身體其它部位重新增殖形成新的病灶，完成整個轉移的過程(Fidler, 2003)。. 4. 肺癌肺癌多半肇因於呼吸時所吸入的毒物，包括吸菸、吸入石棉以及空氣污染(Biesalski et al., 1998)。肺癌具有很大的多樣性，主要可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)以及非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC)；SCLC 佔了全體肺癌形式約 16%，而 NSCLC 則是佔了 80%以上(Travis et al., 1995)。這個分類對於治療上有很重要的意義。NSCLC 對於化學及輻射療法較不敏感，通常採用外科手術移除，並且加上 cisplatin 等藥物治療(Nykamp, 2010)，另外對於 EGFR 突變的患者則使用 EGFR tyrosine kinase inhibitors 進行治療，目前常用藥物為 gefitinib (Girard et al., 2004)； SCLC 對化學及輻射療法較敏感，但雖然 SCLC 治療前期對於藥物的反應良好，之後卻容易復發(Rosti et al., 2006, Bruckl et al., 2008)，目前於藥物的選擇上也經常使用含鉑藥物進行治療，但是此種藥物的毒性高，對患者治療後的生活品質有很大的影響(Amarasena et al.,. 7.

(12) 2008)。. 5. 肝癌肝癌的成因可能為酒精或病毒引起的肝炎、肝硬化，或是攝取入了黃麴毒素等致癌物質，而肝炎病毒較盛行也是肝癌發生率東南亞高於歐美的原因之一(Eto et al., 1994)。肝癌具有相當強的轉移能力，能夠迅速從原發部位轉移到肝臟其它部位並順著流經肝臟的血液轉移到其它器官(Toyosaka et al., 1996)。肝癌細胞的高度轉移能力除了造成多發轉移性肝癌之外也容易導致治療後的復發，讓肝癌的死亡率高居不下。. 6. 中藥中藥一直是中國的主流藥物，它伴隨著悠久的歷史不斷演進、成長，不只是單純為了治療疾病發展的手段，也可以用於調養身體機能，是一具全面性的健康管理系統，中藥不僅在全世界以健康食品或民俗療法的方式廣為流傳(Lu et al., 2004) ，在中國的現代醫療中更仍是主流用藥的一種。中國醫學的中心思想提倡人體的理想狀態是為人體內的各個機能達到平衡狀態，而疾病便是失去平衡的結果(Seki et al., 2005)。中藥. 8.

(13) 與西藥最大的不同在於中藥並不是以消滅致病原為目的，而是著重於協助人體調整；中藥使用的基本原則是對症下藥，中國醫學的基本思想為人體的內部與外在緊密相聯，若是體內產生了病變便會自然的反映到外在，因此中醫會在問診時會詳細詢問、觀察患者的脈搏、皮膚、舌頭等等表癥，將觀察到的結果加以整理、分析，歸納出病況的特徵並選取適合的藥物以進行治療，減緩症狀並輔助人體的自癒能力，回復人體自然的平衡。中藥的原料主要取材於植物，通常會同時使用多種藥方，除了減輕症狀的藥物外，還會加入其它的藥物進行諸如提高其它藥方效果、降低毒性等的輔助，並互相配合依照使用的需要製成茶水、藥粉、湯藥等，處理過程中鮮少加入化學合成物，並且與時俱進，演進為對於人體的毒性較低(Lu et al., 2004)，也很少有副作用產生的療法。中藥與西方醫學對於癌症治療的觀點也有很大的不同，西方醫學的觀點指出癌症是人體內不受控制增生的惡性細胞，應該以外科手術、化學治療以及放射線予以清除。中醫的觀點則是認為癌症是在人體虛弱的基礎上再加上外在的致病因素相互作用導致氣血運行失調，最終導致病理產物聚結於體內形成組織異常增生，因此中醫對癌症治療並不挶限於病灶本身，而是結合治療與攝生調養，一方面運用藥物消解癌症的症狀，抑制腫瘤的生長，一方面用藥調理人體，提高. 9.

(14) 人體免抑功能以達到抗癌目的。. 7. 中藥與肺癌治療近年來中藥於肺癌治療的研究中逐漸受到重視的原因在於其藥效可以顧及全面性。目前癌症的藥物治療主要包括以具細胞毒性的化學合成藥物或是放射線將癌細胞殺死或是直接以外科手術摘除成為病灶的部份或全部器官，雖然在清除癌細胞上較中藥來得有效率，但是不管是哪種方法都無法避免對其他正常部位造成傷害，特別是藥物同時也可能產生許多副作用諸如噁心、嘔吐、貧血等等，讓患者即使能夠清除癌細胞也會大幅降低術後的生活品質(Akin et al., 2010)。中藥在近年來的研究中除了已經發現許多有希望能夠應用於肺癌治療的成份，對於對化學合成藥物較不敏感的 NSCLC 來說，中藥是一個十分有潛力的治療方案，例如前人研究就曾指出利用自雷公藤中萃取出的南蛇藤醇能夠在 NSCLC 細胞株 A549 中抑制細胞的生長以及誘導細胞凋亡(Mou et al., 2011)；除此之外，中藥與化學藥物治療併用時的效果也十分重要，研究指出在對肺癌患者實行化療時併用中藥的患者比起單獨接受化療的患者相比，在 12、24 及 36 個月的時間點所統計出的生存率較高、對藥物的反應也較好，此外白血球下降的情況也較輕微(Shu et al., 2005, Xu et al., 2011)。目前晚期肺癌患者. 10.

(15) 的治療一般會投入含鉑藥劑的化學治療，但是其毒性非常高，容易對於患者的腎臟造成傷害(McWhinney et al., 2009)。研究指出將中藥應用於晚期肺癌治療能夠提高患者的存活率，與含鉑藥物併用時有助於提高藥物的效果並減輕化學藥物對於人體的毒性(McCulloch et al., 2006)，也可以減輕患者經過化療後的暈眩、嘔吐以及貧血的症狀，提升患者的生活品質(Chen et al., 2010, Dong et al., 2010, Jeong et al., 2010)。過去研究指出中藥夏枯草(Prunella vulgaris)中萃取出的齊墩果酸(oleanolic acid)對肺線癌細胞 SAC-A-1 具有透過降低 Bcl-2 的表現量以及提高 Bax 與 Bad 的表現量來誘導細胞的凋亡(Feng et al., 2011)，另外也有研究指出，冷凍乾燥的夏枯草水煮萃取物，經過濾處理後的產物，能夠抑制 12-phorbol 13-myristateacetate (PMA)誘導的 NF-kappaB 活化以及 ERK1/2 的磷酸化，最終造成 MMP-9 表現量降低的結果。此外在以 B16-F10 黑色素瘤細胞對 C57BL/6 老鼠進行靜脈注射時觀察到轉移能力的抑制及在以 B16-F1 黑色素瘤細胞對 C57BL/6 老鼠進行皮下注射時，細胞增生能力受到抑制(Choi et al., 2010)。鴉膽子(Brucea javanica)為一常見於東南亞地區之常綠灌木，一般取其種子做為藥材。前人研究指出鴉膽子之水萃取物針對腫瘤細胞具有毒性，並且使經藥處理的細胞中的 p53 蛋白質量顯著上升(Gao. 11.

