除了上述與細胞週期和細胞凋亡相關的蛋白質外，我們也透過西
方墨點法檢測其他與存活相關的蛋白質和其他可能影響的路徑。有研 究顯示在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）
與血小板生長因子受體（platelet-deerived growth factor receptor, PDGFR）
變異與GBM 的發病有關，因此 PI3K/Akt 與 MAPK/Erk 作為 EGFR 的 下游兩大訊號路徑，成為我們檢測的目標。SE 藥物作用濃度為 80 μg/mL，
FE 藥物作用濃度為 0.6 μg/mL，neriifolin 藥物作用濃度為 0.05 與 0.1 μg/mL。由實驗結果顯示，經 SE 藥物作用的 U373-derived tumorsphere 的Akt 磷酸化比例下降，Erk 磷酸化比例則沒有明顯變化（圖 II-5A）。 經FE 藥物作用的組別，Erk 磷酸化比例沒有明顯變化（圖 II-5B）。經
neriifolin 作用的組別，Akt 磷酸化的比例則顯著降低（圖 II-5C）。
從先前的實驗中我們觀察到 3 種藥物能有效抑制 tumorsphere 的生
長，因此我們檢測癌幹細胞標記 Sox2 及 HIF-2a（Hypoxia-Inducible Factor 2-Alpha）在給予藥物 72 小時後的表現量是否受到影響。實驗結 果顯示，經SE 及 FE 作用後 tumorsphere 的幹細胞標記 Sox2 表現量有 下降的趨勢（圖II-5A, B）。經neriifolin 作用後 tumorsphere 幹細胞的標 記HIF-2α 表現量顯著下降（圖 II-5C）。
此外，先前實驗中我們已知neriifolin 會使 U373-derived tumorsphere
遷移能力降低，因為TRIP6 在 GBM 當中有過度表現的現象，而 TRIP6 調控細胞分裂、移動及抗細胞凋亡等多種路徑，與GBM 的侵襲能力有 關[29]。根據文獻及實驗室其他研究顯示，TRIP6 在 GBM 細胞中會與 IFIT5 共同作用，IFIT5 作為抗病毒 IFIT 家族中的成員，也有部分研究
指出其家族在對抗病毒過程中會牽涉到細胞增值、遷移、訊號傳遞與病 毒複製[34, 35]。因此我們透過西方墨點法檢測 TRIP6 與 IFIT5 經 neriifolin 作用後在 tumorsphere 中的表現量。隨著藥物濃度上升，TRIP6
蛋白質表現量有下降的趨勢，而IFIT5 的蛋白質表現量也明顯下降（圖 II-5-C），在 U251- derived tumorsphere 經 neriifolin 作用 72 小時候也有 相似的情形（圖II-5D）。
II-4 討論
多型性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiform, GBM）是成人腦瘤
中最常見的一種惡性腫瘤，本次實驗使用U251-MG 及 U373-MG 細胞 株，並以工業研究院提供的海檬果莖（stem extract, SE）與果實（fruit extract, FE）的酒精萃取物，及兩者共同有效成分（neriifolin）作為本次 研究的實驗藥物。探討海檬果萃取物與 neriifolin 對 GBM 及其類癌幹 細胞影響。
透過實驗室先前及本次的研究，我們得知 3 種藥物會抑制 U373-MG 及 tumorsphere 的細胞生長（表 II-1, 圖 II-1A）。比較 U373-U373-MG 經 SE、FE 與 neriifolin 作用後細胞存活分析，SE 的IC50為46.18±6.8 μg/mL，
FE 的IC50為3.11±0.28 μg/mL，neriifolin 的IC50為0.04±0.003 μg/mL。由 此可知，neriifolin 單獨藥物給予對 U373-MG 有更好的抑制生長效果。
