第三章 牡丹皮單寧酚之分析

第三章 牡丹皮單寧酚之分析

第一節 牡丹皮單寧成分之高效能液相層析

3-1-1 前言

3-1-1-1 牡丹皮類藥材

「牡丹皮」以色丹者為上，雖結子而根上生苗入藥用其根皮故名。牡 丹皮在神農本草經收錄為上品，自古用於清熱、涼血、和血、消瘀等用於 鎮靜、鎮痛、為目的。據最近中藥典之記載，主治熱入血分、發斑、吐血、

衄血、骨蒸勞熱、婦人經閉等，為常用中藥材之一，本品為毛茛科植物 Paeonia suffruticosa Andrew (或 P. moutan)的乾燥根皮，多係栽培，主產於 安徽、四川、陝西、湖北、山東、甘肅等地，秋季或春初採挖洗淨泥土，

除去鬚根及莖苗，剝下根皮、晒干，「刮丹皮」則需刮去外皮，晒干即得。

本品呈圓筒狀或半圓筒狀，一側常有縱縫，兩邊多向內卷曲，長短不一，

一般長 2~3 寸，直徑 1~4 分，厚約一分，外表面灰褐色或紫褐色，有縱線 紋，微突起的長圓形橫生疤痕及須根痕，「刮丹皮」外表面則顯粉紅色，

內表面棕色或淡灰色有細縱紋，並常有多數亮銀星，在放大鏡下觀察，可 見為無色透明的針狀或柱狀結晶，質硬而脆，易折斷，斷面較平坦，外層 灰褐灰色或粉紅色，內層粉白色，有特殊香氣，味微苦而澀，稍有麻舌感。

牡丹皮在日本亦有出產，產於長野，奈良，年約十餘噸。韓國亦有產。但 據陳仁山藥物生產辨云：「兩論以朝鮮為好，向日多到，惟氣味萬不及中 國所產也」，究其品質上之分別如何，尚無人比較研究，牡丹皮以條長無 木心，皮厚斷面粉白色，粉性足，香氣濃，亮銀星多者佳，條細帶根鬚及 木心，斷面粉性小，無亮銀星者質次[92]。

Martiniu 早在 1878 年就從事於牡丹皮成分的研究[92]。而 Tahara 也對 此有濃厚的興趣，由於不斷的研究，因此在 1891 年首先從牡丹板之中，

抽出酚類化合物；經過檢定後命名為牡丹酚（Paeonol）[92]。爾後雖然有 研究的熱潮，但是都沒有突破性的進展，一直到 kariyone 在 1956 年時，

利用管柱分離的方法，很幸運的從 Suffruticosa Andrews 的根，分離出兩種 晶體配醣類。該配醣體經過水解，可分解成牡丹酚及醣類由牡丹酚與葡萄 糖結合者稱為丹皮 （Paeonoside，牡丹酚－右型配醣體），若再接一個阿 拉伯糖時稱鼠李丹皮 （Paeonolide）其化學構造如下：

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OCH₃

O COCH3

Glu Ara

Paeonol Paeonoside Paeonolide

由於有上述突破性的發現，大家對牡丹皮成分研究興起了熱潮，尤其 是日本學者，更是不遺餘力地從事此項工作[92]。因此先後發現牡丹皮中，

還有β-sitoterol、Campesterol、安息酸、芍藥醇（Paeoniflorin）[93]、苯甲 醯 氧 芍 藥 醇 （ Benzoyloxy paeoniflorin ） [94] 、 苯 甲 醯 芍 藥 醇

（Benzoylpaeoniflorin）及 0.15％的揮發油。

圖 3-1-1 牡丹皮植物之外觀圖[98] 圖 3-1-2 牡丹皮藥材之外觀圖[98]

牡丹皮在神農本草經列上品[49]，其性微寒、味苦辛，入心、肝、腎 三經。主要用於清血熱、散瘀血、鎮痛及通經藥，對頭痛、腰痛、關節痛、

月經不調及產後諸病等有效。最近的藥理實驗發現，牡丹皮水煎劑有強烈 的抗菌作用，可抑制革蘭氏菌、大腸菌、葡萄球菌、連鎖狀球菌、枯菌之 增殖；有降血壓的功用，可治療原發性高血壓；能使鼻腔粘過敏症狀消失，

可治療過敏鼻炎[92]。Archi 發現牡丹皮的 70%甲醇萃取液可作為抗炎、抗 菌及抗過敏性症之藥劑[95]。

牡丹酚是牡丹皮的主要成份，根據 Harada[96]等人的研究報告，發現 它有鎮靜、催眼、鎮痛、退熱、抗痙等作用。可用為抗炎、抗菌及抗催產 劑[97]。

牡丹酚能使動物鎮靜、體溫降下，可抑制因腸傷寒疫苗引起之發熱現 象，能延長己巴比妥（hexobarbital）睡眼時間。對於小白鼠之尾部刺激法 或醋酸扭動症均有抑制作用，顯示有鎮痛效果。又有抑制由電擊法或 pentylentetrazole、番木鱉鹼（strychnine）、nicotine 等藥物引起之痙攣。

本品抽取物中之苯甲醯芍藥醇（benzoylpaeoniflorin）等，對於大白鼠 以 carrageenin 引起之浮腫有抑制作用。甲基芍藥 及牡丹酚能防止由 ADP 引起之血小板凝集作用，苯甲基芍藥 對於 plasminogen 活性化及 plasnin 有妨礙作用[98]。

3-1-1-2 單寧

單寧已於本篇第二章第一節介紹。單寧屬於多酚類化合物，是指分子量 500 以上的類黃酮酚類化合物（flavonoid phenolic compounds），以網狀 結構或氫鍵與蛋白質結合的物質，主要可分為縮合單寧（condensed tannins）與水解性單寧(hydrolysable tannins)二類。縮合單寧是由 flavan-3-ols 或 flavan-3,4-diols 縮合而成的聚合物[74]。水解性單寧則 分成沒食子單寧（gallotannins）及鞣花單寧(ellagitannins)，為沒食 子酸（galic acid）或鞣花酸（ellagc acid）與糖類及其他類似的醇類 形成之聚酯類化合物，易為酸所水解[75]。

69

牡丹皮之單寧屬於水解性單寧。1992 年 Itsuo Nishioka[69]等人曾以 逆相 HPLC 分析大戟屬植物中水解型單寧，而所分析成分在層析圖中多有 重疊，且時間冗長（90 分鐘）；1995 年 Haruo Kawamoto[107]等人利用 HPLC 測量水解型單寧的含量，本文擬開發簡便的丹皮單寧分析方法。

