基線。在牡丹皮各單寧成分中 1,2,3,6-tetra-GG (2)、1,2,3,4,6-penta-GG (3) 和 1,3,4,6-tetra-GG (4)會和未知化合物重疊，而且因為眾多微量成分的存 在，使得基線非常不平穩，常導致積分上的困擾。 1,2,3,6-tetra-GG (2)、1,2,3,4,6-penta-GG (3)和 1,3,4,6-tetra-GG (4)受到未知 物干擾的此三個指標成分結構如下：
97
4. 1,3,4,6-tetra-GG
圖 3-2-1 牡丹皮指標成分結構圖
3-2-2 實驗部分
3-2-2-1 藥品與儀器
3-2-2-1-1 實驗藥品
(1) 牡丹皮的指標成分 4,6-di-GG (1)，1,2,3,6-tetra-GG (2)，1,2,3,4,6- penta-GG (3) ， 1,3,4,6-tetra-GG (4) ，3,4,6-tri-GG (5) ，1,3,6-tri-GG (6) ， 3,6-di-GG (7) ，1,2,6-tri-GG (8) 。為大仁技術學院林大禎博 士提供。
(2) 內標準品protocatechuic acid購自Nacalai Tesque (Kyoto, Japan)。
(3) 磷酸鹽及磷酸購自Acros (New Jersey, USA)，丙酮(Aceton)、乙酸乙 酯(Ether acetate)、乙醚(Ether)、正己烷(n-Hexane)、甲苯(Toluene)、
甲醇(Methanol)及氰甲烷(Acetonitrile)購Merck(Darmatadt,Germany)。
(4) 配 置 樣 品 及 流 動 相 的 去 離 子 水 (deionized water) 取 自 於 Milli-Q System (Millipore, Bedford,MA,USA)。
(5) Sep-Pak(C18、C8、CM、Silica) 購自Waters
O
3-2-2-1-2 實驗儀器
(1)高效能液相層析(HPLC) 泵：Waters 510 pump 兩個
注射器：Microliter type 802 (25µL loop) 偵測器：Waters 990 photodiode array detector
資料處理器：Shimadzu SPD-M10AVP and 宏碁-586電腦 (2)酸鹼測定儀( pH meter )：Suntex SP-2200
(3)超音波震盪器：Elma Transsonic Sigital
(4)離心機：Hettic Universal 轉盤為10 mL(15mL)¯12 (5)pipette：Nichiryo (Japan) 0-1 mL，0-5 mL兩支
3-2-2-2 分析條件
3-2-2-2-1 最佳分析條件
前置管柱：Guard-Pak µ-Bondapak C18(Millipore, Milford, MA, USA) 分離管柱：Cosmosil 5C18-MS, 5µm, 25cm×4.6mm (Nacalai tesque,
Kyoto, Japan)
流動相： (A) 20 mM KH2PO4(以 10%H3PO4 調整至 pH = 4.00)
99
分析時間：60分鐘 平衡時間：15分鐘 偵測波長：280 nm
3-2-2-2-2 配製適當檢液之探討 (1)採用不同種類之萃取溶劑
精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，
經 0.45μm 濾膜過濾，作為檢液。以 3-2-2-2-1 之最佳分析條件重覆兩次分 析，每次注射 10μL 進行分析，定量值為兩次注射的平均分析結果。
同法，改變溶劑為乙酸乙酯、乙醚、正己烷、丙酮依上述步驟操作。
(2)不同種類之 Sep-pak 的探討
精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，
經 0.45μm 濾膜過濾，分別再經過四種材質的 Sep-pak(C18、C8、CM、Silica) 過濾，作為檢液。以 3-2-2-2-1 之最佳分析條件重覆兩次分析，每次注射 10μL 進行分析，定量值為兩次注射的平均分析結果。
(3)沖提液的選擇
精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，
經 0.45μm 濾膜過濾，再經過 Silica 材質的 Sep-pak 過濾，分別以丙酮、
乙酸乙酯、甲苯為沖提液沖提，作為檢液。以 3-2-2-2-1 之最佳分析條件重 覆兩次分析，每次注射 10μL 進行分析，定量值為兩次注射的平均分析結 果。
(4)不同比例之甲苯沖提液的探討
精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，
經 0.45μm 濾膜過濾，再經過 Silica 材質的 Sep-pak 過濾，依 75%、72%、
70%、67%和 60%甲苯沖提液沖提，作為檢液。以 3-2-2-2-1 之最佳分析條 件重覆兩次分析，每次注射 10μL 進行分析，定量值為兩次注射的平均分 析結果。
3-2-3 結果與討論
3-2-3-1 萃取方法的選汰
(1)不同種類之溶劑的探討
牡丹皮藥材用丙酮、乙酸乙酯、乙醚、正己烷、70%甲醇，配製一系 列之萃取液，再直接使用本章第一節之HPLC分析條件(3-2-2-2-1)分析。
由於牡丹皮之單寧為高極性化合物，所以在高極性的萃取液中萃取牡 丹皮藥材之單寧含量較多，將實驗結果整理如下表3-2-2，萃取液之極性越 高則牡丹皮之單寧的萃取量越多，表中數據顯示以70%甲醇之萃取液，1-8 化合物萃取量最多。惟2、4和3化合物會和未知物重疊，如圖3-2-2、圖3-2-3 須再進一步探討。