比較3 種藥物對 U373-MG 與 tumorsphere 的IC50，發現SE 及 neriifolin 對U373-MG 有較高的細胞毒性，而 FE 則相反（表 II-1）。這樣的結果 即表示，當 neriifolin 針對癌幹細胞治療時，一般癌細胞同時也會受到 嚴重的損害，減緩癌細胞增殖的速度。同時我們檢測 tumorsphere 經 neriifolin 作 用 後 的 增 生 能 力 ， 發 現 10 ng/mL neriifolin 即 可 使 tumorsphere 的增生能力受到抑制（圖 II-1B-D）。此外，我們發現
U373-derived tumorsphere 經 SE、FE 及 neriifolin 分別給予後，CDK4 與 cyclin E 的表現量降低，因此推測 3 種藥物可能透過降低細胞內的 CDK4 與 cyclin E 表現量造成細胞週期 G1 時期停滯（圖 II-3），進而使細胞無法
增生。同時，細胞內部凋亡相關蛋白質也被激活（圖II-4F），pro-caspase 8 與 PARP 因被切割而使其表現量下降，表示細胞凋亡的進行，並且透 過Annexin V-PI 雙染技術分析得到一樣的結果（圖 II-4D）。
有研究指出在 GBM 當中 EGFR 及 VEGFR 會過度表現與過度活 化，因此我們研究 SE、FE 與 neriifolin 是否會影響此兩個受體下游的 傳遞路徑PI3K/Akt 與 MAPK/Erk。結果顯示，SE 與 FE 並未對 Erk 磷 酸化有顯著性的影響，但 SE 與 neriifolin 能有效抑制 Akt 的活化（圖 II-5A-C）。此結果表示 neriifolin 透過抑制 Akt 的活化阻斷其下游基因 表達，進而阻止細胞生長、生殖等細胞活動。同時也發現會被Akt/Erk 激活的幹細胞的標記 Sox2 在經過 SE 與 FE 藥物作用後表現量有降低 的趨勢。而另一個會透過 mTORC2（mammalian target of rapamycin complex 2）活化的癌幹細胞的生物標記 HIF-2α 在 neriifolin 作用後表 現量也被抑制。mTORC2 與 Akt 皆會受到 PI3K 的活化而激活，因此我 們推測SE、FE 與 neriifolin 可能透過抑制 PI3K/Akt 路徑來破壞癌幹細 胞的維持與致瘤性，使癌幹細胞生長受到抑制。由於SE 與 FE 內含有
neriifolin 的成分，因此我們推論 neriifolin 會藉由抑制 PI3K/Akt 路徑的
活化影響細胞生長、存活和癌幹細胞的維持，並透過切割caspase 8 與 PARP 促使細胞凋亡。
除此之外，我們從實驗中也發現，SE、FE 與 neriifolin 會抑制 U373-SC 及 U373-derived tumorsphere 的遷移能力（圖 II-2）。在實驗前期透
過 不 含 有 血 清 的 培 養 液 及 含 有 血 清 並 加 入 抑 制 癌 細 胞 增 生 的 mitomycin C 進行比較，發現不含有血清的組別因缺乏養分而不利於細 胞進行移動。因此我們使用2 mg/mL mitomycin C 抑制細胞增生又不至 於毒殺細胞。透過傷口癒合實驗（圖2A-D）及細胞遷移實驗（圖 II-2E, F）檢視，發現相較於抑制 U373-SC 的遷移能力，neriifolin 能更有 效地抑制 tumorsphere 的遷移能力。已知 TRIP6 在 GBM 中過度表現，
且TRIP6 與 Ras 家族蛋白質調控的細胞移動有關，會透過 Fas/CD95 激 活 PI3K/Akt 路徑，誘導細胞抗凋亡及細胞侵襲[82]。此外，也有人發 現IFIT 家族作為抗病毒的干擾素誘導蛋白，在對抗病毒感染時也會促 使細胞的遷移與增殖[83]。從研究中我們也發現此 3 種藥物會抑制細胞 的移動，因此我們透過西方墨點法檢視此 2 種蛋白質是否會受藥物影 響。從結果可知TRIP6 與 IFIT5 在藥物給予後表現量都下降（圖 II-5C）， 由於TRIP6 是促進細胞遷移的蛋白質，所以 TRIP6 表現量下降可能是
細胞遷移能力被抑制的原因。而 IFIT5 在實驗室的其他研究中顯示其 可能會抑制癌細胞的爬行能力，因此該蛋白質在此呈現的結果還需要 透過其他訊息路徑的表現來探討。