3-1-1-3 丹皮單寧指標成分之結構

本章節利用逆相高效能液相層析法分析牡丹皮中的八個牡丹皮單寧 成分【 4,6-di-GG (1)，1,2,3,6-tetra-GG (2) ，1,2,3,4,6-penta-GG (3) ， 1,3,4,6-tetra-GG (4) ，3,4,6-tri-GG (5) ，1,3,6-tri-GG (6) ， 3,6-di-GG (7) ， 1,2,6-tri-GG (8) 。指標成分，並評估此分析方法之適宜性。

八個指標成分結構如下：

1. 4,6-di-GG 2. 1,2,3,6-tetra-GG

O OH

HO C HO

HO

HO

O

OH CH₂

O C HO OH

HO

O

O

O HO

CH₂ C HO OH

HO

O O

C HO

HO

HO O

O

C

OH OH OH

O O

C

HO OH OH O

O

3. 1,2,3,4,6-penta-GG 4. 1,3,4,6-tetra-GG

5. 3,4,6-tri-GG 6. 1,3,6-tri-GG

O CH₂ C HO OH

HO

O O

C HO

HO

HO O

O

C

OH OH OH

O O

C

HO OH OH O

O C

HO

HO

HO

O

O

O OH

OH CH2 C HO OH

HO

O

O

C HO

HO

HO

O O C HO

HO

HO

O

O

O

OH HO

CH₂ C HO OH

HO

O

O

C HO

HO

HO O

O

C

OH OH OH

O O

O

OH CH₂ C HO OH

HO

O

O

C HO

HO

HO O

O

C

OH OH OH

O O

C HO

HO

HO

O

O

71

7. 3,6-di-GG 8 1,2,6-tri-GG

IS protocatechuic acid

圖 3-1-3 牡丹皮指標成分結構圖

O OH

OH HO

CH2 C HO OH

HO

O

O

C HO

HO

HO

O O

O HO

CH2 C HO OH

HO

O

O

C

OH OH OH

O HO

C

HO OH

OH O

O

O

COOH

OH OH

3-1-2 實驗部分

3-1-2-1 藥品與儀器

3-1-2-1-1 實驗藥品

(1) 牡丹皮的指標成分 4,6-di-GG (1)，1,2,3,6-tetra-GG (2)，1,2,3,4,6- penta-GG (3) ， 1,3,4,6-tetra-GG (4) ，3,4,6-tri-GG (5) ，1,3,6-tri-GG (6) ， 3,6-di-GG (7) ，1,2,6-tri-GG (8) 。為大仁技術學院林大禎博 士提供。

(2) 內標準品protocatechuic acid購自Nacalai Tesque (Kyoto, Japan)。

(3) 磷酸鹽及磷酸購自Acros (New Jersey, USA)，甲醇(Methanol)及氰甲 烷(Acetonitrile)購自Merck(Darmatadt,Germany)。

(4) 配 置 樣 品 及 流 動 相 的 去 離 子 水 (deionized water) 取 自 於 Milli-Q System (Millipore, Bedford,MA,USA)。

3-1-2-1-2 實驗儀器

(1)高效能液相層析(HPLC) 泵：Waters 510 pump 兩個

注射器：Microliter type 802 (25µL loop) 偵測器：Waters 990 photodiode array detector

資料處理器：Shimadzu SPD-M10AVP and 宏碁-586電腦 (2)酸鹼測定儀( pH meter )：Suntex SP-2200

(3)超音波震盪器：Elma Transsonic Sigital

(4)離心機：Hettic Universal 轉盤為10 mL(15mL)¯12 (5)pipette：Nichiryo (Japan) 0-1 mL，0-5 mL兩支

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3-1-2-2 分析條件

3-1-2-2-1 最佳分析條件

前置管柱：Guard-Pak µ-Bondapak C18(Millipore, Milford, MA, USA) 分離管柱：Cosmosil 5C18-MS, 5µm, 25cm×4.6mm (Nacalai tesque,

Kyoto, Japan)

流動相： (A) 20 mM KH₂PO4(以 10%H3PO4 調整至 pH = 4.00) (B) CH₃OH/H₂O=70/30

梯度沖提程式：

表3-1-1 丹皮單寧分析方法之梯度沖提程式 時間(min)

流速

(mL/min) A% B% Curve initial 1.0 100 0

15 1.0 85 15 linear 25 1.0 70 30 linear 35 1.0 50 50 linear 45 1.0 50 50 linear 50 1.0 0 100 linear 55 1.0 0 100 linear 60 1.0 100 0 linear

分析時間：60分鐘 平衡時間：15分鐘 偵測波長：280 nm

3-1-2-2-2 分析條件的選擇

(1)分離管柱的選擇

選擇四種不同填充材料之管柱(表3-1-2)，以表3-1-1之梯度沖提程式及 流動相分析條件進行分析，各組進行兩次重覆注射，以探討不同填充材料 之管柱對各成分的分離效果。

表3-1-2 分離管柱的種類及其材質表 管柱品名^a 孔徑

(Å)

表面積 (m²/g)

含碳比 (%)

鍵結型式^b 110 330 20 mono 120 300 16 mono 120 300 16 polymeric Cosmosil 5C18

Cosmosil 5C18-MS Cosmosil 5C18-AR

Cosmosil 5C18-AR II 120 300 17 polymeric

a.四種管柱皆是出自Nacalai tesque, Kyoto, Japan。

填充粒子大小 5 µm，長度 25cm，內徑 4.6mm。

b.

(CH₂)₁₇CH₃

(2)流動相(A)中不同鹽類濃度的探討

選定最適當的分離管柱後，分別配製20、30、40、50 mM的磷酸二氫 鉀溶液，並用磷酸將pH值調至4.00作為一系列流動相(A)，以前述之梯度沖 提程式進行分析，各組重覆二次注射。

(3)流動相(A)中不同酸鹼值的探討

在最適當的磷酸鹽濃度流動相(A)中加入不同量10%的磷酸，配製不同 酸鹼度的緩衝溶液，其pH值範圍由2.50至5.00，以前述之梯度沖提程式進 行分析，各組重覆二次注射。

(4)流動相(B)中不同甲醇/水之比例的探討

由於鹽類的加入，流動相(B)需含適量的水，以防止鹽類析出及獲得較 平整的基線，所以配製不同甲醇/水比例的流動相(B)，比例分別為甲醇/水 (V/V) = 90/10，80/20，70/30，60/40，50/50。依上述適當的磷酸鹽緩衝溶

75

液及梯度沖提程式進行分析，每組重覆操作兩次。

3-1-2-2-3 配製標準品溶液及製作檢量線

稱取26.0 mg 的protocatechuic acid 以70%甲醇配成25 mL溶液，做為 內標準品溶液(IS)。

分別稱取 4,6-di-GG (1) 4.2 mg，1,2,3,6-tetra-GG (2) 4.0 mg，1,2,3,4,6- penta-GG (3) 2.3 mg， 1,3,4,6-tetra-GG (4) 3.2 mg，3,4,6-tri-GG (5) 3.7 mg，

