1. 探討TRIP6與IFIT5在神經膠質母細胞瘤中的交互作用 / 2. 海檬果萃取物對神經膠質母細胞瘤及其癌幹細胞的影響

全文

(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. I. 探討 TRIP6 與 IFIT5 在神經膠質母細胞瘤中的交互作用 II. 海檬果萃取物對神經膠質母細胞瘤及其類癌幹細胞的影響 I.. The role of the TRIP6 and IFIT5 interaction in glioblastoma cells. II.. The effect of Cerbera manghas L. extracts on glioblastoma and its stemloids. 研究生：劉文善 Wen-Shan Liu. 指導教授：賴韻如博士 Yun-Ju Lai. 中華民國 107 年 8 月.

(2) 致謝時光飛逝，回首進入師大的這三年，充實的課程與具有挑戰性的研究讓我的研究生生涯更加豐富。雖然這一千多個日子裡總是與到瓶頸與困難，但有賴於指導教授與實驗室夥伴們的陪伴和關懷，我才能一步步完成我的碩士學位。由衷的感謝我的指導教授賴韻如副教授，因為您時時刻刻的關懷、包容與不厭其煩地指導，讓我不斷地改進我的實驗，並且給予我非常多的機會學習許多的研究方法及貴重儀器。此外，也要感謝謝嘉玲副教授與廖憶純副教授願意擔任我的口試委員，並給予我許多建議，提供我實驗邏輯上的正確觀念。除此之外，我非常感謝實驗室夥伴們，因為你們的關心、包容與陪伴填滿我每一個因實驗成功而歡喜，因實驗失敗而失落的日子。特別感謝瑞真學姐、孟蒔學姐、丹玉學姐在我實驗遇到困難時能夠給予我許多的建議和幫助，和我一起討論解決方法。另外，也要感謝林榮耀教授實驗室的學長們（玄原學長、賀培學長、喬偉學長），C206 實驗室的瑞真學姐、孟蒔學姐、丹玉學姐、盈婷、信益、芷彤、栩茵、幗瑛、宜翔與茂峻在實驗上的幫助與心靈上陪伴。讓我在遇到困難或無法突破的困境時仍然可以努力不懈，勇敢地繼續走下去。最後，感謝我的家人們在我唸書的這段時間給予我極大的生活空間，讓我無後顧之憂地完成我的學業。. i.

(3) 目錄致謝.................................................................................................................................................... I 目錄................................................................................................................................................... II 縮寫表（ABBREVIATIONS）............................................................................................................... V I.. 探討 TRIP6 與 IFIT5 在神經膠質母細胞瘤中的交互作用......................................................... VII. 摘要................................................................................................................................................. VII ABSTRACT ..................................................................................................................................... IX I-1 緒論 ............................................................................................................................................ 1 I-1.1 神經膠質瘤（GLIOMA） ............................................................................................................. 1 I-1.2 溶血磷脂酸（LYSOPHOSPHATIDIC ACID, LPA） .................................................................. 4 I-1.3 甲狀腺素受體作用蛋白質 6（TYROID RECEPTOR INTERACTING PROTEIN 6, TRIP6） ..... 5 I-1.4 干擾素誘導四肽重複蛋白質 5 （INTERFERON INDUCED PROTEINS WITH TETRATRICOPEPTIDE REPEATS 5, IFIT5） ....................................................................................... 7 I-2 研究材料與方法 .......................................................................................................................... 8 I-2.1 細胞培養（CELL CULTURE） .................................................................................................. 8 I-2.2 質體大量備製（MAXI-PREP）................................................................................................. 9 I-2.3 免疫共沉澱（CO-IMMUNOPRECIPITATION, CO-IP） ........................................................... 10 I-2.4 活細胞顯微影像（LIVE CELL TIME-LAPSE IMAGES） ........................................................ 12 I-2.5 螢光蛋白質共表現（FLUORESCENCE PROTEINS COLOCALIZATION） ................................................ 13 I-2.6 臨床資料庫分析（CLINICAL DATA ANALYSIS） ................................................................... 13 I-3 研究結果 ....................................................................................................................................14 I-3.1 IFIT5 與 TRIP6 和 F-ACTIN 共同表現 .................................................................................. 14 I-3.2 IFIT5 與 TRIP6 之間存在交互作用 ...................................................................................... 15 I-3.3 過度表現 TRIP6 與 IFIT5 會影響 LPA 促進的細胞移動 ................................................... 16 I-3.4 TIRP6 與 IFIT5 在 GBM 的臨床表現分析........................................................................... 17 I-4 討論 ...........................................................................................................................................18 II.. 海檬果萃取物對神經膠質母細胞瘤及其癌幹細胞的影響 ......................................................... I. 摘要.................................................................................................................................................... I ABSTRACT ...................................................................................................................................... II II-1 緒論 ..........................................................................................................................................21. ii.

(4) II-1.1 多型性神經膠母細胞瘤（GLIOBLASTOMA MULTIFORM, GBM） ..................................... 21 II-1.2 癌幹細胞理論（CANCER STEM CELL, CSC） ..................................................................... 21 II-1.3 海檬果（CERBERA MANGHAS L.） ...................................................................................... 23 II-2 研究材料與方法 .......................................................................................................................25 II-2.1 植物萃取物（CHINESE HERBAL EXTRAXTS）................................................................... 25 II-2.2 細胞培養（CELL CULTURE） ............................................................................................. 25 II-2.3 細胞株建立（ESTABLISHMENT OF CELL LINE）.................................................................. 26 II-2.4 細胞存活分析（MTT ASSAY, CELL VIABILITY ASSAY） .................................................. 27 II-2.5 聚落形成分析（COLONY FORMATION ASSAY） ................................................................ 28 II-2.6 細胞刮傷實驗（WOUND HEALING ASSAY） ..................................................................... 29 II-2.7 細胞遷移實驗（CELL TRANSWELL MIGRATION ASSAY）.................................................. 29 II-2.8 細胞週期分析（CELL CYCLE ASSAY） .............................................................................. 30 II-2.9 細胞凋亡雙染分析（ANNEXIN V-PI APOPTOSIS ASSAY） ......................................................... 31 II-2.10 西方墨點法（WESTERN BLOT） ....................................................................................... 31 II-2.11 統計方法（STATISTIC）...................................................................................................... 33 II-3 研究結果 ..................................................................................................................................34 II-3.1 海檬果萃取物有效降低 U373-MG 及其類癌幹細胞（TUMORSPHERE）的存活 ............. 34 II-3.2 NERIIFOLIN 降低 U373-TUMOSPHERE 形成聚落的能力 ...................................................... 35 II-3.3 海檬果萃取物與 NERIIFOLIN 可抑制 U373 及其類癌幹細胞遷移能力 ............................. 35 II-3.4 海檬果萃取物與 NERIIFOLIN 造成 U373-DERIVED TUMORSPHERE 細胞週期的影響 ....... 37 II-3.5 海檬果萃取物與 NERIIFOLIN 造成 U373-DERIVED TUMORSPHERE 細胞凋亡 ................... 39 II-3.6 海檬果萃取物與 NERIIFOLIN 影響細胞內訊息路徑 ........................................................... 41 II-4 討論 ..........................................................................................................................................43 圖表..................................................................................................................................................47 圖 I-1、IFIT5 與 TRIP6 與 ACTIN 在細胞內有共聚集的現象 ..................................................... 47 圖 I-2、透過免疫共沉澱檢視 TRIP6 與 IFIT5 交互作用 ............................................................ 48 圖 I-3、共軛焦螢光顯微鏡拍攝活細胞即時影像與分析 .............................................................. 49 圖 I-4、TRIP6 與 IFIT5 RNA 在 GBM 中的表達與其影響 ........................................................ 51 表 II-1、U373-MG、U373-TUMORSPHERE 及 U251-MG 之𝐈𝐂𝟓𝟎 ............................................... 53 圖 II-1、SE、FE 與 NERIIFOLIN 抑制 U373-MG 及其類癌幹細胞的生長 ................................. 54 圖 II-2、SE、FE 與 NERIIFOLIN 抑制 U373-MG 及其類癌幹細胞的遷移 ................................. 55 圖 II-3、SE、FE 與 NERIIFOLIN 影響類癌幹細胞的細胞週期 .................................................... 57 圖 II-4、SE、FE 與 NERIIFOLIN 促使 U373-DERIVED TUMORSPHERE 進行細胞凋亡 ................ 58 圖 II-5、SE、FE 與 NERIIFOLIN 影響 U373 與 U251-DERIVED TUMORSPHERES 的訊息傳遞路徑60. iii.

(5) 文獻參考 ..........................................................................................................................................62. iv.

(6) 縮寫表（Abbreviations）縮寫 AACR Akt ANOVA ATCG2 BBB Bcl-2 b-FGF bmp CDK2 CDK4 Co-IP CT DMEM DMSO EDTA EGF EGFR EGTA Erk FADD FAK FBS FE FITC GABRA1 GAPDH GBM GEO GRIP1 GSC HIF-2α. 全名 American Association for Cancer Research protein kinase B Analysis of variance ATP-binding cassette sub-family G member 2 Blood-brain barrier B-cell lymphoma 2 Fibroblast growth factor-basic Bone morphogenetic protein Cyclin dependent kinase 2 Cyclin dependent kinase 4 Co-Immunoprecipitation Computed tomography Dulbecco's Modified Eagle Medium Dimethyl sulfoxide Ethylenediaminetetraacetic acid Epidermal growth factor Epidermal growth factor receptor Ethylene glycol tetraacetic acid The extracellular-signal-regulated kinase Fas-associated death domain protein Focal adhesion kinase Fetal Bovine Serum Fruit extract Fluorescein isothiocyanate Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Alpha1 Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase Glioblastoma multiform Gene Expression Omnibus Glutamate receptor-interacting protein 1 Glioblastoma stem cell Hypoxia-inducible factor 2-alpha. v.