綜合所述，neriifolin 在細胞內的作用並非是單一途徑，而是同時透 過不同的訊號傳遞路徑達到毒殺細胞、抑制生長與抑制遷移的效果。這 樣的結果讓人期望 neriifolin 在實際應用上能獲得更好的回響。從實驗 室 蔡 瑞 真 學 姐 透 過 高 效 液 相 層 析 法 （ high performance liquid chromatography, HPLC）得到的結果顯示 FE 內所含的 neriifolin 劑量 SE 多，但從實驗結果上來說 FE 的結果呈現並非完全向 neriifolin 的結果 靠攏，因此猜測SE 與 FE 中還有其他輔助或抑制 neriifolin 效果的內容 物。也因為如此SE 與 FE 作用機制會比單純使用 neriifolin 來得複雜，
後續的機制研究中並未加討論。
圖表
圖I-1、IFIT5 與 TRIP6 與 actin 在細胞內有共聚集的現象
U373-MG 細胞各別過度表達 GFP/mCherry, GFP/mCherry-IFIT5, GFP-TRIP6/mCherry 與 GFP-TRIP6/mCherry-IFIT5。利用共軛焦顯微鏡記錄細胞 中F-actin、TRIP6 與 IFIT5 的相對位置。G-TRIP6、m-IFIT5 與 actin 在 細胞膜及細胞延伸之板足有共同表達的現象。比例尺為10 μm。
圖I-2、透過免疫共沉澱檢視 TRIP6 與 IFIT5 交互作用
（A）利用結合 anti-FLAG 的 agarose beads 與外源的 F-IFIT5 結合並與
其他結合蛋白質共沉澱，透過 anti-GFP 與 anti-FLAG 檢視外源性 G-TRIP6 與 F-IFIT5 共沉澱。（B）利用結合 anti-G-TRIP6 的磁珠與外源的 G-TRIP6 結合並與其他結合蛋白質共沉澱，透過 IFIT5 與 TRIP6 檢視外源性 G-TRIP6 與 F-IFIT5 共沉澱。（C）利用結合 anti-TRIP6 的磁珠與內源性 anti-TRIP6 結合，並透過 anti-anti-TRIP6 與 anti-IFIT5 檢 視在U87-MG 中 TRIP6 與 IFIT5 共沉澱。
圖I-3、共軛焦螢光顯微鏡拍攝活細胞即時影像與分析
（A）U373-MG 細胞各別過度表達 GFP/mCherry, GFP/mCherry-IFIT5, GFP-TRIP6/mCherry 與 TRIP6/mCherry-IFIT5。利用共軛焦顯微鏡記錄 受LPA 刺激後細胞的動態變化影像。比例尺為 50 μm。（B）細胞開始 長出泡足的時間比較。GFP-mIFIT5 組別相較於 GFP-mCherry 組別有延 遲的現象。（C）四種組別細胞泡足產生至消失的時間差比較並無明顯 差異。（D）四種組別平均時間差產生泡足數量比較。*：p<0.05， ***：
p<0.005
圖I-4、TRIP6 與 IFIT5 RNA 在 GBM 中的表達與其影響
（A）TRIP6 在 GBM 不同亞群中的 RNA 表達（Normal, n = 88; Classical, n = 43; Mesenchymal, n = 93; Proneural, n = 85; Neural, n = 15）。相較於 normal 的組別 Pronural 組別中 TRIP6 的表現量顯著下降（B）IFIT5 在
GBM 檢體與正常組織中 RNA 的表現量沒有明顯差異。（C）IFIT5 在 GBM 不同亞群中的 RNA 表達（Normal, n = 88; Classical, n = 43;
Mesenchymal, n = 93; Proneural, n = 85; Neural, n = 15）。四個亞群與 normal 組別之間都沒有顯著差異。（D）TRIP6 RNA 在 GBM 中高表現
（前 25%）相較於低表現（後 25%）有降低患者存活率的趨勢。（E）
IFIT5 RNA 在 GBM 中高表現（前 50%）相較於低表現（後 50%）顯著 提高患者存活率。*：p<0.05