1,3,6-tri-GG (6) 1.5 mg， 4,6-di-GG (7) 3.7 mg，1,2,6-tri-GG (8) 1.5 mg，溶 於 70%甲醇，分別配成 10 mL 標準品母液 1-8 【

I

分別以吸量管取標準母液【

I

II

II

分別以吸量管取標準母液【

I

III

III

分別以吸量管取標準母液【

I

0.5 mL之標準品於量瓶中，各加入1.0 mL之內標準品溶液，再以70%甲醇 配成10 mL溶液。

各濃度的標準品1-8，分別在280 nm波長下，以3-1-2-2-1之最佳分析條 件重覆兩次分析，每次注入10 µL ，取其平均值作檢量線。

3-1-2-2-4 分析條件之適宜性評估

(1)再現性(Reproducibility)

取標準母液【

II

III

1.0 mL於量瓶中，加入1.0 mL之內標準品溶液，以70%甲醇水溶液稀釋至 10mL ， 作 為 檢 液 。 每 次 注 射 10 μ L 進 行 分 析 ； 同 一 天 內 重 覆 六 次 ( intraday )，不同天總計重覆六次 ( interday ) 。

(2)回收率(Recovery)

精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以70%甲醇10 mL作為萃取溶劑，超音波震盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至10 mL，取5mL於10mL 量瓶，加入0.5 mL標準母液【

II

III

經 0.45μm濾膜過濾，作為檢液。以3-1-2-2-1之最佳分析條件重覆兩次分 析，每次注射10μL進行分析，定量值為兩次注射的平均分析結果。

(3)偵測極限

逐步稀釋標準品溶液，注入偵測，直到 signal /noise = 3 / 1以下，計算 其注入量及其濃度。

3-1-2-2-5 桂皮之定量分析

精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，

經 0.45μm 濾膜過濾，再經過 Silica 材質的 Sep-pak 過濾，依 70%甲苯沖 提液沖提，作為檢液。以 3-1-2-2-1 之最佳分析條件重覆兩次分析，每次注 射 10μL 進行分析，定量值為兩次注射的平均分析結果。

3-1-3 結果與討論

3-1-3-1 分析條件的選擇

1992年，Nishioka[69]等人以逆相HPLC分析大戟植物中的水解型單 寧，但因所分析成分在層析圖中解析度並不理想，且用磷酸溶液，酸性太

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強（H＝1.60），對管柱壽命的維持十分不利。因此，改為磷酸鹽條件，並 以甲醇取代氰甲烷作為流動相。

(1)偵測波長的選擇

由附錄一中可以看出，發現1-8化合物的最大吸收波長在210nm附近，

由於B相中是以甲醇為主，甲醇在210 nm會有很大的吸收，因此選擇第二 大吸收波長【4,6-di-GG (1)210nm、278nm，1,2,3,6-tetra-GG (2) 210nm、

278nm，1,2,3,4,6- penta-GG (3) 210nm、278nm，1,3,4,6-tetra-GG (4) 210nm、

278nm， 3,4,6-tri-GG (5) 210nm、278nm，1,3,6-tri-GG (6) 210nm、278nm，

3,6-di-GG (7) 210nm、278nm，1,2,6-tri-GG (8) 210nm、278nm，】，故以280nm 進行樣品分析。

(2)分離管柱的選擇

本實驗室積多年經驗，發現cosmosil

5C18、5C18-MS、5C18-AR

加上近年來新開發的5C18-AR II等四種來比較，分析圖譜如圖3-1-4。經整 理，其Rs及N值結果如表3-1-3、圖3-1-5及圖3-1-6所示，發現5C18-MS管柱 分析成分1 –8結果不錯，其理論板數最好。

表 3-1-3 不同分析管柱與各成分 N 值(N×10⁴)的關係表

化合物 5C18-MS 5C18 5C18-AR 5C18-AR II

1 13.72 2.28 4.38 5.51

2 11.61 2.21 5.61 2.52

3 11.58 1.45 4.98 3.96

4 10.54 2.76 4.87 5.99

5 5.14 4.11 4.86 4.28

6 6.66 2.82 3.56 3.76

7 5.44 1.82 2.49 1.21

8 6.00 3.22 3.43 4.21

若由表3-1-4解析度來做比較， 5C18管柱分離6和8之解析度最差；

5C18-AR及5C18-AR II在6/8的解析度均在1以上，但還是以5C18-MS在6/8 的解析度最好；對全部指標成分而言，5C18-MS、5C18-AR及5C18-AR II 均可有效分離，但綜合理論板數及解析度兩因素，則以5C18-MS最佳。

表 3-1-4 不同管柱與 Rs 值的關係表

Rs 5C18-MS 5C18 5C18-AR 5C18-AR II 6/8 1.599 0.761 1.001 1.061

(3)流動相(A)中不同鹽類濃度的探討

在本篇第二章第一節中曾討論桂皮單寧成分之分析，以採用磷酸鹽系 統作為分析流動相(A)最宜，故本節先以磷酸鹽作為流動相(A)來探討分析 效果。

為了探討磷酸鹽對各化合物的影響，在流動相（A）中溶有不同濃度 之磷酸鹽及適當量之磷酸，使pH=4.00，作一系列比較。結果如圖2-1-7。

由圖中可看到，對大部分成分而言，磷酸鹽濃度由20~50 mM皆有不錯的分 離效果。當磷酸鹽濃度增加時，對於5、6和8等成分解析度不佳以外，其 它化合物皆能明顯分離。由圖2-1-7的K’值可以看出在水相中加入磷酸鹽 後，化合物的滯留時間縮短，這主要是因為磷酸鹽可覆蓋管柱表面殘餘矽 羥基基團，因而阻止吸附樣品及參與離子樣品的滯留，因此分析時間縮短。

然而，濃度過高可能造成鹽類析出，降低管柱壽命，對於泵的損耗較 大；由圖中可看出磷酸鹽濃度對大部分成分的分離並無太大影響，唯獨對 於5、6和8等成分影響較大，因為這四種成分受磷酸鹽濃度影響不同，且 滯留時間非常接近，故在磷酸鹽濃度的選擇上，考量以這四種成分的解析 度大小為指標，其解析度如表2-1-6所示，其中可看到在濃度40mM、50mM時 5、6和8等成分的解析度較差，而濃度20mM時5、6和8等成分之解析度佳且 理論板數亦優（5.14×10⁴至1.37×10⁵），所有化合物之理論板數如表3-1-5及 圖3-1-8所示。考量管柱保養和成分分離解析度二方面的數據，選擇20mM磷