(16) et al., 2011)。苦參(Sophora flavescens)做為藥材使用的部份為其根，過去的研究發現自其根能夠萃取出能夠促進腫瘤細胞凋亡的成份 (Liang et al., 2011)，目前經過較多研究的成份為苦參鹼，是自苦參的根所萃取出的一種生物鹼，有研究指出苦參鹼能夠抑制肝癌 (SMMC-7721)以及非小細胞肺癌細胞(A549)的生長(Zhang et al., 2009)，同時它能夠抑制 A549 的 VEGF-A 的分泌並能夠促增進 trichostatin A 抗癌的效果(Zhang et al., 2009)。. 8. p53 腫瘤抑制蛋白 p53 為人體中腫瘤抑制蛋白的一種，主要的抑制機轉為中斷基因受損細胞的細胞週期以阻止異常細胞的增生，以及誘發細胞凋亡以除去異常的細胞；反之在癌細胞中可以觀察到 p53 因為 p53 基因突變而失去功能(Suzuki and Matsubara, 2011)。 p53 對於 MMP-2 與 MMP-9 的調控也有相當的影響；它能夠透過位於 MMP2 之 promoter 上的 p53 結合點誘導 MMP-2 生成(Bian and Sun, 1997)，另一方面也能夠透過抑制 Nuclear Factor-κB 路徑達到抑制 MMP-9 製造的結果(Liu et al., 2006)。因此本論文的重點是探討 p53 與 MMP-9 及 MMP-2 之關係。. 12.

(17) 研究背景. 1. 中藥對於癌症治療的效果根據前人的結果，夏枯草、鴉膽子以及苦參等三種藥材在肝癌細胞模式上驗證了它們對能夠抑制肝腫瘤細胞(HepG2、Hep3B 與 Huh7) 的移動能力。發現其中夏枯草對於肝腫瘤細胞的 MMP-2、MMP-9 的活性也有抑制的效果。過去研究也指出，使用夏枯草處理 HepG2、 Hep3B 與 Huh7 之後能夠透過抑制 MMP-2 與 MMP-9 抑制癌細胞的轉移；鴉膽子與苦參則沒有抑制增生及傷口癒合的功能(Kim et al., 2012)。本論文便是希望延伸過去的結果，觀察肺癌細胞是否有任何抑制癌細胞轉移的效果，若有任何效果，其藥效是否與 p53 有關。所使用的 NSCLC 細胞株為 A549、H460 及 H1299。A549 為具 wild type p53 的人類肺腺癌細胞(human lung adenocarcinoma)，H460 為具 wild type p53 的人類大型肺癌細胞(human large cell lung carcinoma)，是常見用於研究藥物代謝的肺癌細胞模型。H1299 為肺腺癌細胞株，特徵為缺乏 p53 基因 (VanderBorght et al., 2006)，使用三種細胞之間可以研究藥物對肺癌細胞的影響是否與 p53 有關。實驗使用的肝癌細胞株為 Huh7，它在 p53 的 codon 220 是將酪胺酸置換為半胱胺酸的點突變. 13.

(18) (Hailfinger et al., 2007)。實驗也篩選更多化學合成物，看它們是否也能抑制肝癌細胞的轉移能力。實驗中所使用之中藥皆為藥材的水萃取物，保存於室溫，每一克成品相當於一克藥材。使用的化學合成藥物來自於化學系有機合成實驗室，固體皆為溶於 dimethyl sulfoxide，保存於 4℃。. 2. 水藥本計畫中使用的中藥循傳統水藥的製作方式，是將藥材以水熬煮後，再以離心去沉澱的水萃取物；因此水藥中的藥性成份自然是以水溶性分子為主。一般水溶性低的藥物在人體內不容易被吸收，也不容易進入細胞，需要有其它物質輔助才能順利發揮藥效。如果使用水藥則沒有這方面的問題，在藥物治療上是一項重要的優點。冷凍乾燥技術處理雖然能夠得到藥物成分濃度較高的藥品，但是其最大的缺點在於設備成本以及操作技術的需求較高，連帶提高了中藥治療的成本；而水藥的成本較低，也能夠減低患者的負擔，同時製備的程序簡便，在使用上的困難度較低，符合一般民眾用藥需求。. 14.

(19) 研究目的. 本計劃的目的為繼續驗證夏枯草、鴉膽子以及苦參這三種中草藥對於肺癌細胞的影響；觀察這三種中草藥的處理，是否能抑制 MMP-9 以及 MMP-2 的活性、減緩癌細胞的移動轉移能力；論文使用這三種涵蓋 wild-type p53 以及 p53 deletion 細胞株，觀察中草藥所引發的 MMP-9 與 MMP-2 與轉移能力的抑制，是否會有差異，並且推斷藥物抑制 MMP-9 與 MMP-2 活性以及減緩腫瘤移動與轉移機轉是否與 p53 有關。此外也利用小分子化合物處理肝癌細胞，篩選能夠抑制肝癌 MMP-9 與 MMP-2 活性的新藥。. 15.

(20) 研究問題癌症的轉移的基礎建立於癌細胞與周圍的細胞外基質以及血管間複雜的交互作用。腫瘤與血管連接，也是讓腫瘤為了獲得增生時所需的氧氣與養分。因此若是能夠有效的阻斷癌細胞與周圍血管間的作用，可以減緩腫瘤轉移發生的效果。論文主要涵蓋內容包括： 1. 利用 zymography 以及 western blot 驗證本實驗中所使用的藥物是否能對癌細胞的 MMP-9 及 MMP-2 活性有任何影響，並且進一步推測其影響可能因為基因的表現量造成活性抑制的效果。 2. 以 wound healing assay 與 invasion assay，觀測肺癌細胞經過藥物處理後，是否能夠減緩癌細胞移動，以及抑制癌細胞的侵入能力。 3. 估算出細胞經過藥物處理後的細胞存活率，以驗證實驗所使用的藥物是否對於細胞是否具有毒性。 4. 觀察以藥物對不同 p53 基因型細胞株的結果是否會有差別，以判斷 MMP-9 與 MMP-2 的調控與 p53 之間的關係。. 16.

(21) 材料與方法. 1. 細胞培養與樣品處理本論文使用之細胞是以加入 10%胎牛血清之 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Invitrogen, Grands Islands, NY)培養，並培養於 37℃及 5%二氧化碳的環境下；Huh7 細胞株需額外加入 0.1% non-essential amino acid (Sigma, St. Louis, MO)。收集細胞時首先清除舊的培養機後，以 PBS 清洗兩次，再加入 trypsin-EDTA，靜置 5 分鐘使細胞浮起，以含 10% FBS 之 DMEM 終止 trypsin-EDTA 的作用並沖起細胞收集後，以離心機去除含 trypsin-EDTA 之上清液後加入含 2% FBS 之培養基使細胞懸浮。在進行加藥處理時則是將 FBS 濃度降低至 2%進行培養以降低上清液樣本中含的 FBS 對 western blot 結果造成影響。由於中藥為水萃取物，因此控制組不需要額外加入其他物質，而使用化學合成藥物時是溶於 DMSO 中，因此加入 0.2%的 DMSO 作為控制組。收集上清液樣本時直接抽取全部經加藥處理後的細胞培養基至 1.5ml 微量離心管中，放入離心機以 13,200 rpm，4℃下離心 30 分鐘後抽取上清液至新的微量離心管中去除雜質後備用。濃縮樣品則是將收集的上清液樣品再次離心去除雜質後取約 500μl 上清液樣品於. 17.

(22) 1.5ml 微量離心管中，以 parafilm 封住管口後以針頭於其上穿出數個洞，放入真空濃縮離心機濃縮至約 200μl 以備使用。. 2. Invasion assay 首先在 4℃下融解 Basement Membrane Extract (BME)，若是必要以未加入 FBS 的細胞培養基稀釋至約 10 mg/ml。將 BME 注入 24-well Transwell 中，每一格 20μl，之後將 24-well tanswell 置入 24 孔盤中，於 37℃培養箱放置 30 分鐘使 BME 凝固。收集細胞，將細胞液濃度以含 2% FBS 之培養基調整為 2 x 105 cells/ml，取 200μl 細胞液置於 BME 上，在加入細胞前 BME 需先以常溫且未加入 FBS 的細胞培養基潤洗過，完成後將 24 孔盤於 37℃下培養隔夜。後清除 Transwell 中的培養基，加入 200μl 新的含 2% FBS 培養基及藥品(中藥濃度：夏枯草使用 2.5 及 10 mg/ml)，24-well Transwell 的下層則是加入 750μl 含 15% FBS 的培養基於 37℃下培養隔夜。最後以 trypsin-EDTA 收集侵入 Transwell 底面以及 24 孔盤中的細胞以 trypan blue assay 進行計數，以計數得到的數量即可推估穿過 BME 並且侵入下層的細胞數量。 BME 在實驗中作為模擬人體 ECM 以及血管基質膜，區隔了 Transwell 以及 24 孔盤。利用 15% FBS 誘導細胞穿過 BME 進入下層. 18.