表II-1、U373-MG、U373-tumorsphere 及 U251-MG 之𝐈𝐂𝟓𝟎
Drug 𝐈𝐂𝟓𝟎（μg/mL）
Stem extract
U373-MG 46.18 ± 6.8
U373 tumosphere 80.09 ± 2.73 Fruit
extract
U373-MG 3.11 ± 0.28
U373 tumosphere 0.67 ± 0.1 Neriifolin U373-MG
0.04 ± 0.003
U373 tumosphere 1.68 ± 0.48
U251 tumorsphere 0.39 ± 0.03
圖II-1、SE、FE 與 neriifolin 抑制 U373-MG 及其類癌幹細胞的生 長
（A）U373-MG 的細胞存活率隨著 neriifolin 藥物濃度升高而降低。（B）
U373-derived tumorsphere 經過 neriifolin 不同濃度培養，四週後 sphere 在每個視野下平均顆數。比例尺為25 μm。（C）U373-derived tumorsphere 經過neriifolin 不同濃度培養，四週後 sphere 生長大小。（D）U373-derived tumorsphere 經過 neriifolin 不同濃度培養，四週後 sphere 面積在 300
μm2以上與整體數量的比例。*：p<0.05，***：p<0.005
圖II-2、SE、FE 與 neriifolin 抑制 U373-MG 及其類癌幹細胞的遷 移
（A）U373-MG 經給予 SE 與（B）FE 藥物的傷口癒合實驗，持續觀察 72 小時的影像顯示，隨著藥物濃度升高，傷口癒合程度下降。 （C）U373-MG 經給予 SE 與（D）FE 藥物的傷口癒合實驗，爬行能力量化分析發 現隨著藥物濃度升高，細胞爬行能力下降。（E）U373-derived tumosphere
經neriifolin 作用後細胞遷移能力下降。比例尺長度為 50 μm。 （F）U373-derived tumosphere 經 SE、FE 與 neriifolin 作用，細胞遷移能力量化分 析後，發現加藥組別的細胞遷移能力都顯著下降。*：p<0.05， ***：
p<0.005
圖II-3、SE、FE 與 neriifolin 影響類癌幹細胞的細胞週期
U373-derived tumorsphere 經過（A）SE（5 μg/mL）、（B）FE（0.05 μg/mL）
與（C）neriifolin（0.01 μg/mL）藥物作用後有細胞週期 G1 phase 停滯
的趨勢。圖A 到圖 C 使用同一個對照組。U373-derived tumorsphere 經 過（D）SE 藥物作用 CDK4 表現量下降；（E）經 FE 藥物作用後，CDK4 與cyclin E 表現量下降；（F）經 neriifolin 藥物作用後，CDK4 表現量下 降，cyclin E 的表現量有下降的趨勢。
圖II-4、SE、FE 與 neriifolin 促使 U373-derived tumorsphere 進 行細胞凋亡
U373-derived tumorsphere 提高（A）SE（40 μg/mL）、（B）FE（0.3 μg/mL）
與（C）neriifolin（0.14 μg/mL）藥物作用濃度後 sub-G1 細胞比例上升。
（D）U373-derived tumorsphere 經過 neriifolin 0.35 μg/mL 或 0.7 μg/mL
作 用 後 ，positive-Annexin V 的 細 胞 比 例 提 高 。（ E ） U373-derived tumorsphere 經 neriifolin 作用後，在 10,000 顆細胞中正常細胞的比例下
作 用 後 ，positive-Annexin V 的 細 胞 比 例 提 高 。（ E ） U373-derived tumorsphere 經 neriifolin 作用後，在 10,000 顆細胞中正常細胞的比例下