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酸鹽作為流動相（A）的濃度。

表3-1-5 添加不同濃度磷酸鹽與各成分N值(N×10⁴)的關係表

化合物 20 mM 30 mM 40 mM 50 mM

pH 4.00 4.00 4.00 4.00 1 13.72 8.34 7.79 6.89 2 11.61 10.33 7.21 8.63 3 11.58 6.75 5.56 4.75 4 10.54 9.18 6.36 7.50 5 5.14 2.65 0.52 1.02 6 6.66 1.01 0.86 0.59 7 5.44 1.75 0.66 0.76 8 6.00 2.01 1.52 0.58

表3-1-6 添加不同濃度磷酸鹽與Rs值的關係表

Rs 20 mM 30 mM 40 mM 50 mM 5/8 2.081 1.241 0.812 0.775 6/8 1.599 1.001 0.765 0.654

(4)流動相(A)中不同酸鹼值的探討

在 20 mM 磷酸二氫鉀容液中，加入不等量的 10%磷酸，配製不同 pH 值 的流動相(A)，其值分別為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 來探討 pH 值對 分離的影響，圖 3-1-9 顯示酸鹼值與 k’值的關係。事實上，當 pH 低於 3.0 時，吸收峰 5、6、8 解析度較差，參見表 3-1-8，且理論板數也大幅下降，

參見表 3-1-7 及圖 3-1-10。因此，考量解析度與滯留時間等因素，本研究 選擇 20mM 磷酸二氫鉀水溶液，以 10%磷酸調整 pH 值至 4.00 作為流動 相(A)的組成。

表3-1-7不同酸鹼值與各成分N值(N×10⁴)的關係表

化合物 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

1 8.12 8.88 7.72 13.72 6.42 7.67 2 8.56 1.31 8.76 11.61 9.65 10.65 3 5.52 3.02 6.01 11.58 4.12 2.67 4 10.27 8.65 9.12 10.54 7.41 8.34 5 2.60 3.03 3.23 5.14 1.22 1.63 6 2.30 3.20 2.79 6.66 0.84 1.48 7 1.52 2.31 2.34 5.44 0.68 1.61 8 2.01 3.04 4.14 6.00 5.01 4.02

表3-1-8不同酸鹼值與Rs值的關係表

Rs 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5/8 0.520 0.623 1.052 2.081 0.970 1.021 6/8 0.642 0.789 0.902 1.599 1.201 0.901

(5)流動相(B)中不同甲醇/水之比例的探討

由於流動相（A）中含有鹽類，當與完全為有機溶劑之流動相（B）混 合時很容易析出鹽類，且考量當二流動相混合時會有溫度的變化，導致基 線的不穩，故主體為有機溶劑之流動相（B）應包含適量的水，以防止鹽 類析出並有平整基線。

本篇第二章第一節開發的桂皮單寧成分分析條件，在B相中是以氰甲烷 為主，本節也曾經用氰甲烷/水的體積比例為80/20、70/30作為流動相（B）， 由於牡丹皮單寧中之1、2、4和7成分在此條件下無法分離，結果如圖 3-1-13。因此改用甲醇代替氰甲烷，因為甲醇的表面張力及黏滯係數較氰 甲烷大，可使化合物1、2、4和7滯留時間變長，1、2、4和7成分得以分離，

但卻使5、6和8化合物解析度變差，故改變甲醇/水的體積比例為90/10、

80/20、70/30、60/40、50/50來探討流動相（B）比例對k’值的影響，結果 如圖3-1-11所示。由圖可看出水比例愈高，各成分之滯留時間愈長。如同 pH值影響的探討所述，由於各化合物滯留時間差距相當接近，在此仍以較 接近的5與8及6、8等兩組成份的解析度為抉擇依據，其值如表3-1-10。

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由表3-1-10可知在70/30比例時有不錯的解析度，再由理論板數來看（表 3-1-9及圖3-1-12），在流動相B中增加甲醇比例，理論板數會降低，總體而 言以70/30的比例為最佳。另外當甲醇比例太高時，容易造成鹽類析出而對 管柱有不利的影響。因此，本研究方法選擇甲醇/水之體積比例＝70/30作 為流動相（B）之組成。

表 3-1-9 不同甲醇/水比例與各成分 N 值(N×10⁴)的關係表

化合物 90/10 80/20 70/30 60/40 50/50

1 2.95 2.88 13.72 10.82 9.21 2 5.35 3.84 11.61 9.64 10.21 3 1.87 1.78 11.58 8.87 5.78 4 3.89 4.12 10.54 7.61 6.45 5 1.27 1.58 5.14 4.23 1.34 6 0.35 0.56 6.66 3.96 1.01 7 0.41 0.68 5.44 3.50 1.05 8 2.12 2.02 6.00 4.03 2.01

表 3-1-10 不同甲醇/水比例與 Rs 值的關係表

Rs 90/10 80/20 70/30 60/40 50/50

5/8 0.813 1.103 2.081 1.242 1.065

6/8 0.701 1.099 1.599 1.076 1.009

Retention time(min)

圖 3-1-4 牡丹皮用不同分析管柱的分析圖譜 (A)5C18-MS (B)5C18 (C)5C18-AR (D)5C18-AR II

（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）

B A

C

D

83

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

5C18-MS 5C18 5C18-AR 5C18-ARII

Columns

k' (capacity factor)

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-1-5 不同管柱與各成分 k’值的關係圖

0 2 4 6 8 10 12 14 16

5C18-MS 5C18 5C18-AR 5C18-ARII

Columns

N (theoretical plate number) x10

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-1-6 不同管柱與各成分 N 值的關係圖

85

6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00

20 30 40 50

KH₂PO₄ cono. (mM)

K'(Capacity factor )

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-1-7 流動相 A 中磷酸鹽濃度與各成分 k’值的關係圖

0 2 4 6 8 10 12 14 16

20 30 40 50

KH₂PO₄ cono. (mM)

N (theoretical plate number) x 10

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-1-8 流動相 A 中磷酸鹽濃度與各成分 N 值的關係圖

87

5 7 9 11 13 15 17

2.5 3 3.5 4 4.5 5

pH value

k' (capacity factor)

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-1-9 流動相 A 中不同酸鹼值與各成分 k’值的關係圖

0 2 4 6 8 10 12 14 16

2.5 3 3.5 4 4.5 5

pH value

N (theoretical plate number) x 10

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-1-10 流動相 A 中不同酸鹼值與各成分 N 值的關係圖

89

5 7 9 11 13 15 17

90% 80% 70% 60% 50%

CH₃OH (%)

K' (capacity factor)

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-1-11 流動相 B 中甲醇/水比例與各成分 k’值的關係圖