(7) IC50 ICC IFIT5 JNK LPA LPP MRI mRNA NEFL NF-κB OCT4 PARP PDGFR PI PI3K PIC-1 PIC-2 PMSF PS RB SDS SDS-PAGE SE Sox2 SPSS TCGA TRIP6 VEGF WHO. Half maximal inhibitory concentration Immunocytochemistry Interferon induced proteins with tetratricopeptide repeats 5 c-Jun N-terminal kinases Lysophosphatidic acid Lipoma preferred partner Magnetic resonance imaging Messenger RNA Neurofilament Light Polypeptide Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells Octamer-binding transcription factor 4 Poly ADP-ribose polymerase Platelet-deerived growth factor receptor Propidium Iodide Phosphatidylinositol 3-kinase Protease inhibitor cocktail-1 Protease inhibitor cocktail-2 Phenylmethane sulfonyl fluoride Phosphatidylserine Retinoblastoma Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Stem extract Sex Determining Region Y-Box 2 Statistical Product and Service Solution The Cancer Genome Atlas Tyroid receptor interacting protein 6 Vascular endothelial growth factor World Health Organization. vi.

(8) I. 探討 TRIP6 與 IFIT5 在神經膠質母細胞瘤中的交互作用摘要甲狀腺素受體作用蛋白質（tyroid receptor interacting protein 6, TRIP6）作為溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA）受體下游的影響目標，會調節細胞肌動蛋白質（actin），進一步影響細胞移動及細胞內部多重訊號傳遞。TRIP6 目前已知在多型性神經膠質母細胞瘤（glioblastoma, GBM）有過度表現的現象，可能與 GBM 高度侵襲性有關。干擾素誘導四肽重複蛋白質 5（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 5, IFIT5）為干擾誘導蛋白質家族的一員，參與人體先天性免疫反應。但有學者發現有部份獨立的 IFIT5 會與肌動蛋白質連結並表現在細胞膜上，可能與調控細胞移動有關。我們檢測 IFIT5 在多型性膠質母細胞瘤（glioblastoma, GBM）細胞中是否參與 TRIP6 調控的細胞遷移與腫瘤形成。本研究透過免疫共沉澱證實 TIPR6 與 IFIT5 在細胞中的確存在交互作用，並利用活細胞顯微影像追蹤兩者對細胞遷移的影響。我們發現 IFIT5 本身並不會增加細胞泡足的產生，但會增進 TRIP6 造成的細胞動態變化。. 關鍵字：甲狀腺素受體作用蛋白質、干擾素誘導四肽重複蛋白質、多型. vii.

(9) 性神經膠質母細胞瘤、細胞遷移. viii.

(10) Abstract Thyroid receptor interacting protein 6（TRIP6）is a downstream signaling molecule of lysophosphatidic acid（LPA）receptor. It enhances activation of signaling molecules regulating actin to induce cell migration, division and proliferation. TRIP6 is overexpressed in glioblastoma multiform（GBM） and may be a characteristic of aggressiveness of GBM. Interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 5（IFIT5）is a member in interferon induced protein family, and involves in the regulation of human innate immune response. It has been reported that IFIT5 interaction with actin on the cell cortex, and may involve in the regulation of cell migration. To examine whether IFIT5 plays a role in the TRIP6 regulated cell migration and glioblastoma tumorigenesis, we investigated the interaction of these two proteins. Here, we demonstrated the interaction of IFIT5 and TRIP6 in cells by co-immunoprecipitation. Moreover, we elucidated the effect of these two proteins on cell migration by live cell imaging, and found that IFIT-5 itself does not enhance the cell blebbing, but promotes TRIP6-mediated cell dynamics.. Keywords: TRIP6, IFIT5, glioblastoma, cell migration. ix.

(11) I-1 緒論 I-1.1 神經膠質瘤（glioma）腦腫瘤根據發生來源可區分為原發性腦瘤與轉移性腦瘤（次發性腦瘤）。原發性腦瘤即由腦部組織神經膠細胞或非神經膠細胞變異所形成的腫瘤。其中以神經膠細胞所形成的神經膠質瘤（glioma）較為常見，佔所有腦瘤七成以上，且較為惡性[1]。根據報告顯示，環境致癌物和飲食都會提高神經膠質瘤的罹患風險[1]。神經膠質瘤根據變異的細胞來源不同又可分為星狀細胞瘤（astrocytoma）、寡樹突膠質瘤（oligodendroglioma）及室管膜瘤（ependymoma）三種。而轉移性腦瘤則是由身體其他部位腫瘤轉移至腦部所形成的腫瘤，其中以肺癌及乳癌轉移居多[2]。在臨床表現上因為腫瘤形成區域不同而造成多種病症，包含頭痛、嘔吐、抽蓄、視力銳減、行為困難、意識改變等[3, 4]。目前治療神經膠質瘤的方式依病情程度以手術切除為主，再接受放射性治療或化學藥物治療[2, 5]。然而血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）限制了藥物傳遞，導致腦部無法準確接受藥物治療。因此血腦屏障是腦瘤治療藥物必須克服的重要關卡之一[6, 7]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）或血小板衍生生長因子受體 1.

(12) （platelet-derived growth factor receptors, PDGFR）是常見的標靶藥物目標，但因為通過BBB的能力不佳，在臨床試驗上治療效果並不顯著[2, 8]。在動物模式中發現無論是哪一種腦瘤都必定伴隨著血管新生的現象，且這樣的現象會提高腫瘤轉移的風險，因此血管生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的抑制劑已是被臨床治療接受的藥物 [9]。隨著我們對癌症越來越了解，研發藥物治療與提早防禦就更有幫助。多形性神經膠母細胞瘤（glioblastoma multiform, GBM）依照惡性程度被世界衛生組織（World Health Organization, WHO）歸類為第四級星狀細胞瘤（grade IV astrocytoma），是最常見的一種惡性腦瘤，約占膠質瘤的65% [1, 10]。GBM具有高度侵潤性及復發率，且通常伴隨大量不正常的血管新生、快速的細胞複製、對藥物有耐藥性及壞死組織 [11]。多形性神經膠母細胞瘤大部分屬於原發性腦瘤，好發年紀大約在 50歲以上的老年人且男性罹患比例較女性高。在診斷出病症後，接受治療的患者平均壽命約15個月，只有少數的患者能存活超過三年以上，其不佳的預後與患者年紀也有關係[12-14]。目前主要以核磁共振造影（magnetic resonance imaging, MRI）或是電腦斷層攝影（computed tomography, CT）進行初步評斷，也可進一步透過腫瘤組織切片檢查作. 2.

(13) 為治療的依據。GBM主要治療方式包刮手術切除、放射性治療、化學藥物治療、皮質甾類療法、抗血管生成等[5]，醫生會依據病人的生理狀況、腫瘤位置、大小而有不同的策略。耐藥性及復發機率高一直都是 GBM治療難以突破的困境，使得GBM的治療效果仍不佳，但對GBM發展機制及訊號路徑的了解，有助於做為未來治療研究的基礎。癌症基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）研究人員已確立，在GBM當中依照拷貝數變異、基因組特徵、患者存活時間、患者年齡和治療反應定義出四種多型性神經膠質母細胞瘤的亞型，分別為典型（classical）、神經前驅型（proneural）、間質型（mesenchymal）及神經型（neural）[5]。 Classical GBM的特徵為高達50%的患者EGFR的過度表現，但在 GBM患者中普遍變異的抑癌基因PT53在classical GBM當中卻沒有突變 [15]。此外，也發現神經幹細胞的標記nestin與Notch和Sonic hedgehog路徑在classical GBM5中高度表達[15]。而Proneural GBM則與classical GBM相反，在該亞型中TP53顯著突變，且IDH1（isocitrate dehydrogenase 1）也是最常突變的基因[15]。另外，proneural GBM當中發現PDGFRA 是僅在該亞型中突變的基因[15]。IDH1突變時會導致細胞異常生長，而 PDGFRA突變時會產生過多的蛋白質導致細胞生長失控。該亞型有別. 3.

(14) 於其他三個亞型，其患者平均年齡較為年輕，且存活時間也較長。但接受治療的proneural GBM患者相較於未接受治療的患者並沒有較長的存活時間[15]。而Mesenchymal GBM中NF1（Neurofibromatosis type I）、 PTEN（Phosphatase and tensin homolog）與TP5突變率最高，其中以NF1 （Neurofibromatosis type I）突變，PTEN（Phosphatase and tensin homolog）與TP53也在該亞型中頻繁出現突變[15]。不同於proneural GBM的患者，該亞型的病患接受治療後有較好的反應。Neural GBM中存在著其他三個亞型囊括的突變基因，而不同的是在該亞型中某些表達的基因在正常腦組織與神經細胞中也會表達，例如：NEFL（Neurofilament）、 GABRA1（Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Alpha1）、SYT1 （Synaptotagmin 1）及SLC12A5（Potassium-chloride transporter member 5）。就患者平均年齡而言，Neural GBM患者的年齡層最大，雖然對於治療也有改善的反應，卻不及於mesenchymal及classical GBM的患者效果好[15]。 I-1.2 溶血磷脂酸（Lysophosphatidic Acid, LPA）溶血磷脂酸（Lysophosphatidic Acid, LPA）是一種在脊椎動物與非脊椎動物中都能發現的生物激活生長因子類磷脂，其介導許多生物反應，包含生物體發育及病理生理的影響[16]。LPA 透過與 LPA2 受體結. 4.

(15) 合後活化 Rho 與 Rac 相互激活及下游相關因子誘導肌動蛋白質（actin）細胞骨架重組，焦點複合物的組合和焦點連接的形成，以影響細胞的黏附力及細胞移動。焦點複合物組合包括焦點連接激酶（focal adhesion kinase, FAK）、Src 家族激酶、paxillin 和 p130cas （Crk-associated substrate） [17, 18]。這些蛋白質複合物下游訊號分子包含 c-Jun 氨基末端激酶（cJun N-terminal kinases, JNK）、蛋白質激酶 B（protein kinase B, Akt）、細胞外訊號調節激酶（ The extracellular-signal-regulated kinase, Erk）等，會促使細胞分裂、細胞遷移及細胞存活[19]。目前有研究指出，經 LPA 刺激後 LPA2 受體的羧基末端會與黏附分子 TRIP6（tyroid receptor interacting protein 6）/ ZRP-1（zyxin-related protein）的 LIM 結構域接合，並活化 TRIP6 使其組成焦點複合物，進一步影響肌動蛋白質促進細胞遷移[18, 20]。此外，許多研究表示 LPA 所介導的生物活性有助於腫瘤的形成，因此有部分學者認為 LPA 合成抑制劑及 LPA 受體拮抗劑能做為癌症治療的希望藥物[21, 22]。 I-1.3 甲狀腺素受體作用蛋白質 6（Tyroid Receptor Interacting Protein 6, TRIP6） TRIP6 也稱為 ZRP-1（TRIP6/zyxin –related protein），是屬於 zyxin 家族的一種焦點斑（focal adhesion）分子，也是一種銜接蛋白質[18]。. 5.