(23) 以模擬細胞侵入的過程，因此穿過 BME 到達下層的細胞數的改變即為細胞侵入能力的改變。. 3. 活細胞計數收集細胞並以 2x105 cells/well 種入 6cm 培養皿中於培養箱內培養 24 小時，待細胞貼附於盤底後更換培養基並加入藥物 (中藥濃度：夏枯草使用 1、2.5、5 及 10 mg/ml，苦參使用 10 mg/ml) 後繼續於培養箱內培養。分別於加藥處理 24 與 48 小時後移除培養基，將細胞以 PBS 輕輕沖洗數次後以 trypsin-EDTA 沖起收集。將收集之細胞液以 800 rpm 離心 5 分鐘後除去含 trypsin-EDTA 的上清液，將沉積物以 1ml 含 2% FBS 之 DMEM 重新懸浮，從中取出 10μl 細胞液與 trypan blue 以 1： 1 的比例混勻，放入專用計數盤，以自動細胞計數器(Countess, invitrogen) 計數。取其所計數的結果比較未加藥的控制組與經過藥物處理的細胞在經過培養後的活細胞數目，得知藥物是否對細胞具有毒性。. 4. Gelatin zymography 收集細胞以 5x105 cells/well 種入 6 cm 培養皿於培養箱內培養 24. 19.

(24) 小時使細胞貼附於盤底，接著更換成新的培養基 2ml 並將藥物 (藥物濃度：夏枯草與鴉膽子使用 1、2.5、5 及 10 mg/ml，苦參使用 10 mg/ml，化學合成藥物使用 30μM) 加入後放回培養箱內進行培養。分別收集加藥培養 24 及 48 小時後的上清液樣本，取 5μl 上清液樣本與 7μl 去離子水及 2μl loading buffer 混合後以 55℃下加熱 5 分鐘，再於-20 ℃冷卻 5 分鐘。混合液放入含有 gelatin 的 SDS-gel 以 90V 進行 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 3 小時。. 膠片內容物如下： 10 % Separating gel. 5% Stacking gel. 1.5M Tris-HCl. 2 ml. 0.5M Tris-HCl. 30% acrylamide. 2.67 ml. 333 μl. ddH2O. 3.25 ml. 1.17 ml. 10% SDS. 80 μl. 20 μl. 10% APS. 50 μl. 20 μl. TEMED. 9 μl. 3 μl. 4% gelatin. 200 μl. ─. 500 μl. 結束電泳後將膠片取出並於 2.5%的 trion X-100 浸泡搖晃 30 分鐘. 20.

(25) 以去除 SDS，後以 ddH2O 搖晃清洗數次去除 triton X-100。清洗結束後將膠片放入 10x development buffer (50 mM Tris base、0.1 M Tris-HCl、0.2 mM NaCl、5 mM CaCl2、1%Triton X-100 (v/v)、加入 ddH2O 調整總體積，使用時以 ddH2O 稀釋 10 倍) 於 37℃下靜置約 16 小時以活化 MMP-9 及 MMP-2 後進行染色。染色前需先去除 development buffer，再將膠片以水浸洗數次後加入 Coomassie Brilliant Blue (2.5 mg/ml Coomassie Brilliant Blue 溶於 45 ％methanol、10％glacial acetic acid、45％ddH2O (v/v)) 浸泡染色 3 小時。完成染色後除去染劑，將膠片以 destaining solution (50％ methanol、10％glacial acetic acid 加水混合) 浸泡退染 30 分鐘，再使用冷光儀( LAS3000, FujiFilm )進行拍照紀錄。經過 development buffer 處理過後，膠片上活化的 MMP 將會降解周圍的受質(gelatin)，利用染劑 Coomassie Brilliant Blue 具有與蛋白質分子結合的性質，讓膠片上 MMP 的部份無法染色，因而得以觀察各樣品中 MMP 的活性。細胞上清液樣品則由於培養液中含有胎牛血清而不適合進行 Bradford assay，因此採用取同樣體積的不同藥物濃度樣品的方式來確保取樣量相同。. 21.

(26) 5. Wound healing assay 收集細胞以 2x106 cells/well 種入 12 孔盤之中，培養 24 小時後除去培養基，以 10μl tip 於細胞上劃上刮痕，再以 PBS 小力洗去懸浮的細胞，同時要避免沖起貼附的細胞；置換新的培養基後加入藥物 (中藥濃度：夏枯草使用 1、2.5、5 及 10 mg/ml，苦參使用 10 mg/ml) 於培養箱繼續進行培養。取培養 24、48、72 小時後的時間點以顯微照相機觀察刮痕癒合情形並拍照紀錄，於刮痕上最少取三點計算刮痕寬度。計算並比較這三個時間點的傷痕寬度可以表現出細胞的移動、傷痕癒合能力。. 6. Western blot analysis 收集細胞以 2x106 cells/well 種入 6 cm 培養皿於培養箱內培養 24 小時使細胞貼附於盤底。24 小時後置換新的培養液 2ml 並將藥物 (藥物濃度：夏枯草使用 1、2.5、5 及 10 mg/ml，苦參使用 10 mg/ml) 加入後繼續於培養箱內進行培養。分別收集加藥培養 24 及 48 小時後的上清液樣本，並進行濃縮以使用。濃縮上清液樣品以 8%膠片進行兩階段的 SDS-PAGE，第一階段以 60V 進行 30 分鐘，第二階段以 120V 進行 90 分鐘。電泳結束後將膠片以 80V 轉漬 30 分鐘至 nitrocellulose blotting membrane (PALL corporation, P-N66485)。轉漬完成後以 PBST. 22.

(27) 洗去膜上殘留的凝膠碎片等，再將濾膜浸泡於 5% 的 nonfat skin milk(溶於 PBST 中)一小時後以 PBST 洗去 skim 脫脂奶，加入 MMP-2/MMP-9 抗體(Santa cruz Bio, Inc.)置於 4℃隔夜後以 PBST 洗去抗體，再加入二次抗體於室溫下放置一小時後洗去。完成後以 ECL Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare)進行顯色，再以 LAS-3000 照相紀錄。抗體以 PBST 稀釋，MMP-2 與 MMP-9 的抗體稀釋倍率為 1,000 倍，二次抗體則為 3,000 倍。濃縮的細胞上清液樣品則由於培養液中含有胎牛血清而不適合進行 Bradford assay，因此採用取同樣體積的樣品的方式來確保取樣量相同。. 23.

(28) 結果. 1. Gelatin Zymography 本論文使用 A549，H460 及 H1299 三種肺癌細胞，分別以鴉膽子、夏枯草以及苦參的中藥水萃取物進行處理。經過處理 24 小時與 48 小時後，收集培養上清液，上清液樣品經過離心處理，去除細胞碎片及中藥藥渣等雜質後的，進行 gelatin zymography，觀察膠片上 MMP-2 (72kDa)及 MMP-9 (92kDa)作用所呈現的白色帶狀的消長，做為藥效的指標。。實驗中可以觀察到，以鴉膽子以及苦參處理這三種肺癌細胞上清液樣本進行 gelatin zymography 之後，膠片上於 92kDa 與 72kDa 位置出現的白色帶與未經藥物處理的控制組比較下，沒有明顯的差異。顯示對三種細胞中的 MMP-9 與 MMP-2 的活性，並沒有受到鴉膽子與苦參的影響。而當使用夏枯草處理的細胞上清液樣品時，三種肺癌細胞中的白色帶密度與控制組相比，都有明顯不同程度的降低。顯示以夏枯草處理時三種細胞中 A549(Figure. 1A)、H460(Figure. 2A)、 H1299(Figure. 3A)的 MMP-9 與 MMP-2 活性皆有降低。以影像分析軟體可以將 zymography 的結果進行量化分析。當夏枯草濃度增至 5 mg/ml 時，A549(Figure. 1B)以及 H460(Figure. 2B)細. 24.