0 2 4 6 8 10 12 14 16

90% 80% 70% 60% 50%

CH₃OH (%)

N (theoretical plate number) x 10

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-1-12 流動相 B 中甲醇/水比例與各成分 N 值的關係圖

91

2-1-3-2 檢量線的製作

由附錄一中各成分的UV圖可以看到，1-8化合物的最大吸收波長都在 210nm，由於B相中含有甲醇，甲醇在210 nm有很大的吸收峰故以第二大 波長280 nm做檢量線，結果如表3-1-11。

依實驗3-2-2-2所述，以吸收峰面積與內標準品面積的比值(y)與各成分 的濃度(x, mg/mL)關係作圖，得檢量線方程式：

表3-1-11 牡丹皮單寧成分在280nm之檢量線 y=ax+b

(y=peak-area ratio,x=conc.(mg/mL)) 線性範圍 Slope Intercept R² Compound

(µg/mL) a b 1 4,6-di-GG 21.0 – 336 10.189 -0.0433 0.9995 2 1,2,3,6-tetra-GG 20.0 – 320 17.677 -0.0762 0.9990 3 1,2,3,4,6-penta-GG 23.0 – 368 14.182 +0.084 0.9993 4 1,3,4,6-tetra-GG 16.0 – 256 28.296 -0.0410 0.9999 5 3,4,6-tri-GG 18.5 – 296 6.467 0.0158 0.9999 6 1,3,6-tri-GG 15.0 – 240 24.580 0.0789 0.9996 7 3,6-di-GG 18.5 – 296 6.467 -0.0158 0.9995 8 1,2,6-tri-GG 15.0 – 240 24.580 -0.0789 0.9991

3-1-3-3 分析條件之適宜性評估

(1)再現性

以 最 佳 分 析 條 件 對 各 成 分 進 行 定 量 ， 在 同 一 天 內 連 續 注 射 六 次 ( intraday )及不同天總計注射六次 ( interday )。分別以吸收峰面積比及遷移 時間，來計算相對標準偏差 ( RSD, % )，見表3-1-12。

一般而言，在有機相比例較高時，管柱內表面張力較小，再現性良好，

滯留時間之RSD值均在3%以內，同一天滯留時間的相對標準偏差可在 0.28-0.56%，不同天滯留時間的相對標準偏差可在0.22-0.95%之間。

同一天面積比的相對標準偏差在1.16-2.79%之間，不同天面積比的相 對標準偏差在0.19-2.43%之間，照常理不同天面積比的相對標準偏差應該 大於同一天面積比的相對標準偏差，但每天前洗較長時間、前置管柱也得 充分清洗使得管柱沖洗得較乾淨，以致於不同天的RSD有小於同一天RSD 者，不過其值都小於4，可以看出再現性良好。

表 3-1-12 牡丹皮分析條件之再現性 再現性(RSD，%)

化合物 Intraday(n=6) Interday(n=6) 面積比 滯留時間 面積比 滯留時間 1 1.63 0.32 2.10 0.95 2 2.79 0.35 1.00 0.44 3 1.16 0.28 2.43 0.37 4 2.18 0.35 0.19 0.46 5 1.49 0.46 1.12 0.53 6 1.83 0.49 0.51 0.27 7 1.39 0.41 1.89 0.76 8 1.47 0.56 0.54 0.22

(2)回收率(Recovery)

以3-2-1之最佳分析條件重覆兩次分析，每次注射10μL進行分析，定 量值為兩次注射的平均分析結果。結果顯示在已知含量成分的桂皮藥材中 添加各成分純品，如表3-1-13所示。各成分的回收率97-103﹪之間。

(3)偵測極限

逐步稀釋標準品母液，每次注入10μL予以分析，直到signal/noise = 3/1 以下，並記錄此時的濃度值及注入量。結果如表3-1-13：

93

表3-1-13 牡丹皮單寧分析條件之回收率與偵測極限 偵測極限

化合物 回收率

（%） µg/mL ng 1 97 0.51 10.20 2 98 0.07 1.34 3 99 0.08 1.54 4 101 0.04 0.80 5 103 0.72 14.43 6 99 0.05 1.00 7 97 0.93 18.66 8 99 0.05 1.00

3-1-3-4 牡丹皮藥材定量結果

取市售牡丹皮藥材三批（n＝3）萃取液進行定量，重覆注射3次，求 各成分含量之平均值，結果如表3-1-14。層析圖譜見圖3-1-14。

表 3-1-14 牡丹皮藥材單寧成分定量結果

化合物 代碼 mean±SD

（mg/g）

4,6-di-GG 1 15.155 ± 0.002 1,2,3,6-tetra-GG 2 6.706 ± 0.002 1,2,3,4,6-penta-GG 3 147.089 ± 0.021 1,3,4,6-tetra-GG 4 6.396 ± 0.011 3,4,6-tri-GG 5 10.547 ± 0.008 1,3,6-tri-GG 6 9.964 ± 0.007

3,6-di-GG 7 8.121 ± 0.005 1,2,6-tri-GG 8 2.454 ± 0.006 Total 206.428 ± 0.019

Retention time (min)

圖 3-1-13 不同 B 相的丹皮單寧成分分析圖譜 (A)CH₃CN﹝70%﹞(B)CH₃OH﹝70%﹞

（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）

A

B

mAbs

mAbs

95

mAbs

Retention time (min)

圖 3-1-14 牡丹皮藥材之 HPLC 層析圖 (A)八個標準品(B)市售藥材

（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）

A

B

mAbs

第二節 牡丹皮單寧檢液之製備

3-2-1 前言

中藥組成成分繁多複雜，具有許多結構相似、物理性質相同的物質，

因此在定量分析上，常會遭遇許多未知成分的干擾而成效不佳。桂皮藥材 即有此困擾。本章第一節利用 HPLC 分析牡丹皮之單寧成分，在標準品的 分析上雖有不錯的分離，但在藥材方面由於雜質較多而使吸收峰無法回到 基線。在牡丹皮各單寧成分中 1,2,3,6-tetra-GG (2)、1,2,3,4,6-penta-GG (3) 和 1,3,4,6-tetra-GG (4)會和未知化合物重疊，而且因為眾多微量成分的存 在，使得基線非常不平穩，常導致積分上的困擾。

因而嘗試利用不同萃取方法或前處理，希望藉由提高指標成分的濃度 或去除未知物的干擾，來改善桂皮藥材的分析，處理方法以下列二個方向 來進行：

1. 不同種類的萃取溶液 2. 經過系列前處理

a. 選擇不同 sep-pak b. 選擇不同沖提流程

本章節利用前處理使牡丹皮藥材中的八個單寧成分做有效定量，尤其 1,2,3,6-tetra-GG (2)、1,2,3,4,6-penta-GG (3)和 1,3,4,6-tetra-GG (4)受到未知 物干擾的此三個指標成分結構如下：