(16) Zyxin 家族的其他成員－zyxin、斑聯蛋白質（lipoma preferred partner, LPP）和 Ajuba，它們的結構具有在胺基端（N-terminus）的一個脯胺酸富含區（proline-rich region）及核輸出訊號（nuclear export signals）與在碳基端（C-terminus）的三個鋅手指 LIM 結合域（Zinc finger LIM domains）[18, 23-25]。LIM 結合域是蛋白質之間交互作用重要的結構，其協助蛋白質參與包含細胞骨架重組、焦點斑的組合與拆解、細胞遷移與侵襲、抗細胞凋亡等等重要生物過程[20, 26]。Zyxin 家族成員皆位於焦點連接上，但也有許多會穿梭於細胞膜與細胞核之間來引發不同的訊號，並且有研究指出 Zyxin 和 TRIP6 與 Cas 家族（Crk-Associated Substrate protein family）的p130𝑐𝑎𝑠（Breast cancer anti-estrogen resistance protein 1, BCAR1）、CasL /HEF1/NEDD9（Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 9）合作調節細胞遷移[18, 27, 28]。 TRIP6 有兩個重要的磷酸化位點，分別是 Tyrosine-55 與 proline58，此二位點與 TRIP6 和 CrK 與 p130 的結合有關。當 Tyrosine-55 無法磷酸化後雖然不會影響 TRIP6 焦點連接及與肌動蛋白質（actin）的共定位能力，卻使 TRIP6 與 CrK 與 p130 的結合消失，並降低活化 NFκB（nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells）、Erk （ extracellular signal–regulated kinases ）和磷脂酰肌醇激酶. 6.

(17) （phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）輔助調節因子的能力[18]。此外，在 GBM 當中也發現 TRIP6 的過度表達，因此 TRIP6 可能透過 NF-κB 促進 GBM 的侵襲作用[29]。我們先前研究指出 TRIP6 表現在有表現 Sox2 的哺乳類神經幹細胞中，且 TRIP6 會活化 Notch 的訊號路徑促使神經幹細胞自我更新[30]。這樣的證據指示 TRIP6 是個 stemness 的基因，且似乎扮演著調控神經幹細胞特性的重要關鍵。 I-1.4 干擾素誘導四肽重複蛋白質 5 （Interferon Induced Proteins with Tetratricopeptide Repeats 5, IFIT5） IFIT5（ISG58）是 IFIT 家族中的一員，其他包含 IFIT1（ISG56）、 IFIT2（ISG54）、IFIT3（ISG60），是干擾素刺激基因（Interferon-stimulated gene, ISG）的轉譯蛋白質家族。有趣的是在哺乳類細胞中大多都具有 IFIT1、IFIT2、IFIT3 和 IFIT5，但在低等動物中卻未發現 IFIT 家族成員[31]。由此可推測，在生物演化上 IFIT 家族有其特殊的意義。該家族成員主要功能在於透過辨認病毒特殊的 mRNA（messenger RNA），並與這些 RNA 結合以抑制蛋白質轉譯，且無論是 RNA 或 DNA 病毒都能誘導 IFIT 家族的表現[32]。目前研究指出 IFIT 家族主要由第一型及第三型干擾素誘導，並受模式識別（pattern recognition）及 JAK/STAT. 7.

(18) （Janus kinase/signal transducer and activator of transcription）訊號調節 [31, 33]。由於 JAK/STAT 下游路徑包含細胞死亡、細胞分裂與細胞遷移[34] ，因此有人認為 IFIT 家族可能參與這些細胞活動[35]。例如： IFIT2 在口腔癌中發現藉由影響細胞角蛋白質（cytokeratins）和波形蛋白質（vimentin）來抑制細胞遷移的功能，且高度表達的 IFIT2 患者存活率較高[36]。IFIT5 則被發現參與 NFκB 路徑，會加強 IKKβ （IκB kinase beta）與 TAK1（Transforming growth factor beta activated kinase-1 ）的結合，促使 IκBα（inhibitor of kappa B）的降解及 p65 順利進核，進行轉錄[37]。此外，也有研究發現 IFIT5 在頂端細胞表面（the apical cell surface）結構中與 actin 共同表現，且這些 IFIT5 並不受 IFN-β 影響，甚至在失去與 RNA 結合的結構下也不會失去和 actin 結合功能[38]。由上述文獻探討可知，IFIT5 與 TRIP6 都參與調控細胞骨架，且影響 NFκB 路徑的活化。為了進一步了解此二蛋白質是否會有相互作用並一起調控細胞訊息。本實驗使用 GBM 細胞株 U373-MG 與 U87-MG 作為實驗模式，檢測 TRIP6 與 IFIT5 之間的作用以及對細胞功能的影響。. I-2 研究材料與方法 I-2.1 細胞培養（Cell Culture） 8.

(19) 本研究使用 U373-MG 人類多型性神經膠母細胞瘤細胞株及 HEK293T 人類腎臟上皮細胞株，以含 10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS, I-NQ-A6806, NQBB）及 1% 青黴素與鏈黴素（penicillin and streptomycin, 15140-122, Gibco）的 Dulbecco's Modified Eagle Medium （DMEM）/High Glucose（31600034, Gibco）培養液培養於 5%二氧化碳（CO2）、37℃環境中。 I-2.2 質體大量備製（Maxi-prep）將需要轉殖的質體 DNA 轉入大腸桿菌（DH-5α）中，並在培養基（2.5% Lysogeny broth, 1.5% Agra A, 30 μg/mL kanamycin）上於 37℃環境中培養 16 小時。點取培養基上的單一菌落於 200 mL 含 30 μg/mL kanamycin 培養液（2.5% LB）中，於 37℃、250 rpm 培養 16 小時（overnight）。隔日將 200 mL 菌液加入 1L 含 30 μg/mL kanamycin 培養夜中，於 37℃、250 rpm 培養 8 小時，加入 6 mL chloramphenicol （34 mg/ml）於相同條件下培養 16 小時（overnight）。隔日以 4℃、6000 g 條件離心 20 分鐘，利用質體萃取組（QIAGEN Plasmid Maxi, 12163）中的試劑將沉澱物回溶，經過過濾、去除雜質後利用 QF 緩衝液析出 DNA 並加入 isopropanol 使 DNA 沉澱，於 4℃靜置 16 小時（overnight）。隔日以 15,000 g、4℃離心 30 分鐘。去除上清液，再以 70%酒精使沉澱物. 9.

(20) 脫水，以相同條件離心，去除上清液，保留沉澱物並在抽風櫃中陰乾。將陰乾後的沉澱物溶於二次水中並保存於 4℃，待隔日檢測抽取質體含量後將質體保存於-20℃（質體萃取方法參考 QIAGEN Plasmid Maxi Kit 操作流程）。本實驗所使用的質體有：pCMV-EGFP（GFP）, pCMV-EGFPTRIP6（G-TRIP6）, pcDNA3.1（pcDNA）, pCMV-FLAF（FLAG）, pcDNA3x FLAG-IFIT5（F-IFIT5） , pCMV-mCherry（mCherry）及 pCMV-mCherryIFIT5（m-IFIT5）共六種。 I-2.3 免疫共沉澱（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）將 HEK293T 種植於 10 公分培養盤中，待細胞貼附完全並達到八分滿後利用化學轉染技術將質體（GFP, G-TRIP6, FLAG, F-IFIT5）送入細胞中。質體分為四組：GFP（3 μg）與 pcDNA（17 μg）、G-TRIP6（10 μg）與 pcDNA（10 μg）、GFP（3 μg, 另含 7 μg pcDNA）與 F-IFIT5（10 μg）、G-TRIP6（10 μg）與 F-IFIT5（10 μg）。隔日檢視細胞轉染效率及細胞型態後，將細胞移除培養液並以 PBS 搖晃清洗 2 次，再利用 TGH 裂解液（TGH working buffer）將細胞收集於微量離心管中（1.5 mL eppendorfs），並使其作用完全。TGH 裂解液由 50 mL TGH buffer（0.95% Triton X-100, 10% glycerol, 50mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM EGTA, 1mM EDTA, pH8 ）外加 0.1 g sodium fluoride 與 0.2 g sodium pyrophosphate 配製，在使用前每 1 mL 加入 1 μL PIC-I（protease inhibitor. 10.

(21) cocktail-1, 包含 0.1% leupeptin, 0.1% antipain, 1% benzamidine）、1 μL PIC-II （ proteinase inhibitor cocktail-2, 包含 0.1% chymostatin, 0.1% pepstatin）、1 μL PMSF（phenylmethane sulfonyl fluoride）、1 μL Na3 VO4 （S6508, Sigma）。反應完成後，將樣品以 13,300 rpm、20 min、4℃離心，取上清液利用蛋白質測定組（BCA protein assay kit, #23225, Thermo Scientific Pierce）進行蛋白質定量分析。我們使用 2 mg 細胞萃取液進行免疫共沉澱（IP 組別），加入與 anti-FLAG 抗體結合的瓊酯糖珠（agarose beads）作用 16 小時，使其能與樣品中的 F-IFIT5 結合。利用磁珠（protein G）與 IgG 的 Fc 特異性結合的特點，在 2 mg 樣品中加入 anti-TRIP6（2W2C612255, BD biosciences）免疫沉澱 HEK-293T 細胞中的 GFP-TRIP6，或加入 anti-IgG（SC-2025, Santa Cruz Biotechnology）與磁珠作為負向對照組。另外準備 50 μg 的細胞萃取液（Lysate 組）為 loading control。利用西方墨點法分析，以抗體 anti-GFP、anti-FLAG 或 anti-TRIP6（GTX111504, Gene Tex）與 anti-IFIT5（PTT-13378-1-AP, Proteintech）偵測目標蛋白質。內源性的免疫共沉澱則是利用磁珠（protein G）與 IgG 的 Fc 特異性結合的特點，在 2 mg 樣品中加入 anti-TRIP6（2W2C612255, BD biosciences）免疫沉澱 U373-MG 細胞中的 TRIP6，或加入 anti-IgG（SC-. 11.