(29) 胞株的 MMP-9 與 MMP-2 活性會降低至控制組的的 40%。當夏枯草濃度提升至 10 mg/ml 時，MMP-9 與 MMP-2 的活性下降到控制組的約 20%以下。而 H1299 細胞株中夏枯草的濃度達 5 mg/ml 時，MMP-9 與 MMP-2 的活性降到了控制組的 40%，而當濃度提高到 10 mg/ml 時，其活性僅為控制組的 20%，下降的幅度較 A549 及 H460 為低 (Figure. 3B)。實驗也試著篩選能夠在 Huh7 細胞株中同樣能夠抑制 MMP-9 與 MMP-2 活性的小分子化合物。將收集以處理的肝癌細胞培養液進行 gelatin zymography 分析，但是在癌細胞經藥物處理後，MMP-9、 MMP-2 活性與僅加入 DMSO 的控制組相比較，都沒有明顯差異。 (Table. 1). 2. 活細胞計數實驗收集經過藥物處理 24 小時以及 48 小時後的細胞以 trypan blue assay 進行計數。實驗結果顯示三種細胞加入不同濃度的夏枯草處理 24 及 48 小時後收集細胞的數目，皆高於實驗使用的細胞數目（2 x105 個）。隨夏枯草濃度提高，細胞數也沒有有任何明顯變化。這樣子的結果，顯示夏枯草對於三種細胞沒有明顯的毒性影響 (Figure. 4、5 and. 6)。. 25.

(30) 3. Wound-healing assay 由 wound-healing assay 可以觀察夏枯草處理對癌細胞的移動能力的影響。以 A549 細胞藥物處理 24 小時後，控制組經過癒合傷痕寬度，僅有 10 mg/ml 組的一半，但使用的的濃度在 1 與 2.5 mg/ml 時，細胞的傷痕癒合能力，沒有顯著的影響；當濃度達到 5 mg/ml 以上，經過 72 小時處理後，傷痕也沒有明顯癒合，顯示癒合能力的抑制，與時間及濃度相關(Figure. 7)。當 H460 細胞株處理 72 小時後，始能觀察到控制組的傷痕寬度與加藥組有明顯的差異。雖然在夏枯草最低濃度(1 mg/ml))處理時與控制組的傷痕寬度便出現了差異 (Figure. 8)。由 H1299 的結果可以看出，控制組的傷痕經過 24 小時後就已經接近完全癒合，但是夏枯草到達濃度 10 mg/ml 時，始能觀察到傷痕癒合停止(Figure. 9)。因此結果顯示，相較 A549 以及 H460，H1299 對於夏枯草的敏感度較低。. 4. Western blot 實驗以夏枯草處理細胞並收集其上清液，再以抽氣離心機進行濃縮處理，取濃縮完成的樣品進行 western blot，實驗使用 MMP-2、. 26.

(31) MMP-9 的單株抗體做分析。以夏枯草處理 A549 細胞時， MMP-9 的表現量隨著夏枯草濃度上升而降低，MMP-2 則是在未加藥的控制組與夏枯草濃度為 1 mg / ml 有相近的表現量，當夏枯草濃度升高到 2.5 mg/ml 時，則 MMP-2 表現量大幅降低(Figure. 10)。以夏枯草處理 H460(Figure. 11)及 H1299(Figure. 12)時，其結果與 A549 時相近。顯示夏枯草處理對於 MMP-9 與 MMP-2 的表現量都有抑制的效果，但是夏枯草對於 MMP-2 的影響較對 MMP-9 的影響更明顯。. 5. Invasion assay 實驗分別將細胞株種於以 BME 披覆的 24-well transwell 中。待固定之後，加入不同濃度的藥物，培養隔夜以觀察細胞分解 BME，侵入底層的能力是否會因處理而受到影響。結果顯示，肺癌細胞經夏枯草處理後，侵入 24 孔盤的細胞數明顯低於未加藥的控制組(Figure. 13)。但是由於實驗次數不夠多，目前仍未看出任何的顯著差別。. 27.

(32) 討論. 血管新生是維持癌細胞生長以及轉移是一個不可或缺的程序。 MMP-9 與 MMP-2 是細胞降解 ECM 的主要酵素，與血管新生息息相關。癌症患者體內發現 MMP-9 與 MMP-2 的表現量遠高於正常細胞 (Elena and James, 2006)。本論文的目的便是探討中藥處理的肺癌細胞，是否能抑制 MMP-2 及 MMP-9 活性，並進一步評估肺癌細胞的移動以及轉移能力。實驗希望能夠在化學合成物中篩選出可以抑制肝癌細胞 MMP-9 與 MMP-2 活性的藥物。經過實驗後沒有觀察到能夠抑制 MMP 活性的藥物(Table. 1)。由 western blot 實驗結果顯示，以上清液樣本進行分析時，含 10% FBS 的樣本中的血清會對抗體雜合產生相當大的干擾，因此實驗首先確認以較低濃度的 FBS 不會對細胞的生長造成影響後。實驗先採用 2%的 FBS 培養加藥處理中的細胞，再比對發現細胞以藥物處理的實驗結果不受低濃度 FBS 培養的影響。論文目的使用 gelatin zymography 分析夏枯草是否會影響肺癌細胞的 MMP-9 與 MMP-2 活性。由於細胞會分泌至胞外的 MMP-2 以及 MMP-9 降解 ECM，因此實驗是以收集細胞的培養液進行分析。實驗. 28.

(33) 結果顯示，經過鴉膽子與苦參處理後，細胞的 MMP-9 與 MMP-2 活性與控制組相比沒有變化；但是在以夏枯草處理時細胞時，其活性會明顯受到抑制，而且其活性會隨藥物濃度增加而降低。三種細胞中，以 A549 與 H460 的活性下降較顯著。以 10 mg/ml 夏枯草處理 48 小時，其活性會低於約 20%以下，相對於其它兩種細胞，H1299 對於夏枯草較不敏感。最高濃度(10 mg/ml)的夏枯草處理 48 小時後，MMP-9 與 MMP-2 的活性仍維持在 20%以上。接著進行活細胞計數以判斷夏枯草是否會對肺癌細胞具有細胞毒性。實驗結果顯示，在以各個濃度處理 A549(Figure. 4)、H460(Figure. 5)與 H1299(Figure. 6)三種肺癌細胞後，細胞的存活率並沒有因為藥物處理而出現任何的差異。顯示夏枯草於所使用的影響 MMP-9 與 MMP-2 活性測試濃度範圍，不會對細胞產生毒性。顯示夏枯草能抑制細胞的 MMP-9 與 MMP-2 活性，但不會影響細胞存活率。為了要測試夏枯草對於肺癌細胞的移動能力是否能夠有抑制的效果，實驗是以劃上傷痕的細胞，處理不同濃度的夏枯草，觀察其癒合能力(wound-healing assay)。由實驗結果可以看到，細胞的癒合能力，隨夏枯草處理濃度增加而明顯下降，也可以看出在同樣濃度時，夏枯草對這些細胞的移動能力抑制有不同程度的差異。其中以 H460 對夏枯草處理的效果最顯著，H1299 則是較不顯著。. 29.