2. 1,2,3,6-tetra-GG 3. 1,2,3,4,6-penta-GG

O HO

CH₂ C HO OH

HO

O O

C HO

HO

HO O

O

C

OH OH OH

O O

C

HO OH OH O

O

O CH₂ C HO OH

HO

O O

C HO

HO

HO O

O

C

OH OH OH

O O

C

HO OH OH O

O C

HO

HO

HO

O

O

97

4. 1,3,4,6-tetra-GG

圖 3-2-1 牡丹皮指標成分結構圖

3-2-2 實驗部分

3-2-2-1 藥品與儀器

3-2-2-1-1 實驗藥品

(1) 牡丹皮的指標成分 4,6-di-GG (1)，1,2,3,6-tetra-GG (2)，1,2,3,4,6- penta-GG (3) ， 1,3,4,6-tetra-GG (4) ，3,4,6-tri-GG (5) ，1,3,6-tri-GG (6) ， 3,6-di-GG (7) ，1,2,6-tri-GG (8) 。為大仁技術學院林大禎博 士提供。

(2) 內標準品protocatechuic acid購自Nacalai Tesque (Kyoto, Japan)。

(3) 磷酸鹽及磷酸購自Acros (New Jersey, USA)，丙酮(Aceton)、乙酸乙 酯(Ether acetate)、乙醚(Ether)、正己烷(n-Hexane)、甲苯(Toluene)、

甲醇(Methanol)及氰甲烷(Acetonitrile)購Merck(Darmatadt,Germany)。

(4) 配 置 樣 品 及 流 動 相 的 去 離 子 水 (deionized water) 取 自 於 Milli-Q System (Millipore, Bedford,MA,USA)。

(5) Sep-Pak(C18、C8、CM、Silica) 購自Waters

O

OH CH2 C HO OH

HO

O

O

C HO

HO

HO O

O

C

OH OH OH

O O

C HO

HO

HO

O

O

3-2-2-1-2 實驗儀器

(1)高效能液相層析(HPLC) 泵：Waters 510 pump 兩個

注射器：Microliter type 802 (25µL loop) 偵測器：Waters 990 photodiode array detector

資料處理器：Shimadzu SPD-M10AVP and 宏碁-586電腦 (2)酸鹼測定儀( pH meter )：Suntex SP-2200

(3)超音波震盪器：Elma Transsonic Sigital

(4)離心機：Hettic Universal 轉盤為10 mL(15mL)¯12 (5)pipette：Nichiryo (Japan) 0-1 mL，0-5 mL兩支

3-2-2-2 分析條件

3-2-2-2-1 最佳分析條件

前置管柱：Guard-Pak µ-Bondapak C18(Millipore, Milford, MA, USA) 分離管柱：Cosmosil 5C18-MS, 5µm, 25cm×4.6mm (Nacalai tesque,

Kyoto, Japan)

流動相： (A) 20 mM KH₂PO4(以 10%H3PO4 調整至 pH = 4.00) (B) CH₃OH/H₂O=70/30

梯度沖提程式：

表3-2-1 牡丹皮單寧分析方法之梯度沖提程式 時間(min)

流速

(mL/min) A% B% Curve initial 1.0 100 0

15 1.0 85 15 linear 25 1.0 70 30 linear 35 1.0 50 50 linear 45 1.0 50 50 linear 50 1.0 0 100 linear 55 1.0 0 100 linear 60 1.0 100 0 linear

99

分析時間：60分鐘 平衡時間：15分鐘 偵測波長：280 nm

3-2-2-2-2 配製適當檢液之探討 (1)採用不同種類之萃取溶劑

精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，

經 0.45μm 濾膜過濾，作為檢液。以 3-2-2-2-1 之最佳分析條件重覆兩次分 析，每次注射 10μL 進行分析，定量值為兩次注射的平均分析結果。

同法，改變溶劑為乙酸乙酯、乙醚、正己烷、丙酮依上述步驟操作。

(2)不同種類之 Sep-pak 的探討

精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，

經 0.45μm 濾膜過濾，分別再經過四種材質的 Sep-pak(C18、C8、CM、Silica) 過濾，作為檢液。以 3-2-2-2-1 之最佳分析條件重覆兩次分析，每次注射 10μL 進行分析，定量值為兩次注射的平均分析結果。

(3)沖提液的選擇

精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，

經 0.45μm 濾膜過濾，再經過 Silica 材質的 Sep-pak 過濾，分別以丙酮、

乙酸乙酯、甲苯為沖提液沖提，作為檢液。以 3-2-2-2-1 之最佳分析條件重 覆兩次分析，每次注射 10μL 進行分析，定量值為兩次注射的平均分析結 果。

(4)不同比例之甲苯沖提液的探討

精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，

經 0.45μm 濾膜過濾，再經過 Silica 材質的 Sep-pak 過濾，依 75%、72%、

70%、67%和 60%甲苯沖提液沖提，作為檢液。以 3-2-2-2-1 之最佳分析條 件重覆兩次分析，每次注射 10μL 進行分析，定量值為兩次注射的平均分 析結果。

3-2-3 結果與討論

3-2-3-1 萃取方法的選汰

(1)不同種類之溶劑的探討

牡丹皮藥材用丙酮、乙酸乙酯、乙醚、正己烷、70%甲醇，配製一系 列之萃取液，再直接使用本章第一節之HPLC分析條件(3-2-2-2-1)分析。

由於牡丹皮之單寧為高極性化合物，所以在高極性的萃取液中萃取牡 丹皮藥材之單寧含量較多，將實驗結果整理如下表3-2-2，萃取液之極性越 高則牡丹皮之單寧的萃取量越多，表中數據顯示以70%甲醇之萃取液，1-8 化合物萃取量最多。惟2、4和3化合物會和未知物重疊，如圖3-2-2、圖3-2-3 須再進一步探討。

表3-2-2 不同種類之溶劑萃取液與各成分之含量的關係表

(mg/g) 丙酮 乙酸乙酯 70

乙醚 正己烷

pH 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00

1 0 0 15.155 0 0

2 0 0

0 0

3 47.181 45.386

15.345 0

4 0 0

0 0

5 5.273 0

0 0

6 0 0

0 0

7 2.554 0

0 0

8 0 0

0 0

101

(2)不同材質之Sep-pak的探討

牡丹皮為水解性單寧由沒食子酸（galic acid）或鞣花酸（ellagc acid）與糖類及其他類似的醇類形成之聚酯類化合物，易為酸所水解[75]，

雖然之前探討萃取液以 70%甲醇，1-8 化合物含量最多，還是有 2、3、4 化合物吸收峰沒有回到基線，所以繼續討論用不同材質之 Sep-pak 的探討 (C18、C8、CM、Silica)，以 CM (結構為-CO₃^--Na⁺)過濾，1、2、3 和 6 吸 附率達 20%以下但 4、5、7 和 8 之吸附率高於 50%，C18、C8 與 Silica 是 利用極性高低不同來吸附，而以 Silica 過濾，1-8 吸附率均高於 60%，如表 3-2-3、如圖 3-2-4。所以選擇 Silica 材質為前處理之 Sep-pak。