(22) 2025, Santa Cruz Biotechnology）與磁珠作為負向對照組。另外以 50 μg 的細胞萃取液（Lysate 組）為 loading control，再利用西方墨點法分析分別使用抗體 anti-IFIT5（PTT-13378-1-AP, Proteintech）與 anti-TRIP6 （GTX111504, Gene Tex）檢測目標蛋白質。 I-2.4 活細胞顯微影像（Live Cell Time-lapse Images）將培養於 10 公分培養盤的 U373-MG 以 25% trypsin-EDTA （25200072, Gibco）作用後，計數細胞以 PBS 回溶配成1 × 107 cells/mL 的濃度。取 200 μL 細胞液加入質體（3 μg GFP 或 15 μg G-TRIP6 搭配 10 μg mCherry 或 15 μg m-IFIT5）並於 1.5 mL 微量離心管中混勻。將含質體細胞液放入電穿孔專用管中（Electroporation Cuvette, 4mm），設定電穿孔儀器（ECM 830, BTX）的條件為 160 V，5 ms/次，共電 3 次，每次間隔 100 ms。將電完的細胞放入 3.5 公分玻璃底盤（P35GC-0-14C, MatTek）中，加入 2mL 10% FBS DMEM 培養於 5%二氧化碳（CO2）、 37 培養箱中。隔天利用螢光顯微鏡（DMI3000 B, Leica Biosystems）檢測細胞螢光亮度後，移除培養液及懸浮細胞，以 1% BSA 清洗兩次，再加入 1 mL 含 1% 1M HEPES 無酚紅培養液（ Phenol red free, DMEM/F12），透過共軛焦顯微鏡系統（LSM-880, Zeiss）攝影。在拍攝前加入 1 μL 2 mM LPA，設定每 20 秒拍攝一次，共計 30 分鐘。. 12.

(23) I-2.5 螢光蛋白質共表現（Fluorescence proteins colocalization）將 U373-MG 細胞株進行電穿孔（實驗條件如同活細胞顯微影像），並將轉入同樣質體細胞分別放於 2 個 3.5 公分玻璃底盤（D35-20-1.5-N, Cellvis）中，加入 2mL 10% FBS DMEM 培養於 5%二氧化碳（CO2）、. 37 培養箱中。待隔日細胞貼盤，其中一組加入 2 mM LPA 作用 10 分鐘後，再將所有組別經 PBS 清洗 2 次，以 3%甲醛固定細胞，加入 0.2% Triton X-100（AT1260-0500, Bionuvas）作用 10 分鐘，使細胞穿孔，經 PBS 清洗 3 次，加入含有 1 X Alexa fluor 350 phalloidin（A22281, Thermo）的 PBS，避光作用 1 小時。經 PBS 清洗 3 次，利用共軛焦顯微鏡系統（LSM-880, Zeiss）進行影像拍攝。. I-2.6 臨床資料庫分析（Clinical Data Analysis）本研究中利用清華大學建立的 Cancer RNA-Seq Nexus 數據庫，分析 IFIT5 與 TRIP6 在 GBM 中與正常組織中的表現差異。該數據庫包含 TCGA（The Cancer Genome Atlas）及 GEO（Gene Expression Omnibus） /SRA（Sequence Read Archive）的數據集，共有 54 種人類癌症，11,030 個樣本[39]。並透過 OncoLnc[40]進行 IFIT5 與 TRIP6 與患者存活率的. 13.

(24) 分析 TCGA 資料庫收集各種重大癌症病患組織資料，是目前較為完整的巨型資料庫。OncoLnc 包含來自 TCGA 的 21 種癌症研究的 8,647 名病患的生存數據，以及 TCGA 的 mRNA 與 miRNA 的 RNA-SEQ 表達數據，另外還有 MiTranscriptome beta 的 lncRNA 表達數據[40]。. I-3 研究結果 I-3.1 IFIT5 與 TRIP6 和 F-actin 共同表現從 TRIP6 與 IFIT5 各別文獻中，我們知道此二蛋白質皆與 actin 有交互作用。TRIP6 在 LPA 的刺激下會與 actin 作用調控細胞的移動[29]。而 IFIT5 則是在肺細胞中發現與病毒雙股 RNA 結合蛋白質 RIG1（RNAbinding retinoic acid-inducible gene-I）共同表現在頂端細胞表層 actin 富含區中，該研究認為 IFIT5 可能藉由調節 actin 影響細胞中 tRNA 作用並與其結合[38]。由於 IFIT5 與 actin 的作用機制尚不明確，我們透過將 U373-MG 共同過度表現 GFP-TRIP6（G-TRIP6）與 mCherry-IFIT5 （m-IFIT5），檢視在 GBM 細胞中 IFIT5 是否也與 TRIP6 及 actin 共同表現。由結果圖可以看到，對照組的 F-actin（藍色）集中在細胞膜，而 GFP 與 mCherry 則散布在細胞中。單獨過度表達 m-IFIT5 的組別中， m-IFIT5（紅色）僅散布於細胞質中。在細胞延伸出去的板狀偽足（lamellipodia）上能看到 F-actin 與 mCherry-IFIT5 有重疊的現象（圖 14.

(25) I-1）。過度表現 G-TRIP6 的組別中，G-TRIP6（綠色）散布於細胞質中，並在細胞膜 actin 集結區域共同表現，在細胞延伸的板足也有相同的現象（圖 I-1）。在共同過表達的組別中，可看到 G-TRIP6 與 m-IFIT5 皆在細胞質中散布，在細胞延伸的偽足及邊際可看到此二蛋白質與 actin 共同表現（圖 I-1）。 I-3.2 IFIT5 與 TRIP6 之間存在交互作用已知在 GBM 中 TRIP6 表達有顯著增加，且有研究顯示 IFIT5 與 TRIP6 在細胞中皆會調控 NF-κB 路徑[18, 37]。因此我們檢測此二種蛋白質在細胞中是否有交互作用。利用化學轉染將 GFP-TRIP6 與 FLAGIFIT5 質體轉染入 HEK293T 細胞株中，以免疫共沉澱方法檢測 TRIP6 是否與 IFIT5 共沉澱。如結果所示，anti-GFP 在 Lysate 組中分別偵測到過度表現的 G-TRIP6 與 GFP（G-TRIP6 的 negative control）。在 IP 組中 anti-GFP 偵測到過度表現 G-TRIP6 與 F-IFIT5 組別的 G-TRIP6。同時也可看到 anti-FLAG 在 Lysate 與 IP 組別偵測到過度表現的 F-IFIT5，這表示外源性的 G-TRIP6 與 F-IFIT5 有相互作用的現象（圖 I-2A）。此外，我們反向操作利用與 anti-TRIP6 抗體 Fc 結合的磁珠檢測 IFIT5 是否會與 TRIP6 共沉澱，並得到相同的結果（圖 I-2B）。為了證明 TRIP6 與 IFIT5 在 GBM 細胞株中確實有交互作用的現. 15.

(26) 象，我們使用與 anti-TRIP6 抗體 Fc 結合的磁珠檢測 U87-MG 細胞株內源性的 IFIT5 與 TRIP6 是否有交互作用的現象。從結果可看到，加入 anti-TRIP6 的組別可偵測到細胞株中的 TRIP6，並且顯示 IFIT5 與 TRIP6 共沉澱現象。雖然在內源性的 IFIT5 表現量並不多，但仍然會與 TRIP6 做結合（圖 I-2B）。這也證明在 GBM 細胞株當中 TRIP6 與 IFIT5 存在交互作用的關係。 I-3.3 過度表現 TRIP6 與 IFIT5 會影響 LPA 促進的細胞移動已知 TRIP6 會被 LPA 活化，進而促進 GBM 細胞的移動[18]，且 IFIT5 在細胞質中有少部分的蛋白質會與肌動蛋白結合[38]。因此我們希望透過活細胞即時影像拍攝，了解 IFIT5 與 TRIP6 的結合是否會影響 TRIP6 介導的細胞移動。如結果所示，從影像中雖未見細胞遷移現象，但可看到細胞接受 LPA 刺激後產生的動態變化（圖 I-3A）。單獨過度表達 TRIP6（TR6-mC）與共同過度表達 TRIP6 與 IFIT5（TR6-I5）的組別相較對照組（GFP-mC）在接受 LPA 刺激後細胞反應並未有明顯差異，表示 IFIT5 並不會影響 TRIP6 對 LPA 刺激的敏感度。而單獨過度表現 IFIT5（GFP-I5）的組別細胞反應時間則明顯延長（圖 I-3B）。透過計算影像中細胞形成泡足（blebs）[41, 42]至消失的時間差（週期）進行分析，我們發現四組泡足形成至消失的時間並未有明顯差異，大多. 16.

(27) 落在 20 至 140 秒之間（圖 I-3C）。進一步，將 40 分鐘內各組別細胞所產生的泡足累積數量除以平均週期（泡足產生的頻率），我們發現共同過度表達此二蛋白質的組別其產生泡足的頻率明顯高於其他三組（圖 I-3D）。因此，我們推測 IFIT5 本身不會影響 LPA 誘發之細胞移動，但會促進 TRIP6 調節細胞型態變化的能力。 I-3.4 TIRP6 與 IFIT5 在 GBM 的臨床表現分析由上述實驗我們推論 TRIP6 與 IFIT5 在 GBM 細胞株中存在交互作用的關係，因此我們進一步利用網路平台分析在 GBM 臨床檢體中 TRIP6 與 IFIT5 的表現量與疾病相關性。已知 TRIP6 在大多數患者檢體（n = 156）中相較於正常組織（n = 5）有過度表達的現象[29, 43]。我們利用網路平台 Cancer RNA-Seq Nexus 搜索 GEO/SRA 資料庫，分析不同亞群間 TRIP6 在 GBM 與正常組織間表現量的比較。GBM 的 4 個亞群分別為典型（ classical ）、神經前驅型（proneural）、間質型（mesenchymal）及神經型（neural）。歸納統計後發現，TRIP6 在 proneural 與 neural 表現量有降低的趨勢，但四個亞型間並沒有顯著性的差異。相較於 normal 的組別，pronural 組別的 TRIP6 表現量顯著降低（圖 I4A）此外，我們透過 Cancer RNA-Seq Nexus 搜索 TCGA 資料庫，發現 IFIT5 在正常組織與 GBM 檢體的表達並沒有顯著差異（圖 I-4B），進. 17.