(34) 細胞培養液樣品中 MMP-9 以及 MMP-2 的表現，可以由 western blot 辨別夏枯草對於 MMP 活性的影響是否酵素表現。結果顯示經過夏枯草處理後，A549(Figure. 10)、H460(Figure. 11)及 H1299(Figure. 12) 的細胞培養液樣品中 MMP-9 與 MMP-2 表現隨夏枯草濃度提升而有不同程度的下降。其中以 H460 最明顯，與 zymograpy 結果附和。以 invasion assay 觀察細胞的侵入能力是否會受到夏枯草處理的影響。結果這三種細胞在經過夏枯草處理後穿過 BME 侵入下層的細胞數明顯降低(Figure.13)，顯示夏枯草處理可以抑制肺癌細胞的侵入能力。由這些結果可以確認，夏枯草在 10 mg/ml 的濃度下，進行處理肺癌細胞，不會讓死亡，同時能抑制 MMP-2 與 MMP-9 的表現，進一步降低轉移與侵犯能力的活性。比較三種細胞株的實驗結果，可以看出夏枯草處理的三種細胞中，對 H460 細胞株的效果最為顯著，而 A549 細胞株與 H1299 細胞株之間則是沒有明顯差異。顯示夏枯草處理所產生的有效抑制細胞轉移的能力，與 p53 的基因型並無顯著關聯。這樣子的結果與肝癌細胞結果不同。過去研究結果顯示，夏枯草處理對於肝癌細胞移動能力的抑制效果，在 wild type p53 的細胞株中較不顯著，原因可能是藥品在肺癌與肝癌細胞中，循不同的路徑達成抑制效果。未來可以對夏枯草抑制癌細胞轉移能力的機轉進行深入探. 30.

(35) 討。未來也可以發展動物模式，在活體中驗證夏枯草抑制腫瘤轉移能力，進一步確認細胞模式的結果。. 31.

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(42) Table. 1 表列 Huh7 細胞株的 MMP-9 與 MMP-2 活性影響的化學合成藥物。藥品編號 YAO-Ram-1-021 YAO-Ram-1-067 YAO-Ram-1-068 YAO-Ram-1-069 YAO-Ram-1-070 YAO-Ram-1-071 YAO-Ram-1-072 YAO-Ram-1-073 YAO-Ram-1-074. Yao-Ram-1-311 YAO-MZ-01-057 YAO-MZ-01-059 YAO-MZ-01-061 YAO-MZ-01-062 Yao-Ram-1-312 Yao-Ram-1-314 Yao-Ram-1-315 YAO-DKB-101. YAO-Ram-1-075 YAO-Ram-1-076 YAO-Ram-1-077. YAO-DKB-102 YAO-DKB-103 YAO-DKB-104. YAO-Ram-1-078 YAO-Ram-1-084 Yao-P-01 Yao-P-02 Yao-P-03 Yao-P-04. YAO-DKB-105 YAO-DKB-107 YAO-DKB-108 YAO-DKB-109 YAO-DKB-111 YAO-DKB-112. Yao-P-05 Yao-P-06 Yao-P-07 Yao-P-08 Yao-P-09 Yao-P-10 Yao-P-11 Yao-P-12 Yao-P-13 Yao-P-14. YAO-DKB-113 YAO-DKB-114 YAO-DJR-1-71 YAO-DJR-1-73 YAO-DJR-1-74 YAO-DJR-1-76 YAO-DJR-1-77 YAO-DJR-1-79 YAO-DJR-1-88 YAO-DJR-1-89s. Yao-Ramesh-B011 Yao-Ramesh-B012 YAO-SAC-01-16B YAO-SAC-01-27A YAO-SAC-01-28A YAO-SAC-01-49B YAO-SAC-01-53B YAO-SAC-01-46A YAO-MZ-01-056. Yao-P-15 KCI Yao-Ram-1-303 KCV Yao-Ram-1-309 KCY Yao-Ram-1-310 Yao-Ramesh-B010 ※實驗以 30μM 濃度處理 Huh7 細胞 24 及 48 小時之後，收集培養上清液進行 gelatin zymography。. 38.

(43) A549 (A) 24 hr. control. 1. 2.5. 48 hr. 5. 10. control. 1. 2.5. 5. 10 (mg/ml). 〉Pro - MMP-9 夏枯草. 夏枯草. ← Active - MMP-9 ← MMP-2. 24 hr. control. 1. 48 hr.. 2.5. 5. control. 1. 2.5. 5. (mg/ml). 〉Pro - MMP-9 鴉膽子. ←Active - MMP-9 ←MMP-2. 24 hr. 10. 20. 48 hr. 10. 20 (mg/ml). 〉Pro - MMP-9 ← Active - MMP-9. 苦參. ← MMP-2. 39.

(44) A549 (B). Figure.1. (A). A549 細胞株以不同濃度的中藥處理 24 小時與 48 小時後的 MMP-2 以及 MMP-9 活性。MMP 的活性可以由膠片染色後，於特定分子量的位置 gelatin 分解後留下的空白色帶亮度估計出來。 (B). 取 gelatin zymography 的結果相片以 FUJI Multi Gauge 將 MMP 作用產生的空白亮帶的亮度進行量化，以 control 的讀取值作為 100%，取三次獨立實驗以 Student’s t-test 進行統計。y 軸代表與 vehicle control 活性百分比。. 40.

(45) H460 (A) 24 hr. 0. 1. 48 hr.. 2.5. 5. 10. 0. 1. 2.5. 5. 10 (mg/ml). 〉Pro - MMP-9 夏枯草. ←Active - MMP-9 ←MMP-2. 24 hr. 0. 1. 48 hr.. 2.5. 5. 0. 1. 2.5. 5. (mg/ml). 〉Pro - MMP-9 鴉膽子. ←Active - MMP-9 ←MMP-2. 24 hr. 10. 48 hr.. 20. 10. 20. (mg/ml). 〉Pro - MMP-9 苦參. ←Active - MMP-9 ←MMP-2. 41.

(46) H460 (B). Figure.2 (A). H460 細胞株以不同濃度的中藥處理 24 小時與 48 小時後的 MMP-2 以及 MMP-9 活性。MMP 的活性可以由膠片染色後，於特定分子量的位置 gelatin 分解後留下的空白色帶亮度估計出來。 (B). 取 gelatin zymography 的結果相片以 FUJI Multi Gauge 將 MMP 作用產生的空白亮帶的亮度進行量化，以 control 的讀取值作為 100%，取三次獨立實驗以 Student’s t-test 進行統計。y 軸代表與 vehicle control 活性百分比。. 42.

(47) H1299 (A) 24 hr. 0. 1. 2.5. 48 hr. 5. 10. 0. 1. 2.5. 5. 10 (mg/ml). 〉Pro - MMP-9 夏枯草. ←Active - MMP-9 ←MMP-2. 24 hr. 0. 1. 48 hr.. 2.5. 5. 0. 1. 2.5. 5. (mg/ml). 〉Pro - MMP-9 ←Active - MMP-9. 鴉膽子. ←MMP-2. 24 hr. 10. 48 hr.. 20. 10. 20 (mg/ml). 〉Pro - MMP-9 苦參. ←Active - MMP-9 ←MMP-2. 43.

(48) H1299 (B). Figure.3. (A). H1299 細胞株以不同濃度的中藥處理 24 小時與 48 小時後的 MMP-2 以及 MMP-9 活性。MMP 的活性可以由膠片染色後，於特定分子量的位置 gelatin 分解後留下的空白色帶亮度估計出來。 (B). 取 gelatin zymography 的結果相片以 FUJI Multi Gauge 將 MMP 作用產生的空白亮帶的亮度進行量化，以 control 的讀取值作為 100%，取三次獨立實驗以 Student’s t-test 進行統計。y 軸代表與 vehicle control 活性百分比。. 44.

(49) Figure. 4. 以夏枯草處理 A549 細胞後進行活細胞計數，收集藥物處理 24 小時以及 48 小時後的細胞以 trypan blue assay 進行活細胞計數，記錄各組別的活細胞數並收集三次獨立實驗的數據以 Student’s t-test 進行統計。. 45.

(50) Figure. 5. 以夏枯草處理 H460 細胞後進行活細胞計數，收集藥物處理 24 小時以及 48 小時後的細胞以 trypan blue assay 進行活細胞計數，記錄各組別的活細胞數並收集三次獨立實驗的數據以 Student’s t-test 進行統計。. 46.