表3-2-3不同種類之Sep-Pak與各成分之吸附率(%)的關係表

回收率 C18 C8 CM Silica

1 27.8

66.8

9.5

66.4

2 79.5

27.7

18.1

72.1

3 57.2

31.4

8.2

74.7

4 76.8

50.5

56.2

60.9

5 51.3

59.1

70.0

71.7

6 86.6

74.6

15.0

79.7

7 55.7

51.3

75.5

76.3

8 20.9

28.9

64.2

89.2

(3)不同種類之沖提液的探討

之前探討以Silica材質為前處理之Sep-pak，1-8吸附率最高，在此繼續 以不同種類之沖提液做探討。

乙酸乙酯之沖提液無法從Sep-pak中沖提出1-8化合物之含量，丙酮雖 然可沖提出1-8化合物，但回收率都在60%以下，而以甲苯為沖提液之回收 率為最高，綜合以上比較，以甲苯為Sep-pak之沖提液。結果如表3-2-4。

表 3-2-4 不同種類之沖提液與各成分之回收率(%)的關係表

回收率 丙酮 乙酸乙酯 甲苯

90% 70% 86% 72% 75% 72%

1 11% 16% * * 18% 44%

2 26% 29% * * 40% 81%

3 18% 19% * * 42% 94%

4 20% 22% * * 45% 98%

5 60% 58% * * 94% 98%

6 21% 25% * * 41% 89%

7 20% 5.7% * * 37% 80%

8 34% 37% * * 51% 99%

(*表示沒有含量)

(4)不同比例之甲苯沖提液的探討

探討以Silica材質為Sep-pak，以甲苯做為沖提液2-8回收率最高，但化 合物1之回收率只有40%。在此繼續依75%、72%、70%、67%和60%比例 之甲苯沖提液做一系列之探討。

75%甲苯沖提液只有5化合物回收率達到90%，甲苯比例降低至72%，

化合物2-8回收率80%以上，唯獨1化合物回收率50%以下，甲苯比例繼續 降低至70%，1化合物回收率到達90%，雖然化合物2-8回收率有稍微降低 但回收率都有80%以上，67%甲苯沖提液1化合物回收率81%其它回收率都 有60%以上，甲苯比例降低至60%，化合物1-8回收率全都低於50%，其結 果如表3-2-5和圖3-2-5。綜合以上討論，以70%甲苯為Silica之Sep-pak沖提 液比例。

103

表 3-2-5 不同比例之甲苯沖提液與各成分之回收率(%)的關係表

回收率 75% 72% 70% 67% 60%

1 18% 44% 90% 81% 42%

2 40% 81% 80% 61% 38%

3 42% 94% 90% 86% 46%

4 45% 98% 84% 80% 29%

5 94% 98% 89% 82% 22%

6 41% 89% 80% 70% 37%

7 37% 80% 84% 73% 19%

8 51% 99% 97% 76% 35%

mAbs

Retention (min)

圖 3-2-2 不同萃取液之牡丹皮分析圖譜【1】

(A)70%甲醇 (B)丙酮 (C)乙酸乙酯

（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）

A

B

C

105

Retention (min)

圖 3-2-3 不同萃取溶液之牡丹皮分析圖譜【2】

(D)乙醚 (E)正己烷

（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）

D

E

Retention time (min)

圖 3-2-4 70%甲醇萃取液經不同 Sep-Pak 處理之牡丹皮分析圖譜 (A) C8 (B)C18 (C)Silica (D)CM

（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）

mAbs

B

C A

D

107

A

mAbs

mAbs

Retention time (min)

圖 3-2-5 各樣品之 HPLC 層析圖 (A) 標準品 (B)70%甲醇 (C)70%甲苯*

(*是 70%甲醇萃取液再經過 Sep-pak 處理)

（成分結構圖，如圖 3-1-3 pp.69-71）

B

C

mAbs

第三節 牡丹皮單寧成分之毛細管電泳分析

3-3-1 前言

高效能液相層析（HPLC）和毛細管電泳（CE）兩分析方法有很多時 候呈現彼此互補的關係，HPLC 較利於中低極性化合物的分離，而 CE 則 適合離子和高極性化合物的分析。關於牡丹皮之定量分析方法，在本章第 一節中已利用 HPLC 分離並定量其中一些單寧成分。在本節中，將探討利 用 CE 為分析工具的可能性，並藉此比較二分析方法的優缺點及適用性。

牡丹皮單寧的藥效和成分說明如本章第一節 3-1-1 所述。本章第一節 的高效能液相層析法已成功分離牡丹皮中的八種指標成分，但所費時間冗 長（60 分鐘），故希望能開發更快速有效的方法。由該節之敘述中可得知 牡丹皮單寧的指標成分主要以醣類接沒食〈gallic acid〉居多，屬於水解型 單寧，在酸性環境下很容易水解，故考慮以微膠粒電動毛細管電泳（MEKC）

分析這些成分。

3-3-2 實驗部分

3-3-2-1 實驗藥品

1. 牡丹皮的指標成 1-8 為大仁技術學院林大禎博士提供。

2. 內標準品protocatechuic acid購自Nacalai Tesque (Kyoto, Japan)；sodium borate(Na₂B₄O₇) 購 自 Acros (New Jersey, USA) ； 界 面 活 性 劑 sodium cholate (SC)、sodium dodecylsulfate (SDS)購自Sigma (St. Louis, MO, USA)；磷酸購自Acros (New Jersey, USA)。

3. 異丙醇(isopropyl alcohol)購自Merck(Darmatadt,Germany)。

4. 配 置 樣 品 及 流 動 相 的 去 離 子 水 (deionized water) 取 自 於 Milli-Q System(Millipore, Bedford,MA,USA)。

109

3-3-2-2 實驗儀器

1. 毛細管電泳系統：Spectra PHORESIS 1000

毛細管長度及內徑：70 cm× 75 μm I.D.uncoated (J&W Scientific, USA)，分析長度70 cm，有效長度62 cm。

偵測器：on-line UV detector 210 nm 數據積分處理系統：OS/2 system

PHORESIS 1000 v1.05b PC1000

2. 酸鹼度計(pH meter)：SP 2000(Suntex Instruments Co.,LTD) 3. 高速離心計：Hettich Universal D-7200 10 mL× 12