(28) 一步分析不同亞群間的 GBM 與正常組織間的比較。從資料分析發現四種亞型中的 IFIT5 的表現量在 mesenchymal GBM（n = 93）組別較高，但未達顯差（圖 I-4C）而四種亞型中 mesenchyal 與 classical 的組別有少部分檢體表現量高於 mormal 組別，但平均表現量相較於正常組織並未有顯著差異（圖 I-4C）。另外，我們也利用 OncoLnc 搜尋 TCGA 資料庫中特定基因表達的患者存活率。我們將表達程度區分為前 25%（Q1）與後 25%（Q3），TRIP6 高表現相較於低表現的組別有降低患者的存活率的趨勢（p-value = 0.163）（圖 I-4D）。我們將 IFIT5 表現程度分為前 50%與後 50%時，結果顯示，高表現的 GBM 患者比低表現的 GBM 患者生存時間更長（p-value = 0.0027）（圖 I-4E）。. I-4 討論雖然多型性膠質母細胞瘤目前並未看到轉移到其他區域的病例，但對周圍正常組織的侵襲力非常強，因此了解 GBM 的遷移及侵襲能力是對治療 GBM 有幫助的。TRIP6 已有多篇研究顯示，該蛋白質與 Rho 家族和 Cas 家族誘導的細胞移動有關[18, 27]，並有研究指出 TRIP6 與 GRIP1 共同調節 actin 以改變樹突型態[44]。此外，有文獻提出 IFIT 家族成員在對抗病毒感染時會促進細胞的遷移[35, 36]，並在肺細胞中發現 IFIT5 與 actin 共同表現的證據。因此，我們想要了解 IFIT5 之於 GBM 18.

(29) 以及 TRIP6 是否扮演著與抗病毒無關的角色。藉由電穿孔讓神經膠質母細胞瘤 U373-MG 過度表現 GFP-TRIP6（G-TRIP6）與 mCherry-IFIT5 （m-IFIT5）蛋白質，並觀察此二蛋白質與經 phalloidin 染色的 actin 位置關係。從實驗結果中可以看到 G-TRIP6 與 m-IFIT5 皆會表現在細胞膜 actin 的區域，並且兩者與 actin 部分重疊。因此推測 TRIP6 與 IFIT5 可能會共同調節 actin。為了證明上述推測，我們透過免疫共沉澱檢視 IFIT5 與 TRIP6 的交互作用關係。利用化學轉染將 GFP-TRIP6 （G-TRIP6）與 FLAG-IFIT5（F-IFIT5）轉入 HEK-293T 中，以免疫共沉澱法驗證 IFIT5 與 TRIP6 的確具有交互作用關係（圖 I-2A, B）。此外，我們透過內源性免疫共沉澱法進一步證實兩者在 GBM 中的交互作用（圖 I-2C）。由於已知 TRIP6 會影響 GBM 的遷移及侵襲，因此我們猜測 IFIT5 與 TRIP6 的結合可能會影響 TRIP6 促進的細胞遷移功能。從活細胞影像中我們雖然沒有看見細胞爬行的現象，但可觀察到細胞的動態變化。我們發現單獨過表現 mCherry-IFIT5（GFP/mC-IFIT5）的細胞對於 LPA 刺激產生反應的時間相較於對照組（GFP-mCherry）有延遲的現象（圖 I-3）。此外，我們將細胞接受 LPA 刺激後 40 分鐘內的動態變化進行紀錄並分析細胞形成泡足至消失的時間差（週期），我們發現四組之間並未有明顯差異。但當我們將各組別 40 分鐘內細胞產. 19.

(30) 生的總泡足數量除以各自的平均週期（泡泡產生的頻率）後，我們發現相較於其他三組對照組別，共同過表達 G-TRIP6 與 m-IFIT5（GTRIP6/m-IFIT5）的組別產生泡足的頻率明顯較高。因此，我們推測 IFIT5 雖不會增強細胞受 LPA 刺激的敏感度，但可能會協助 TRIP6 調節 actin 而影響細胞型態變化。從我們藉由網路平台分析 TCGA 資料庫收集到的資料顯示，TRIP6 與 IFIT5 在 GBM 中的表現程度是截然不同的（圖 I-4A,-C）。TRIP6 過度表現在 GBM 的細胞中，誘導細胞進行遷移、侵襲、抗細胞凋亡等生理活動[18, 27, 29]，而從臨床表現分析中 TRIP6 表現量較高的 GBM 患者存活率有較低的趨勢（圖 I-4D）。反之，在 GBM 細胞中 IFIT5 表現量與正常組織並無明顯差異，但 IFIT5 表現量較高的 GBM 患者其存活率顯著升高（圖 I-4E）。雖然此結果似乎與前述實驗得到的結論相牴觸，但由於我們目前並未研究此二蛋白質之間的作用機制，因此無法定論 TRIP6 與 IFIT5 真實關係。未來我們可以利用 IFN-α/β 誘導細胞自行產生更多的 IFIT5，進一步探討 IFIT5 與 TRIP6 在 GBM 細胞中所扮演的角色。. 20.

(31) II. 海檬果萃取物對神經膠質母細胞瘤及其癌幹細胞的影響摘要多型性神經膠質母細胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM）是成人原發性腦癌中最常見的惡性腦瘤，被世界衛生組織（WHO）歸列為第四級神經膠質瘤。其具有高度侵潤性與異質性，對傳統化療及放射療法皆有抗性，因此許多病患在術後仍有很高的機率再復發，其存活率不超過 14 個月。部分學者認為，癌症復發與抗藥性可能與癌細胞中少部分的癌幹細胞有關，因此針對癌幹細胞作為治療策略亦是一重要方法。現今有諸多研究嘗試從植物中萃取成分，這些成分具有抗發炎、抗病蟲害或抗癌症之功能，進而研發出更多相似結構分子作為治療疾病的藥物。本文研究發現海檬果萃取物及 neriifolin 會抑制細胞生長及細胞遷移，並造成細胞週期停滯與細胞凋亡的發生。我們進一步探討 neriifolin 對神經膠質母細胞瘤類癌幹細胞的訊息路徑，發現 neriifolin 主要透過抑制 Akt 路徑活化而使細胞生長能力降低並抑制神經膠質母細胞瘤癌幹細胞的維持。關鍵字：多型性神經膠質母細胞瘤、多型性神經膠質母細胞瘤癌幹細胞、細胞遷移、細胞週期、細胞凋亡. i.

(32) Abstract Glioblastoma multiforme （GBM）, classified as the grade IV astrocytoma, is the most common malignant brain cancer in adult. GBM possess the characters of invasiveness, heterogeneity and resistance to chemical and radiation therapy. The GBM patients have poor prognosis, the median survival of the patients is about 14 months. Some studies have showed that the glioblastoma stem cells（GSCs）, a small population of cells, may play the critical role in cancer relapse. Therefore, targeting GSCs is one of the potential therapeutic strategies for GBM. Recent researches studied the plant extracts and found the anti-inflammatory, anti-virus and anti-cancer activity of compositions in the plants. These components can be developed further to other structurally similar molecules for treatment of diseases. In this study, we detection that two extracts and neriifolin inhibited viability and movement of GBM cells and GSCs, and induced cell cycle arrest and apoptosis of GSCs. Stimulation of GSCs with neriifolin inhibited activity of Akt pathway to reduce cell viability and maintain of GSCs.. Key worlds : glioblastoma multiform, glioblastoma stem cells, cell migration, cell cycle, apoptosis. ii.

(33) II-1 緒論 II-1.1 多型性神經膠母細胞瘤（Glioblastoma multiform, GBM）多形性神經膠母細胞瘤（Glioblastoma multiform, GBM）依照惡性程度被世界衛生組織（World Health Organization, WHO）歸類為第四級星狀細胞瘤（grade IV astrocytoma），是最常見的一種惡性腦瘤，約占膠質瘤的65% [1, 10]。GBM具有高度侵潤性及復發率，且通常伴隨大量不正常的血管新生、快速的細胞複製、對藥物有耐藥性及壞死組織 [11]。研究顯示VEGFR與PDGFR透過活化PI3K/Akt路徑促進癌細胞生長，因此被認為可能是GBM的治療標靶，但由於血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）的通透性屏障，導致部分的藥物無法準確進入腫瘤區域，而降低治療成效[11]。此外，在GBM當中pRB、Ras蛋白的突變[45, 46]， PI3K/Akt、EGFR、STAT3過度活化都是常見的現象[11, 47, 48]。有趣的是，目前有研究顯示GBM當中含有神經前軀細胞（neural precursors），而這些細胞具有神經幹細胞的特性，並且被認為與腫瘤的生長、復發有關[49]。這項發現開啟了對GBM的治療新策略。 II-1.2 癌幹細胞理論（Cancer stem cell, CSC）現今癌症治療方式多元，藥物選擇多樣，但對於癌症的治療與控制. 21.

(34) 卻不如預期。近 20 年來，部分癌症研究學者提出一種概念，稱為「癌幹細胞理論」（Cancer Stem Cell theory）。該理論認為在腫瘤當中有一小部分（~ 1%）的側群細胞擁有如幹細胞般自我更新（self-renew）及不對稱複製（asymmetric division）的特性，並且與腫瘤的維持和常規治療的抗藥性有關，稱為癌幹細胞（cancer stem cells, CSC）[50, 51]。目前癌幹細胞已經在各種癌症當中被發現，例如：白血病、肺癌、乳癌、腦癌、大腸癌、前列腺癌等等. [52-56]。關於癌幹細胞的起源並沒有特定. 的說法，有些人認為是原有的幹細胞癌化而來[57]，而有部分學者認為癌幹細胞可能從已分化的癌細胞去分化而形成[51, 58]。多篇研究表示， CSC 在腫瘤當中處於休眠的階段，以較低的頻率進行細胞增生，因此可以躲過針對過度繁殖的細胞治療策略，最後造成殘存的癌幹細胞在生長回腫瘤。這說明為何接受治療的患者在多年後腫瘤復發[59]。由於 GBM 幾乎沒有向外轉移的案例，因此在 GBM 患者當中透過手術切除後復發在原區域附近的人高達 95%，但並不確定這種現象是因為手術切除不完全或是癌細胞侵襲周邊組織的結果[60]。因亦有研究指出癌幹細胞其侵略周邊組織的能力較強，因此這些侵襲周邊的癌細胞若為癌幹細胞，便會造成原區種瘤復發[51, 61]。在現有的研究當中，癌症幹細胞能促使膠質瘤（glioma）抵抗放射線的治療，並促進 DNA 受損的. 22.