(51) Figure. 6. 以夏枯草處理 H1299 細胞後進行活細胞計數，收集藥物處理 24 小時以及 48 小時後的細胞以 trypan blue assay 進行活細胞計數，記錄各組別的活細胞數並收集三次獨立實驗的數據以 Student’s t-test 進行統計。. 47.

(52) 48.

(53) Figure.7. A549 細胞株以 1 x 106 cells/well 種殖於 12 孔盤中，以 10μl tip 劃下刮痕後加入不同濃度的夏枯草處理，取藥物處理 24、48 及 72 小時後的時間點以顯微鏡觀察並照相 (40X)。 (A) 單次實驗中傷痕的寬度為於圖上傷痕邊緣隨機取三點計算間距之平均值。照片中以黑色箭頭標記傷痕邊緣位置，白色帶標記為 0.5mm。 (B) 於 wound healing assay 中取細胞傷痕邊緣上隨機三點計算傷痕寬，並收集三次獨立實驗結果以 Student’s t-test 進行統計的結果。. 49.

(54) 50.

(55) Figure.8. H460 細胞株以 1 x 106 cells/well 種殖於 12 孔盤中，以 10μl tip 劃下刮痕後加入不同濃度的夏枯草處理，取藥物處理 24 小時、48 小時以及 72 小時後的時間點以顯微鏡觀察並照相(40X)。 (A) 單次實驗中傷痕的寬度為於圖上傷痕邊緣隨機選取三點之平均數值。照片中以黑色箭頭標記傷痕邊緣位置，白色帶標記為 0.5 mm.。 (B) 於 wound healing assay 中取細胞傷痕邊緣上隨機三點計算傷痕寬度，並收集三次獨立實驗的結果以 Student’s t-test 進行統計的結果。. 51.

(56) 52.

(57) Figure.9. H1299 細胞株以 1 x 106 cells/well 種殖於 12 孔盤中，以 10μl tip 劃下刮痕後加入不同濃度的夏枯草處理，取藥物處理 24 小時、48 小時以及 72 小時後的時間點以顯微鏡觀察並照相(40X)。 (A) 單次實驗中傷痕的寬度為於圖上傷痕邊緣隨機選取三點之平均數值。照片中以黑色箭頭標記傷痕邊緣位置，白色帶標記為 0.5 mm.。 (B) 於 wound healing assay 中取細胞傷痕邊緣上隨機三點計算傷痕寬度，並收集三次獨立實驗的結果以 Student’s t-test 進行統計的結果。. 53.

(58) A549 (A) MMP-9 24 hr 0. 1. 48 hr. 2.5. 5. 10. 0. 1. 2.5. 5. 10(mg/ml) ←MMP-9. 100 kDa 75 kDa. (B). MMP-2 24 hr 0. 1. 48 hr 2.5. 5. 10. 0. 1. 2.5. 5. 10 (mg/ml). 100 kDa. ←MMP-2. 75 kDa. Figure. 10. 以夏枯草處理 A549 細胞 24 小時及 48 小時後的上清液樣本進行 western blot。以(A) MMP-9 (1 : 1,000, goat)與(B) MMP-2 (1 : 1,000, rabbit)單株抗體處理 18 小時後以二次抗體(1 : 3,000)處理一小時，加入 ECL Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare)進行顯色。. 54.

(59) H460 (A) MMP-9 24 hr 0. 1. 2.5. 48 hr 5. 10. 0. 1. 2.5. 5. 10 (mg/ml) ←MMP-9. 100 kDa 75 kDa. (B) MMP-2 24 hr 0. 1. 48 hr 2.5. 5. 10. 0. 1. 2.5. 5. 10 (mg/ml). 100 kDa ←MMP-2. 75 kDa. Figure. 11 以夏枯草處理 H460 細胞 24 小時及 48 小時後的上清液樣本進行 western blot。以 MMP-9 (1 : 1,000, goat)與 MMP-9 (1 : 1,000, rabbit) 單株抗體處理 18 小時後以二次抗體(1 : 3,000)處理一小時，加入 ECL Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare)進行顯色。. 55.

(60) H1299. (A) MMP-9 24 hr 0. 1. 48 hr 2.5. 5. 10. 0. 1. 2.5. 5. 10 (mg/ml) ←MMP-9. 100 kDa 75 kDa. (B) MMP-2 24 hr 0. 1. 2.5. 48 hr 5. 10. 0. 1. 2.5. 5. 10 (mg/ml). 100 kDa. ←MMP-2. 75 kDa. Figure. 12. 以夏枯草處理 H1299 細胞 24 小時及 48 小時後的上清液樣本進行 western blot。以 MMP-9 (1 : 1,000, goat)與 MMP-9 (1 : 1,000, rabbit) 單株抗體處理 18 小時後以二次抗體(1 : 3,000)處理一小時，加入 ECL Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare)進行顯色。. 56.

(61) Figure.13 取 A549、H460 及 H1299 以不同濃度的夏枯草處理，進行 invasion assay，讓細胞加藥後於 24 孔盤中的 Transwell 中培養 24 小時後，以 trypan blue assay 計數侵入下層 24 孔盤的細胞。取三次獨立實驗，以 Student’s t-test 進行統計。. 57.

(62) 2. 篩選以細胞自噬去除神經細胞堆積多麩醯胺酸的小分子化合物. 58.

(63) 摘要細胞自噬(autophagy)是細胞一個重要的維持細胞生存的方式。細胞透過這個過程，清除細胞中非必要的物質，以取得胺基酸等營養物質，也避免細胞異常的物質累積。自噬過程中，細胞會將目標物質包覆在雙層膜節構中形成自噬體(autophagosome)，再與溶酶體(lysosome) 融合，降解目標物質，並且回收營養物質和能源。 Polyglutamine (polyQ) disease 是一種在神經性退化症，其主要的病因是在基因中出現 CAG 或 CUG 的重複序列的異常增加。目前已經證明藉由調控自噬作用的藥物在 polyQ disease，如亨丁頓氏症 (Huntington’s disease)小鼠模型可以減輕其毒性，因此增強自噬作用的藥物，可能會是對這種疾病的治療方式。本論文轉殖了結合不同長度 polyQ 的綠色螢光蛋白基因之 SK 細胞株，將穩定的細胞株用各種合成化學物質複合物進行處理之後，使用螢光染色，觀察自噬體是否增加且觀察對細胞存活的影響。本論文初步篩選出了三種能夠誘導細胞自噬增加並減少 polyQ 堆積的小分子化合物。未來研究會再繼續確認細胞自噬對清除細胞 polyQ 堆積的機制。. 59. 關鍵字：細胞自噬、polyglutamine diseases.

(64) Abstract Cells digest unwanted substance by autophagy, a procedure that could reuse building blocks from unwanted substances and clarify poisonous substance. The recycled substrate is covered by lipid bilayer, forming autophagsome that combines lysosome for digestion. Polyglutamine (polyQ) disease is a set of genetic disorder caused by the increased numbers of CAG or CUG repeats in some neurodegenerative diseases. Drugs that induced up-regulation of autophagy have been proved decrease the toxicity of polyQ aggregation in mouse model of Huntington’s disease. Thus, the autophagy-inducing drugs promise to be an effective therapy of polyQ diseases. The thesis used SK cell lines transfected with green fluorescent protein conjugated with different length of polyQ. The purpose is to find out whether the autophagsome can be increased by treatment of different compounds and whether they affect the viabilities of the cells. Three compounds were found capable of inducing cell autophagy and decreasing polyQ aggregration in cell models. In the future, the research will focus on how the selected drugs affect autophagy and test the drugs in animal model.. 60. Keywords：autophagy、polyglutamine diseases.