表3-2-2 不同種類之溶劑萃取液與各成分之含量的關係表 (mg/g) 丙酮 乙酸乙酯 70%甲醇 乙醚 正己烷
pH 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
1 0 0 15.155 0 0
2 0 0 6.706 0 0
3 47.181 45.386 147.089 15.345 0
4 0 0 6.396 0 0
5 5.273 0 10.547 0 0
6 0 0 9.964 0 0
7 2.554 0 8.121 0 0
8 0 0 2.454 0 0
101
(2)不同材質之Sep-pak的探討
牡丹皮為水解性單寧由沒食子酸（galic acid）或鞣花酸（ellagc acid）與糖類及其他類似的醇類形成之聚酯類化合物，易為酸所水解[75]，
雖然之前探討萃取液以 70%甲醇，1-8 化合物含量最多，還是有 2、3、4 化合物吸收峰沒有回到基線，所以繼續討論用不同材質之 Sep-pak 的探討 (C18、C8、CM、Silica)，以 CM (結構為-CO3--Na+)過濾，1、2、3 和 6 吸 附率達 20%以下但 4、5、7 和 8 之吸附率高於 50%，C18、C8 與 Silica 是 利用極性高低不同來吸附，而以 Silica 過濾，1-8 吸附率均高於 60%，如表 3-2-3、如圖 3-2-4。所以選擇 Silica 材質為前處理之 Sep-pak。
表3-2-3不同種類之Sep-Pak與各成分之吸附率(%)的關係表 回收率 C18 C8 CM Silica
1 27.8% 66.8% 9.5% 66.4% 2 79.5% 27.7% 18.1% 72.1% 3 57.2% 31.4% 8.2% 74.7% 4 76.8% 50.5% 56.2% 60.9% 5 51.3% 59.1% 70.0% 71.7% 6 86.6% 74.6% 15.0% 79.7% 7 55.7% 51.3% 75.5% 76.3% 8 20.9% 28.9% 64.2% 89.2%
(3)不同種類之沖提液的探討
之前探討以Silica材質為前處理之Sep-pak，1-8吸附率最高，在此繼續 以不同種類之沖提液做探討。
乙酸乙酯之沖提液無法從Sep-pak中沖提出1-8化合物之含量，丙酮雖 然可沖提出1-8化合物，但回收率都在60%以下，而以甲苯為沖提液之回收 率為最高，綜合以上比較，以甲苯為Sep-pak之沖提液。結果如表3-2-4。
表 3-2-4 不同種類之沖提液與各成分之回收率(%)的關係表
回收率 丙酮 乙酸乙酯 甲苯
90% 70% 86% 72% 75% 72%
1 11% 16% * * 18% 44%
2 26% 29% * * 40% 81%
3 18% 19% * * 42% 94%
4 20% 22% * * 45% 98%
5 60% 58% * * 94% 98%
6 21% 25% * * 41% 89%
7 20% 5.7% * * 37% 80%
8 34% 37% * * 51% 99%
(*表示沒有含量)
(4)不同比例之甲苯沖提液的探討
探討以Silica材質為Sep-pak，以甲苯做為沖提液2-8回收率最高，但化 合物1之回收率只有40%。在此繼續依75%、72%、70%、67%和60%比例 之甲苯沖提液做一系列之探討。
75%甲苯沖提液只有5化合物回收率達到90%，甲苯比例降低至72%，
化合物2-8回收率80%以上，唯獨1化合物回收率50%以下，甲苯比例繼續 降低至70%，1化合物回收率到達90%，雖然化合物2-8回收率有稍微降低 但回收率都有80%以上，67%甲苯沖提液1化合物回收率81%其它回收率都 有60%以上，甲苯比例降低至60%，化合物1-8回收率全都低於50%，其結 果如表3-2-5和圖3-2-5。綜合以上討論，以70%甲苯為Silica之Sep-pak沖提 液比例。
103
表 3-2-5 不同比例之甲苯沖提液與各成分之回收率(%)的關係表 回收率 75% 72% 70% 67% 60%
1 18% 44% 90% 81% 42%
2 40% 81% 80% 61% 38%
3 42% 94% 90% 86% 46%
4 45% 98% 84% 80% 29%
5 94% 98% 89% 82% 22%
6 41% 89% 80% 70% 37%
7 37% 80% 84% 73% 19%
8 51% 99% 97% 76% 35%
mAbs
Retention (min)
圖 3-2-2 不同萃取液之牡丹皮分析圖譜【1】
(A)70%甲醇 (B)丙酮 (C)乙酸乙酯
（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）
A
B
C
105
Retention (min)
圖 3-2-3 不同萃取溶液之牡丹皮分析圖譜【2】
(D)乙醚 (E)正己烷
（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）
D
E
Retention time (min)
圖 3-2-4 70%甲醇萃取液經不同 Sep-Pak 處理之牡丹皮分析圖譜 (A) C8 (B)C18 (C)Silica (D)CM
（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）
mAbs
B
C A
D
107
A
mAbs
mAbs
Retention time (min)
圖 3-2-5 各樣品之 HPLC 層析圖 (A) 標準品 (B)70%甲醇 (C)70%甲苯*
(*是 70%甲醇萃取液再經過 Sep-pak 處理)
（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）
B
C
mAbs