(35) 修復[62]。因此在 GBM 治療策略中，針對癌幹細胞（glioblastoma cancer stem cell, GSC）的藥物或治療策略逐漸備受重視，例如：促使 GBM 份化之分子藥物（bone morphogenetic protein, BMP），透過讓細胞分化，導致細胞喪失幹細胞特性，並降低其增殖能力[63] 。目前已知的癌幹細胞標記，包含：CD24、CD44、CD133、OCT4 （octamer-binding transcription factor 4）、ABCG2（ATP-binding cassette sub-family G member 2）、Sox2（Sex Determining Region Y-Box 2）、Nanog 等，此外 nestin 、 BMI1 （ B Lymphoma Mo-MLV Insertion Region 1 Homolog）、Olig2（Oligodendrocyte transcription factor 2）也被發現在腦癌、肺癌、肝癌及前列腺癌中有較高的表現 [64-66]。然而將癌幹細胞表面標記作為標靶的治療卻並非這麼理想，因為有些癌幹細胞的標記與正常幹細胞相同，甚至在正常組織中也可見到其表達[59, 67]。若將這些標記作為標靶則可能造成嚴重的副作用，甚至提早患者的死亡[59]。但以癌幹細胞作為標靶並非錯誤的選擇，而是我們應該更準確地處理這些特殊的細胞，且強化對正常細胞的保護。 II-1.3 海檬果（Cerbera manghas L.）海檬果為夾竹桃科（Apocynaceae）海檬果屬（Cerbera）的植物大多生長於南亞沿海地區、熱帶太平洋島嶼、澳大利亞和馬達加斯加的紅. 23.

(36) 樹林沼澤中。他們的果實與芒果相似，然而海檬果種子含有心臟毒性的成分，主要為強心苷類，包含：cerberin、cerberoside 和 neriifolin[68, 69]。在疾病治療的研究上，已有學者發現海檬果的種子與其提取物對白血病、肝癌、乳癌等癌細胞具有細胞毒性[70-73]，可誘導白血病與肝癌細胞株細胞凋亡[70, 71]，以及肝癌細胞的細胞週期停滯[73]。除此之外，海檬果的果實、樹枝與葉子的甲醇提取物也有抗菌、殺蟲的功能，這些成分主要為 17β-neriifolin 與 nymphae[74]。本篇研究所使用的海檬果萃取物由工業技術研究院（Industrial Technology Research Insittute, ITRI）提供，分別為海檬果的莖（stem extract）及果實酒精萃取物（fruit extract）。此外，因為海檬果的主要成分強心苷類，有很多成分已被研究可以抑制癌細胞生長，其中之一為 neriifolin，因此我們也將 neriifolin 做為測試藥物之一。有研究顯示，neriifolin 會造成肝癌細胞細胞週期 S 與 G2/M 期停滯，並誘導 caspase 3, 8, 9 的活化，促進細胞凋亡[73]。強心苷常作為強心劑使用，透過抑制鈉鉀幫浦的功能，造成細胞內鈉離子與鈣離子的上升，進而促進心肌細胞活躍，加強心跳[75]。針對心律不整及充血性心臟病患者有效，但由於治療劑量與中毒劑量相近所以使用上須謹慎評估。在 2017 年，一篇研究表示，強心苷類能抑制細胞缺氧誘導的 HIF-1α（Hypoxia-inducible factor 1-alpha）並有效抑制膠質瘤的癌幹細. 24.

(37) 胞維持[76]。也許在將來這類藥物能提供癌症治療有更多的選擇並有助於治癒的機會。. II-2 研究材料與方法 II-2.1 植物萃取物（Chinese Herbal Extraxts）本篇研究中所使用的藥物 stem extract（SE）、fruit extract（FE）分別為海檬果（Cerbera manghas L.）根與果實的萃取物，由工業技術研究院提供。萃取過程為將萃取物粉末與 95%乙醇以 1：10 比例混合，在 25℃環境中以 120 rpm 搖瓶萃取 7 天。將酒精萃取物蒸散多餘的水分，再進行冷凍乾燥得到植物酒萃物，並溶於二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide, DMSO, ACS Grade, AD0470-0500, Bionovas），濃度為 200 mg/mL。另外購買的 neriifolin（RC-S961825, Sigma）以 10 mg/mL 濃度溶於 DMSO，保存於-20℃。在實驗前解凍，依照所需濃度以 DMSO 稀釋，儲存於-20℃。 II-2.2 細胞培養（Cell Culture）本研究使用人類多型性神經膠質母細胞瘤細胞株 U373-MG 及 U251-MG，於含 10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS, I-NQ-A6806, NQBB）及 1% 青黴素與鏈黴素（penicillin and streptomycin, 15140-122,. 25.

(38) Gibco）的 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）/High Glucose （31600034, Gibco）培養液培養於 5%二氧化碳（CO2 ）、37℃培養箱中。類癌幹細胞球（tumorsphere）的培養則是透過將 U373-MG 的培養環境置換成 DMEM/F12（12400-024, Gibco）培養液（1.2 g/L NaHCO3、 1x B27（12587-010, Gibco）、10 ng/mL fibroblast growth factor-basic（bFGF, 13256029, Invitrogen）、10 ng/mL epidermal growth factor（EGF, PHG0314, Invitrogen），於 5% CO2 、37℃培養箱中培養。將 U373-MG 培養成 U373-derived tumorsphere 後，繼代時以 25% trypsin-EDTA （25200072, Gibco）作用 5 分鐘，使細胞球變成單顆細胞，並使用 Trypsin inhibitor（14502-250MG, soybean）終止 trypsin 的反應，再進行繼代或接種實驗。 II-2.3 細胞株建立（Establishment of cell line） 1.製造 GFP-scramble 慢病毒（lentivirus）：HEK293T 以 10% FBS DMEM 培養液培養在 15 公分培養盤，於 5%二氧化碳（CO2 ）、37℃環境中生長至七分滿。將 pMDG 與 pCMVdeltaR8.74 兩種帶有病毒外套膜及蛋白質外鞘的蛋白質質體與帶有表現綠螢光蛋白質（GFP）以及非特異性 shRNA 的序列（scramble）共轉入 HEK293T 使其產生慢病毒。細胞株在 5%二氧化碳（CO2 ）、37℃環境中培養 12 小時後換成新. 26.

(39) 鮮的 2% FBS DMEM/F12 培養液。隔日，將培養液收集並利用 0.45 μm 孔徑濾杯過濾，將過濾後的培養液以 1：3 加入 Lectin-XTM，並在 50 mL 離心管中輕微搖晃，包入夾鏈袋靜置於 4℃中 16 小時。隔日以 1,500g、 4℃離心 45 分鐘，移除上清液後以 80 μL PBS 回溶沉澱物，並均分成 4 管於-80℃保存。 2.建立 U373-SC 細胞株：將 U373-MG 培養在 6 cm 培養盤中，待細胞成長至 6 分滿後換成新鮮的 10% DMEM，同時加入 20 μL 上述收集的 GFP-scramble 慢病毒，培養於 5%二氧化碳（CO2 ）、37℃培養箱中 36-48 小時。以螢光光學顯微鏡（BMI3000B, Lieca）檢視細胞轉染效率，且細胞經過繼代三代後才能應用於實驗中。此細胞株我們命名為 U373-SC。 II-2.4 細胞存活分析（MTT Assay, Cell Viability Assay）將 U373-MG 以（2500 cells/well）種入 96 孔盤中，並搖晃使細胞均勻散佈在孔內。隔日細胞貼附於盤底後，將孔盤中的培養液換成含有不同濃度的 Stem extract、fruit extract 或 neriifolin 培養液。由於 Stem extract 與 fruit extract 是混合物，72 小時後抑制細胞生長的效果並不顯著，因此在給予藥物 72 小時後將培養液重新換置成與原先相同濃度的藥物，繼續培養 72 小時，再進行 MTT 分析細胞存活率。而 neriifolin. 27.

(40) 則在給予藥物 72 小時後進行 MTT assay 分析。進行 MTT assay 分析前需先將含有藥物的培養液移除，再加入 10 μL 0.5 mg/mL 的 thiazolyl blue tetrazolium bromide（MTT, M5655-500MG, Sigma）及 80 μL 的 10% FBS DMEM，在 5% CO2、37℃培養箱中作用 3 小時後，將 MTT 移除，並加入 100 μL DMSO（AD0470-0500, Bionuvas）回溶。被活細胞粒線體內的琥珀酸脫氫酶（Succinatedehydrogenase, SDH）與細胞色素 C（Cytodhrome C）所還原的紫色結晶（formazan），避光搖晃 10 分鐘使紫色結晶物溶於 DMSO 後利用微量分光光度計（Multiskan Go, Thermo）偵測 OD540 讀值，並將無藥物作用的組別為百分之百來計算細胞存活率。 II-2.5 聚落形成分析（Colony Formation Assay）將 1.0% agarose（AA0481-0500, Bionuvas）與 2x DMEM/F12 混勻後覆蓋在 48 多孔盤底部。U373-tumorsphere 利用 trypsin 打散成單一顆細胞的與 2x DMEM/F12、0.7% agarose 及藥物混合，培養於 48 孔盤，每格有 5000 顆細胞。再添加含有藥物的培養液 300 μl，每 7 天添加一次。四週後將上方培養液移除，並加入 0.01% 結晶紫（crystal violet, Sigma）染色 10 分鐘，再以二次水清洗至能清楚分辨細胞為止。以光學顯微鏡（BMI3000B, Lieca）拍攝結果，利用 Image J 計算在不同濃度. 28.