(65) 緒論文獻評述 Polygutamine (polyQ) disease 是一類十分難以治療的神經性疾病，治療此類疾病的藥物使用卻未見發展。 1. PolyQ disease PolyQ disease 是在特基因中 CAG 重複序列異常的擴增而產生的毒性物質的相關疾病，這類疾病包括亨丁頓氏病(Huntington’s disease) 和其他已知的神經退化性疾病如：帕金森氏病(Parkinson’s disease)、脊髓小腦萎縮症(Spinocerebellar ataxia)與脊髓性肌肉萎縮症(Wang et al., 2008)。在體外研究中，異常擴增 polyQ 的累積可能會導致在幾個方面的毒性影響，包含；轉錄改變(transcriptional alteration)、代謝功能障礙 (Metabolic dysfunction)、蛋白酶功能喪失(Proteasome impairment)、壓力反應異常(stress response adnormalities) (Shao and Diamond, 2007)。. 2. 藥物誘導細胞自噬細胞自噬(Autophagy)，是一個重要的細胞生理反應，細胞會將包含細胞質廢棄物與毒性大分子成分的液泡與溶酶體(lysosome)融合，以降解廢棄物等並回收營養成份，對於細胞來說是一個重要的去污方. 61.

(66) 式(Mizushima et al., 2008)。目前已發現能夠誘導細胞自噬的藥物約有 30 餘種(Sarkar et al., 2009)。. 62.

(67) 研究背景. 1. polyQ disease 的治療 PolyQ disease 可以經由清除異常擴增的 polyQ 以減少對細胞生理的影響。(Shao and Diamond, 2007)。目前研究的方法包括利用 siRNA 阻斷異常 polyQ 複製的蛋白質產生(Harper et al., 2005)，或是利用基因提升特定的出核蛋白(exportin-1)之表現提高，將大於 60Q 的長鏈所導致之聚集蛋白質離開細胞核(Chan et al., 2011)；以及透過增加細胞自噬(autophagy)以清除擴增的 polyQ 蛋白，減少擴增的 polyQ 蛋白的堆積，進一步減少 polyQ disease 的毒性與幫助細胞存活(Sarkar et al., 2009)。在 polyQ 相關疾病的治療上利用 siRNA 的作用區域有侷限，並且無法確定長期阻斷異常增加的 polyQ 相關蛋白表現對細胞的影響；將不正常增加的 polyQ 蛋白移出細胞核的方式雖然可以減少毒性，但無法清除致病蛋白，可能有復發的風險。利用自噬做蛋白質清除的治療法不但能將 polyQ 蛋白質聚集體清除而且細胞仍然能夠維持活性，相當具有潛力(Shao and Diamond, 2007)。目前已經有研究指出利用 Rapamycin 藉由抑制 mTOR 增加自噬作用可以減緩亨丁頓氏症的突變蛋白(Huntingtin, Htt) 在細胞層次的. 63.

(68) 毒性與聚集，並且已經在果蠅與老鼠身上發現可以減緩 Htt 的毒性。同樣效果也可以在脊髓性小腦萎縮症第 3 型(Spinocerebellar ataxia type 3,SCA 3) 的老鼠上也得到驗證(Ravikumar et al., 2004) 。. 64.

(69) 研究目標. PolyQ disease 是許多神經退化性疾病的共同特徵，帶有多餘重複 Q 的蛋白質片段沉積在細胞中，造成細胞毒性的影響而損害人體。本計劃的目的為在 polyQ disease 細胞模式中篩選能夠誘導細胞自噬，清除 polyQ 聚集體並且不具有細胞毒性的小分子化合物，並且找出讓藥物生效的最低濃度。. 65.

(70) 研究問題 PolyQ disease 起始於異常蛋白質片段的沉積，而目前所面對的此類疾病多數發生在人的神經細胞中，施行治療時必需要更慎重考慮治療手段對於人體細胞的影響。若是能夠在不影響細胞存活率的前提下成功利用誘導細胞正常的自噬能力以清除 polyQ 片段，相信有助於減輕治療 polyQ disease 時對細胞產生損傷的風險。論文主要涵蓋內容包括： 1. 利用轉殖並表達致病的 polyQ-EGFP 基因的神經瘤母細胞以未知的小分子化合物進行處理，並以 Flow cytometry 分析細胞，以篩選出能夠誘導細胞自噬增加的藥物。 2. 以活細胞觀測系統觀察細胞，驗證藥物誘發的自噬作用增加是否有助於 polyQ 聚集體移出細胞核以及清除。 3. 以不同濃度的藥物處理細胞，找出讓藥物產生最大療效的起始濃度。. 66.

(71) 材料與方法人類神經瘤母細胞株(SK-N-SH)來自於 American Type Tissue Collection (Rockville, MD)。實驗將不同重複 CAG 序列的 EGPF-polyQ 基因轉殖到 SK-N-SH 並建立成不同長度且穩定的細胞株，本次使用的是帶有 61 個 CAG 重複(Q61)以及 79 個 CAG 重複(Q79)的細胞株。實驗中使用之細胞以加入 10%胎牛血清之 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Invitrogen, Grands Islands, NY)培養，並培養於 37℃及 5%二氧化碳的環境下。細胞於藥物處理前加入 20g/ml 的 doxycycline 處理 96 小時，誘導細胞表現 polyQ-EGFP，96 小時後更換為新的培養基並加藥處理 72 小時，再進行實驗分析。誘導以及加藥處理時改以含 2% FBS 的培養基培養；控制組則是再加入 0.2%的 DMSO。收集細胞時首先清除舊的培養機後以 PBS 清洗兩次，再加入 trypsin-EDTA 靜置 5 分鐘使細胞浮起，以含 10% FBS 之 DMEM 終止 trypsin-EDTA 的作用並沖起細胞收集，以離心機去除含 trypsin-EDTA 之上清液後加入含 2% FBS 之培養基使細胞懸浮。染色用的 lysotracker (Invitrogen)以 1mM 溶於 DMSO 中，保存於 -20℃，染色時以 PBS 稀釋至 50nM；Hoechst (H33342, Sigma)以 DMSO 配製 10 mg/ml 的保存溶液，可於-20℃長期保存，使用時以 DMSO 稀 67.

(72) 釋十倍，可短期保存於 4℃，染色時以 PBS 稀釋至 0.5 μg/ml。小分子化合藥物來自於化學系有機合成實驗室，藥物固體溶於 DMSO 中，保存於 4℃冰箱。. 1. Flow cytometry 收集細胞以 1x104 cells/well 種於 12 孔盤中，同時加入 doxycycline 進行誘導 96 小時，之後置換新的培養液並加入藥物 (西藥濃度為 30 μM) 後繼續於培養箱內進行培養。加入 trypsin-EDTA 收集加藥處理 72 小時後的細胞，離心之後去除含 trypsin-EDTA 之上清液，以 PBS 沖起一次清洗後再次進行離心。去除上清液，加入 1 ml arcridine orange (0.1 mg/ml in ddH2O, 以 PBS 稀釋, AO)，避光進行染色 30 分鐘，再以濾網過濾後送入 FACSCalibur (BD Biosciences)儀器分析。 AO 可以當作對誘導細胞自噬的藥物進行初步篩選的染劑。通常 AO 在受到激發後會發出綠色螢光，進入 lysosome 等酸性環境中受到激發後則會放出紅色螢光，利用這個特性可以讓以 AO 染色後的細胞中 lysosome 增加以紅色螢光增加的型式被觀察到。. 2. 活細胞顯微照相收集細胞以 1x104 cells/well 種入 12 孔盤中，並且加入 doxycycline 進行誘導，放入 37℃培養箱培養 96 小時。之後置換新的培養液並加 68.

(73) 入藥物(西藥濃度：20、30μM)處理 72 小時後加入 AO 或是 lysotracker 加上 Hoechst 染色 30 分鐘後以 PBS 清洗，以活細胞顯微照相系統觀察。當使用螢光顯微鏡觀察時，為了避免 poly-EGFP 受 AO 發出的綠色螢光干擾，因此使用 lysotracker 對 lysosome 進行具專一性的染色，不容易對其它螢光的觀察造成干擾。. 69.