(41) 作用下形成 tumorsphere 的顆數與面積大小，並統計各面積大小的比例。 II-2.6 細胞刮傷實驗（Wound Healing Assay）將 U373-SC（2.5 × 105 cells/well）種入 12 孔盤中，16 小時細胞貼附後利用 200 μl 微量吸管尖在每個孔的中間位置刮出一道傷口。移除培養液後再以磷酸鹽緩衝生理食鹽水（Phosphate buffered saline , PBS）清洗兩次，加入含 2 mg/mL 抑制細胞生長的 mitomycin C （SI-M42872MG, Sigma）培養液，培養液中含IC50 、0.5 倍IC50 、0.25 倍IC50 的藥物濃度，並將 DMSO 作為對照組。在藥物給予當下（0 小時）、24 小時及 48 小時利用高通量顯微影像暨分析系統（imageXpress Micro, Molecular Devices）在相同的位置拍攝影像，並以 0 小時作為分析記錄影像呈現的傷口面積為基準，再分析 24 小時及 48 小時的傷口癒合程度作為細胞遷移能力指標。 II-2.7 細胞遷移實驗（Cell Transwell Migration Assay）在 12 多孔盤中放入 transwell（3 μm membrane pore size, 353181, Falcon），並在其下方以 10 μg/mL 纖維連結蛋白（fibronectin, F0895, Sigma）作用 16 小時後，將 fibronectin 移除，並以 PBS 清洗。以 0.1% 牛血清蛋白（Bovine serum albumin, BSA, A8806, Sigma）的 DMEM blocking 1 小時。將利用 trypsin 打散的 U373-tumorspher 取1 × 105 顆細. 29.

(42) 胞與 200 μL 含有藥物的 0.1% BSA DMEM 混合，放入 transwell 內。在 transwell 外側加入 10% FBS DMEM 吸引細胞向外爬行。將給予相同藥物的細胞培養在 12 多孔細胞盤中，作為細胞貼附能力與藥物毒性的對照組。培養 7.5 小時後，使用棉花棒將 transwell 內部的細胞清除乾淨，再以 3%甲醛（formaldehyde, AF0200-050, Bionovas）固定從 transwell 內爬到外側的細胞。PBS 清洗 2 次後，以 5 mg/mL 結晶紫染色 15 分鐘，將多餘的染劑移除，以二次水稍微清洗 transwell 上多餘的結晶紫。最後使用光學顯微鏡拍攝 transwell 上的細胞數量，並將計數量除以視野數及對照組的細胞數，以抵銷細胞貼附能力與藥物獨行的干擾，並以 DMSO 對照組作為 100%繪製量化圖。 II-2.8 細胞週期分析（Cell Cycle Assay）將 U373-derived tumorsphere 裡用 trypsin 切成單顆細胞後，取2.5 × 105 顆細胞至 6 公分培養皿（non-treated），並在 DMSO、0.5 倍IC50 或 0.25倍 IC50 之藥物濃度中培養 2 天後，將細胞離心收集於 15 mL 離心管中，並回溶於 100 μL PBS 再滴入冰的 70%乙醇，細胞於 4℃脫水固定 16 小時。隔日將細胞離心後回溶在 400 μL PBS 並加入 4 μL 50 μg/mL 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）於 4℃避光反應 2 小時。PI 是一種核酸染劑，無法穿透細胞膜，因此只有在細胞膜破損的情況下能進入細胞. 30.

(43) 核將核內的核酸染色。使用流式細胞儀（FacsCalibur flow cytometer, BD Biosciences, San Jose, USA）收集 10,000 顆細胞並分析 PI 訊號，透過 FlowJo 7.6.1 進行細胞週期分析。 II-2.9 細胞凋亡雙染分析（Annexin V-PI Apoptosis Assay）將 U373-derived tumorsphere 利用 trypsin 將細胞打散，取2.5 × 105 顆細胞至 6 公分培養皿（non-treated），並於 DMSO 或 0.5 倍IC50 之藥物濃度中培養三天後，將細胞以 1,100 rpm 離心 5 分鐘，收集於 15 mL 離心管，以 100 μL 1X Annexin V Binding Buffer 回溶，並加入 5 μL FITC Annexin V 及 5 μL PI 於室溫下避光靜置染色 15 分鐘。此實驗利用 FITC Annexin V 細胞凋亡偵測組 I（FITC Annexin V apoptosis detection kit l, 556547, BD biosciences）進行檢測。使用流式細胞儀（FacsCalibur flow cytometer, BD Biosciences, San Jose, USA）收集 10,000 顆細胞並分析 FITC 及 PI 的訊號，再透過 FlowJo 7.6.1 進行細胞凋亡分析。 II-2.10 西方墨點法（Western Blot）將 U373-derived tumorsphere 以 trypsin 打散後取2.5 × 105 顆細胞於 6 公分培養盤（non-treated），並加入含有藥物的培養液，懸浮培養 3 天。連同培養液收集於 1.5 mL 微量離心管，經 6,000 rpm 離心 1 分鐘後移除上清液，加入 100 μL SDS（Sodium dodecyl sulfate）lysis buffer（5%. 31.

(44) SDS, 60mM Tris-HCl pH6.8），95℃加熱 3 分鐘，再利用超音波震盪 10 秒/次，1~3 次，破壞細胞膜及核膜，使蛋白質釋出。使用蛋白質測定組（BCA protein assay kit, #23225, Thermo Scientific Pierce）依照廠商標準步驟測定蛋白質濃度，利用微量分光光度計測量 OD562 讀值，經計算即可得樣品蛋白質濃度。經過蛋白質定量後取 50 μg 並加入 4x loading buffer （ 400 mM β-Mercaptoethanol, 240mM Tris-Cl pH6.8, 4% SDS, 0.002% bromophenol blue, 40% glycerol）。將樣品與 4x loading buffer 以 1：3 混合均勻，95℃加熱 3 分鐘後使用 12% SDS-PAGE 電泳膠，設定電壓 140 V 跑膠 65 分鐘。再以半乾轉漬 260 mA 轉漬 60 分鐘，將蛋白質轉漬到硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane, NC 膜, 88018, Thermo Scientific™）上。再將 NC 膜放入 blocking buffer[5%脫脂牛奶溶於 TTBS （25M Tris-HCl pH7.4, 0.15M NaCl, 0.05% Tween-20, 0.001% thimerosal）]中作用 1 小時，移除 blocking buffer 後再以 TTBS 清洗多餘的牛奶。將 NC 膜放在含有抗體的 1%脫脂牛奶中進行專一性結合，於 4℃作用 16 小時（overnight）。以 TTBS 清洗 3 次，每次 10 分鐘，再加入含有 HRP-conjugated 二級抗體的 1% 脫脂牛奶，於室溫作用 2 小時後移除。以 TTBS 清洗 3 次，每次 10 分鐘，清除多餘的抗體。最後加上 ECL substrate（ECL I : 0.136 mM ρ-. 32.

(45) Coumaric Acid, 75 μg/mL luminal, 0.1M Tris-HCl pH9.0; ECL II : 2.4% H2 O2 , 0.1M Tris-HCl pH9.0），使二級抗體發出冷光訊號，利用 Fuji LAS400 mini imaging system（GE Healthcare）拍攝結果，並透過 Image J 進行分析。實驗中所使用的抗體為: caspase 8（551244, BD Biosciences）, PARP1（PTT-13371-1-AP, Proteintech）、Akt（#9272, Cell Signaling Technology）, phospho-Akt（S473）（#4058, Cell Signaling Technology）, HIF2-α（D9E3）（#7096, Cell signaling Technology）, Erk 1/2（#4696, Cell Signaling Technology ） , phospho-Erk 1/2 （ T202/Y204 ）（ #9101, Cell Signaling Technology）, cyclin E（PTT-11554-1-AP, Proteintech）, CDK4（AB108357, Abcam）, Sox2（#3579, Cell Signaling Technology）, TRIP6（BTL-A300334A, Bethyl）, IFIT5（PTT-13378-1-AP, Proteintech）皆稀釋 1 : 1000， GAPDH（SC47724, Santa Cruz Biotechnology) 則以 1 : 2500 稀釋使用。二級抗體使用 Amersham ECL Mouse IgG HRP-linked whole Ab （GER25005173, GE Healthcare）與 Amersham ECL Rabbit IgG HRPlinked whole Ab（GER25005179, GE Healthcare) 以 1 : 2500 稀釋使用。 II-2.11 統計方法（Statistic）所有分析都先透過 Microsoft office Excel 進行標準化後再利用〝統. 33.

(46) 計產品與服務解決方案〞（Statistical Product and Service Solution, SPSS）中的 Analysis of variance（Anova）分析。* : p < 0.05, ** : p < 0.01, *** : p < 0.005. II-3 研究結果 II-3.1 海檬果萃取物有效降低 U373-MG 及其類癌幹細胞（tumorsphere）的存活我們實驗室先前的研究中已得知海檬果萃取物：Stem extract（SE）與 Fruit extract（FE），會對 U251-MG 及 U373-MG 多型性神經膠母細胞瘤（glioblastoma multiform, GBM）細胞株有細胞毒性，並影響其類癌幹細胞的生長。也發現海檬果的有效成分之一 neriifolin[68, 77]具有一樣的效果。本研究利用 U373-MG 及其類癌幹細胞進一步探討 SE、 FE 與 neriifolin 對多型性神經膠母細胞瘤與其類癌幹細胞的影響，並進一步研究其對細胞訊息傳遞路徑的作用。首先我們確認隨著 neriifolin 藥物濃度的上升 U373-MG（圖 II-1A）的生長被抑制。U373-MG 所給予的藥物濃度為 0.01、0.3 與 10 μg/mL，所對應的存活率為 68.8%、33.9%與 10.4%，且 0.01 μg/mL 組別已有顯著差異。經過計算 neriifolin 對 U373-MG 的半抑制劑量（IC50 ）為0.04 ± 0.003 μg/mL。. 34.

(47) II-3.2 Neriifolin 降低 U373-tumosphere 形成聚落的能力先前實驗室的研究已求得 neriifolin 對 U373-derived tumorsphere 的 IC50 為0.7 ± 0.13 μg/mL，我們進一步為了證實此抑制現象為抑制其癌幹細胞，從單一細胞形成 sphere，而非細胞間的聚集所導致的假象，因此進行了 colony formation 實驗。由結果可知隨著 neriifolin 藥物濃度的上升，tumorsphere 形成的面積大小（圖 II-1B）與顆數（圖 II-1C）下降，且大於 300 μm2 的 tumorsphere 比例也隨著濃度上升而下降，反之小於 300 μm2 的 tumorsphrer 比例則上升（圖 II-1D）。 II-3.3 海檬果萃取物與 neriifolin 可抑制 U373 及其類癌幹細胞遷移能力由於 GBM 具有高度的侵襲性（invasion ability），容易侵潤到周邊正常組織，造成臨床治療上的困難。因此我們期望在 GBM 患者的治療過程中能夠控制癌細胞的侵襲及遷移能力，以防止癌細胞的擴散。為了檢測藥物是否會影響 GBM 的遷移與侵襲能力，我們將 U373-SC 進行細胞刮傷實驗（ wound healing assay ），同時也將 U373-derived tumopsphere 進行細胞遷移實驗（cell transwell migration assay）。在進行細胞刮傷實驗時，為了確保移除因細胞增生造成的影響，我. 35.