(74) 結果. 1. Flow cytometry 論文使用數種小分子化合物處理 Q61 以及 Q79 細胞株，再進行 AO 染色後，以 flow cytomery 測試亮度變化，利用 AO 進入 lysosome 會激發出紅色螢光的特性，以控制組的紅色螢光讀取值作為基準，與比較藥物處理後所得的紅色螢光讀取值，可以觀察經藥物處理後 lysosome 是否與 autophagosome 結合，判斷藥物是否能夠增加細胞自噬作用。實驗結果顯示，測試過的藥物之中(Table. 2)，只有編號 YAO-Ram-1-021、Yao-Ramesh-A001 以及 Yao-Ramesh-A005 這三種藥物在 20μM 濃度下處理 Q61 (Figure. 1)與 Q79 (Figure. 2)兩種細胞株 72 小時後，其紅色螢光量增加。其中 Q61 經過藥物處理的紅光增加量較 Q79 大，YAO-Ram-1-021 與 Yao-Ramesh-A001 處理後，紅光數量超過背景值。其數值可以由全體的 3%提升至 33%，而 Yao-Ramesh-A005 處理後，可以自 3.77%提升至 27.9%。(Figure. 3). 2. 活細胞顯微照相進一步將藥物處理後的以 AO 染色細胞，以活細胞顯微照相系統. 70.

(75) 觀察細胞中紅光的增加情形。實驗觀察到以 YAO-Ram-1-021 處理後細胞後。紅色螢光顆粒量明顯多於控制組(Figure. 4)。實驗進一步以 Yao-Ramesh-A001 及 Yao-Ramesh-A005 處理後的細胞，以 lysotracker 染色，並且以 Hoechst 對細胞核染色，將觀察到的紅色（lysosome）、綠色（polyQ 聚集體）及藍色（細胞核）螢光照相相片疊合，觀察三者間的位置關係。結果可以看出 Q61 細胞株 (Figure. 5)及 Q79 細胞株(Figure. 6)經過藥物處理後，細胞紅色螢光數量上升， polyQ 聚集體的綠色螢光團塊則移動到細胞核外，且與紅色螢光重疊，顯示 polyQ 聚集體受到藥物誘導，可以進行細胞自噬。. 71.

(76) 討論. 本研究希望能夠找出具有誘導細胞自噬效果的小分子化合物，藉由增加細胞自噬作用，以除去細胞中堆積的 polyQ 蛋白質。實驗以 AO flow cytometry 進行第一步的篩選，以多種化合物處理 Q61 及 Q79 細胞株後，觀察紅色螢光的量。為了避免綠色螢光干擾紅色螢光讀取，排除紅光與綠光皆上升的區域，實驗挑選紅光讀取值上升的區域。結果由多種小分子化合物中篩選出編號 YAO-Ram-1-021、Yao-Ramesh-A001 及 Yao-Ramesh-A005 這三種化合物，這些化合物能夠於 Q61 及 Q79 細胞株中誘導細胞自噬作用(Table. 2)。接著將經 YAO-Ram-1-021 處理的細胞加入 AO 染色後，以活細胞觀測系統觀察，相片中發現，經處理後細胞中的紅光顆粒較控制組增加，顯示經藥物處理後，細胞中的 lysosome 確實增加(Figure. 4)。為了避免 AO 的綠色螢光與 polyQ-EGFP 互相干擾，實驗設計經過 Yao-Ramesh-A001 及 Yao-Ramesh-A005 處理過的細胞，改以 lysotracker 與 Hoechst 對進行染色，並以活細胞觀測系統觀察。結果顯示，藥物處理後，細胞中紅光顆粒的數量與控制組相比明顯增加，與在 AO flow cytometry 中觀察到的結果相符。顯示 polyQ 的聚集在. 72.

(77) 藥物處理後，會移到細胞核外，並與 lysosome 重疊。這顯示 Yao-Ramesh-A001 與 Yao-Ramesh-A005 可以誘導細胞自噬作用，並使細胞將 polyQ 聚集體移出細胞核之後，進行分解。未來需要補足以 YAO-Ram-1-021 處理的細胞，繼續以 lysotracker 與 Hoechst 染色，並以活細胞觀測系統觀察照相的結果。經過本次實驗篩選出 YAO-Ram-1-021、Yao-Ramesh-A001 以及 Yao-Ramesh-A005 這三種小分子化合物，它們都具有能夠誘導細胞自噬作用增加的效果，且不會導致細胞死亡。在以活細胞觀測系統觀察到 Yao-Ramesh-A001 以及 Yao-Ramesh-A005 處理後的細胞，可以將 polyQ 聚集體移出細胞核，並與 lysosome 結合。本來希望未來能夠進一步驗證這三種藥物對於細胞作用的路徑，並且測試藥效的最低濃度，再進一步於動物模式中驗證以這三種藥物如何增加自噬作用，是否可以降低神經細胞 polyQ 聚集體蛋白質的密度。. 73.

(78) 參考文獻 Chan WM, Tsoi H, Wu CC, Wong CH, Cheng TC, Li HY, Lau KF, Shaw PC, Perrimon N, Chan HY (2011) Expanded polyglutamine domain possesses nuclear export activity which modulates subcellular localization and toxicity of polyQ disease protein via exportin-1. Hum Mol Genet 20:1738-1750. Harper SQ, Staber PD, He X, Eliason SL, Martins IH, Mao Q, Yang L, Kotin RM, Paulson HL, Davidson BL (2005) RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A 102:5820-5825. Menzies FM, Huebener J, Renna M, Bonin M, Riess O, Rubinsztein DC (2010) Autophagy induction reduces mutant ataxin-3 levels and toxicity in a mouse model of spinocerebellar ataxia type 3. Brain 133:93-104. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, Klionsky DJ (2008) Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature 451:1069-1075. Ravikumar B, Vacher C, Berger Z, Davies JE, Luo S, Oroz LG, Scaravilli F, Easton DF, Duden R, O'Kane CJ, Rubinsztein DC (2004) Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nat Genet 36:585-595. Sarkar S, Ravikumar B, Floto RA, Rubinsztein DC (2009) Rapamycin and mTOR-independent autophagy inducers ameliorate toxicity of polyglutamine-expanded huntingtin and related proteinopathies. Cell Death Differ 16:46-56. Shao J, Diamond MI (2007) Polyglutamine diseases: emerging concepts in pathogenesis and therapy. Hum Mol Genet 16 Spec No. 2:R115-123. Wang CE, Zhou H, McGuire JR, Cerullo V, Lee B, Li SH, Li XJ (2008) Suppression of neuropil aggregates and neurological symptoms by an intracellular antibody implicates the cytoplasmic toxicity of mutant huntingtin. J Cell Biol 181:803-816.. 74.

(79) Table. 1 以藥物分別處理 Q61 與 Q79 細胞株 72 小時後進行 AO 流式細胞儀分析得到的結果。標記的數值則為紅色螢光讀取值超過背景值的比例(參照 Figure. 1, Figure. 2, Figure. 3)。”─”標記為藥物處理後紅色螢光讀取值與控制組無明顯差異。細胞株. polyQ61-EGFP. polyQ79-EGFP. YAO-Ram-1-0021. 35.55%. 30.33%. YAO-Ram-1-0072. ─. ─. YAO-Ram-1-0073. ─. ─. YAO-Ram-1-0078. ─. ─. Yao-P-03. ─. ─. Yao-Ramesh-A001. 38.36%. 26.94%. ─. ─. Yao-Ramesh-A003. ─. ─. Yao-Ramesh-A004. ─. ─. Yao-Ramesh-A005. 37.75%. 17.98%. Yao-Ramesh-A006. ─. ─. Yao-Ramesh-B008. ─. ─. Yao-Ramesh-B009. ─. ─. Yao-Ramesh-B010. ─. ─. 藥物編號. Yao-Ramesh-A002. 75.