(48) 們在培養液中加入抑制細胞生長的 mitomycin C，此為抗生素類的抗癌藥劑，經過還原後會形成 DNA 的烷化劑（alkylating agent of DNA），間接抑制細胞分裂增生。我們所使用的藥物濃度 SE 為 11.5 、23 及 46 μg/mL；FE 為 0.65 、1.3 及 2.6 μg/mL。由結果可看到對照組中間傷口區域隨著時間漸漸被兩側細胞侵占，而 SE 及 FE 作用的組別，隨著藥物濃度增加，傷口癒合的程度越來越差（圖 II-2A、B）。我們以細胞未覆蓋傷口區域的面積做定量分析。在加入 SE 作用 24 小時後，11.5 μg/mL 與 23 μg/mL 兩個濃度組別傷口癒合程度分別為 24.43%與 26.69%，相較於對照組傷口癒合程度 32.44% 皆未有明顯差異，而 46 μg/mL 的組別傷口癒合程度則有下降的趨勢（9.15%, p value = 0.055）。在藥物作用 48 小時後，對照組、11.5 μg/mL 與 23 μg/mL 的組別傷口癒合程度分別為 47.12%、40.72%與 38.11%，組間皆未有顯著差異。46 μg/mL 的組別相較於對照組傷口癒合程度則有降低的趨勢（17.40%, p value = 0.061）。這表示隨著 SE 藥物濃度的升高，U373-MG 細胞株遷移能力有下降的現象（圖 II-2C）。給予 FE 藥物 24 小時後，加藥組別傷口癒合的程度隨著濃度增加有下降的趨勢。在藥物作用 48 小時後 2.6 μg/mL 的組別傷口癒合程度顯著性的降低。此結果表示，經 2.6 μg/mL FE 作用 48 小時能有效抑制 U373-MG 細胞. 36.

(49) 株的遷移能力（圖 II-2D）。除了檢測平行爬行的 wound healing assay 之外，我們也利用 Transwell assay 檢測垂直式的細胞移動。透過光學顯微鏡拍攝穿過 transwell 並貼附在外側的細胞（圖 II-2E），記錄平均視野下的細胞數，與對照組的細胞數相除，所得的比例以 transwell 的對照組為 1 進行比較。由統計結果可得知相較於對照組，SE 組別中約有 63.4%的細胞穿過 transwell 移動到 transwell 外側，即表示在 40 μg/mL SE 藥物作用下， tumorsphere 移動能力被抑制程度約為 36.6%。而 FE 與 neriifolin 組別對 tumorsphere 移動能力的抑制程度分別為 18.6%與 65.6%（圖 II-2F）。到由此可證明 SE、FE 與 neriifolin 能有效抑制 U373-derived tumorsphere 的移動能力。 II-3.4 海檬果萃取物與 neriifolin 造成 U373-derived tumorsphere 細胞週期的影響由上述實驗已知 SE、FE 與 neriifolin 會抑制癌細胞生長，也使癌細胞的遷移能力下降。因此為進一步瞭解此 3 種藥物是否會透過影響癌細胞的細胞週期而使癌細胞生長緩慢，我們利用 PI 將核酸染色並透過流式細胞儀分析細胞在細胞週期中的分布。由於過高的藥物濃度會. 37.

(50) 使細胞死亡而干擾細胞週期的判斷，因此 SE、FE 與 neriifolin 所使用的藥物濃度分別為 5、0.05 與 0.01 μg/mL。結果顯示，經 5 μg/mL SE 作用的組別在 G1 時期細胞比例有稍微變多的趨勢，從 78.19%上升到 80.18%，而 sub-G1 及 G2/M 時期的細胞皆略為下降（圖 II-3A）。經過 0.05 μg/mL FE 作用的組別在 G1 時期從 78.19%上升至 80.2%，sub-G1 及 G2/M 時期的細胞比例也略微降低（圖 II-3B）。經 0.01 μg/mL neriifollin 作用後，細胞在 G1 的細胞比例從 78.19%稍微上升至 79.61%（圖 II-3C），而 sub-G1 及 G2/M 時期的細胞比例也略微降低。因此猜測 3 種藥物可能使部分的細胞 G1 時期停滯（G1 arrest），造成細胞無法增生。此外，我們透過西方墨點法檢測調控 G1 時期的相關蛋白 CDK4 （cyclin-dependent kinase 4）與 cyclin E 是否會受到此 3 種藥物的影響。在細胞進入細胞週期 G1 時期時，CDK4 會受到 Cyclin D 的調控並與 cyclin D 結合產生 cyclin D-CDK4 複合物，一起維持細胞在 G1 時期的進行。而 cyclin E 則是負責讓細胞從 G1 進入 S 時期的關鍵蛋白質，當細胞進入 G1 晚期，cyclin E 會調控 CDK2 並與其結合，產生 cyclin ECDK2 的複合物，進一步將 retinoblastoma（RB）蛋白去活化（磷酸化）使其與 E2F 蛋白質分開。與 RB 蛋白質分開的 E2F 蛋白質則進入細胞. 38.

(51) 核，開啟 DNA 複製，使細胞順利進入 S 時期[78]。從結果可以發現給予 80 μg/mL SE 48 小時後， U373-derived tumorsphere 的 CDK4 表現量都有明顯下降（圖 II-3D）。給予 0.6 μg/mL FE 48 小時後，CDK4 與 cyclin E 的表現量亦明顯下降（圖 II-3D）。在給予 0.1 與 0.05 μg/mL neriifolin 的組別中也相同的現象（圖 II-3D）。這個結果也符合我們在細胞週期中所看到的現象。根據實驗我們可推測，海檬果萃取物也許是透過抑制 CDK4 與 cyclin E 的表現，使其無法產生 cyclin D-CDK4 與 cyclin E-CDK2 複合物，進而造成細胞停留在 G1 時期，以達到阻止細胞增生的目的。 II-3.5 海檬果萃取物與 neriifolin 造成 U373-derived tumorsphere 細胞凋亡除了減少細胞增生外，促使癌細胞死亡也能達到抑制細胞生長的目的。我們將 SE 濃度提高為 40μg/mL，FE 藥物濃度提高至 0.3 μg/mL， neriifolin 藥物濃度提高至 0.14 μg/mL 後，再進行細胞週期檢測。由統計圖可以清楚看到，細胞在 SE（圖 II-4A）、FE（圖 II-4B）與 neriifolin （圖 II-4C）藥物作用下，細胞週期 sub-G1 的比例上升，表示細胞可能進行細胞凋亡。因文獻指出 neriifolin 會促使肝癌細胞進行細胞凋亡[73]，因此我們進一步確認 neriifolin 對 GBM 細胞是否真的造成細胞凋亡。. 39.

(52) 本實驗使用 Annexin V 與 PI 雙染檢測以 neriifolin 作用後的癌細胞是否進行細胞凋亡。Annexin V 是一種鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，會與磷脂醯絲氨酸（phosphatidylserine, PS）結合。在細胞凋亡早期，細胞膜會外翻，導致原本在細胞膜內側的 PS 裸露在外，此時用綠色螢光（FITC）標記的 Annexin V 就可以與 PS 結合被偵測到。而 PI 則因為細胞凋亡晚期細胞膜無法維持，可以將核酸染色，進而分化出細胞凋亡早期與晚期的細胞[79]。由實驗結果得知，給予 0.7 μg/mL 與 0.35 μg/mL nerrfolin 的組別都使 U373-derived tumosphere 被 Annexin V 染上的細胞增加，表示細胞進行細胞凋亡（圖 II-4D）。在 0.35 μg/mL 藥物濃度作用下，第三象限（正常細胞）的細胞比例明顯降低，而第四象限（凋亡早期）的細胞比有上升的趨勢（圖 II-4E）。而 0.7 μg/mL 的組別，除了在第三象限的細胞比例明顯下降外，第四象限的細胞比例也顯著上升（圖 II-4E）。除此之外，我們利用西方墨點法檢測細胞凋亡的相關蛋白質 caspase 8 與 PARP 是否會受到 neriifolin 調控影響。Caspase 8 外源性細胞凋亡路徑上重要的調控蛋白質。當細胞接受到外來刺激，透過 Fas 偶聯死亡區域蛋白（Fas-associated death domain protein, FADD）聚集 procaspase 8 並活化，使其成為有功能的 caspase 8 間接或直接活化 caspase. 40.

(53) 3 使其切割 PARP 而達到細胞凋亡的目的[80, 81]。經過 0.6 μg/mL FE 作用 72 小時後，我們觀察到 pro-caspase 8 與 PARP 的表現量皆降低（圖 II-4F），即表示 pro-caspase 8 與 PARP 因被切割而減少。經 0.7 與 1.4 μg/mL neriifolin 作用 72 小時後，可看到 procaspase 8 的表現量的降低（圖 II-4F）。由上述實驗結果可推測 SE、FE 和 neriifolin 會透過 caspase 家族蛋白質切割後活化，最終將 cleavedPARP 送入細胞核，使細胞進行細胞凋亡。 II-3.6 海檬果萃取物與 neriifolin 影響細胞內訊息路徑除了上述與細胞週期和細胞凋亡相關的蛋白質外，我們也透過西方墨點法檢測其他與存活相關的蛋白質和其他可能影響的路徑。有研究顯示在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）與血小板生長因子受體（platelet-deerived growth factor receptor, PDGFR）變異與 GBM 的發病有關，因此 PI3K/Akt 與 MAPK/Erk 作為 EGFR 的下游兩大訊號路徑，成為我們檢測的目標。SE 藥物作用濃度為 80 μg/mL， FE 藥物作用濃度為 0.6 μg/mL，neriifolin 藥物作用濃度為 0.05 與 0.1 μg/mL。由實驗結果顯示，經 SE 藥物作用的 U373-derived tumorsphere 的 Akt 磷酸化比例下降，Erk 磷酸化比例則沒有明顯變化（圖 II-5A）。經 FE 藥物作用的組別，Erk 磷酸化比例沒有明顯變化（圖 II-5B）。經. 41.