4. 超音波震盪器：Elma Transsonic Digital

3-3-2-3 最佳分析條件

毛細管沖洗模式：

1.新毛細管使用時，要先用1 M NaOH清洗5分鐘(60℃)，再以0.1 M NaOH 5分鐘(60℃)及去離子水10分鐘(60℃)清洗毛細管，才能開始使 用。

2.每天開始實驗前，沖洗時間分別為：以去離子水5分鐘， 0.1 M NaOH 5分鐘及去離子水10分鐘沖洗毛細管。

3.在每次樣品注射前，去離子水3分鐘(30℃)，0.1 M NaOH 3分鐘(30℃) 及緩衝溶液4分鐘(25℃)。

4.在每次樣品分析後，去離子水5分鐘(30℃)，MeOH 7分鐘(30℃)及去 離子水7分鐘(30℃)。

緩衝溶液：

含20 mM SDS和25 mM硼酸鈉，以10% H3PO4調pH值至5.50的溶 液，和7%異丙醇比例混勻。

分析時間：50分鐘 電壓：25 kV 溫度：25.0℃

樣品注射模式：hydrodynamic；注射時間 3 sec。

3-3-2-4 緩衝溶液的條件選擇

(1)不同硼酸鈉濃度的探討

配製含 20mM SDS 及 15、20、25、30 和 35 mM 等不同濃度的硼酸鈉 溶液，並以 10% H₃PO₄調 pH 值至 5.50，再加異丙醇（7%,v/v ），配製成 系列緩衝溶液，以探討硼酸鈉濃度對牡丹皮單寧成分分離的影響，各緩衝 溶液重覆操作三次。

(2)不同pH值的探討

在 20mM SDS 及 25mM 硼酸鈉溶液中，分別以 10% H₃PO4調 pH 值至 4.00、5.00、5.50、6.00 和 7.00，再加入異丙醇（7%），配製成系列緩衝 溶液，以探討不同 pH 值對牡丹皮成分分離的影響，各緩衝溶液重覆操作 三次。

(3)不同比例有機修飾劑的探討

在 20mM SDS 及 25mM 硼酸鈉溶液中，以 10% H₃PO4調 pH 值至 5.50，

再加入異丙醇，依 10%、7%、5%、3.5%和 2.5%不同比例（v/v），配製成 系列緩衝溶液，以探討不同比例有機修飾劑對牡丹皮成分分離的影響，各 緩衝

溶液重覆操作三次。

(4)SDS、SC 與 pH 值三變因相關性的探討

在 25mM 硼酸鈉 SDS（20mM）及 SC（20mM）溶液中，分別加入不 等量的 10% H₃PO4調 pH 值至 4.00、5.00、5.50、6.00、6.50 和 7.00，再加 入異丙醇（7%），配製成系列緩衝溶液，以探討 SDS、SC 與 pH 值三者 對牡丹皮成分分離的影響，各緩衝溶液重覆操作三次。

(5)不同 SDS 濃度的探討

配製含 25mM 硼酸鈉及分別為 10、15、20、25 和 30 mM 等不同濃度 的 SDS 溶液，並以 10% H₃PO4調 pH 值至 5.50，再加入異丙醇（7%），

配製成系列緩衝溶液，以探討不同 SDS 濃度對牡丹皮成分分離的影響，各 緩衝溶液重覆操作三次。

111

3-3-2-5 配製標準品溶液及製作檢量線

稱取26.0 mg 的protocatechuic acid 以70%甲醇配成25 mL溶液，做為 內標準品溶液(IS)。

稱取 4,6-di-GG (1) 4.2 mg，1,2,3,6-tetra-GG (2) 4.0 mg，1,2,3,4,6- penta-GG (3) 2.3 mg， 1,3,4,6-tetra-GG (4) 3.2 mg，3,4,6-tri-GG (5) 3.7 mg，

1,3,6-tri-GG (6) 1.5 mg， 4,6-di-GG (7) 3.7 mg，1,2,6-tri-GG (8) 1.5 mg，分 別以 70%甲醇配成 10 mL 標準品母液 1-8 【

I

分別以吸量管取標準母液【

I

II

II

分別以吸量管取標準母液【

I

III

III

分別以吸量管取標準母液【

I

0.5 mL之標準品於量瓶中，各加入1.0 mL之內標準品溶液，再以70%甲醇 配成10 mL溶液。

各濃度的標準品1-8，分別在280 nm波長下，以3-3-2-3之最佳分析條件 重覆三次注射，取其平均值作檢量線。

3-3-2-6 分析條件之適宜性的評估

(1)再現性(Reproducibility)

取標準母液【

II

III

1.0 mL於量瓶中，加入1.0 mL之內標準品溶液，以70%甲醇水溶液稀釋至

10mL，作為檢液。同一天內重覆六次 ( intraday )，不同天總計重覆六次 ( interday ) 。

(2)回收率(Recovery)

精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以70%甲醇10 mL作為萃取溶劑，超音波震盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至10 mL，取5mL於10mL 量瓶，加入0.5 mL標準母液【

II

III

經 0.45μm濾膜過濾，作為檢液。以3-3-2-3之最佳分析條件重覆三次分 析，取其平均值，計算回收率。

(3)偵測極限

將各檢量線之最低濃度檢測液，逐步稀釋，每次稀釋一倍，注入分析，

直至S/N<3/1為止，計算其偵測極限。

3-3-2-7 藥材之定量分析

精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，

經 0.45μm 濾膜過濾，作為檢液。以 3-3-2-3 之最佳分析條件重覆三次分 析，取其平均值。

3-3-3 結果與討論

3-3-3-1 最佳分析條件之選擇

以本篇第二章第三節曾使用的 MEKC 條件為基礎，進行桂皮單寧之分 析方法開發，該條件用 20mM SC(sodium cholate)、25 mM 硼酸鈉溶液以 10%H3PO4配製 pH 值至 7.00 再加入異丙醇（7%）作為緩衝溶液。

發現用上述分析條件，並無法將牡丹皮之單寧 1-8 指標成分分離，由 於牡丹皮單寧為水解型化合物，在酸性溶液下易解離，修飾上述條件用

113

20mM SC(sodium cholate)、25 mM 硼酸鈉溶液以 10%H₃PO₄配製 pH 值 7.00、6.50 和 6.00 再加入異丙醇（7%）作為緩衝溶液，改變 pH 值依然無 法分離牡丹皮 1-8 之指標成分，卻發現 pH 值越小解析度越好，由於 pH 值 6.00 以下 SC(sodium cholate)會產生沉澱；用 SDS (sodium dodecylsulfate) 取代 SC，成功的將牡丹皮之單寧指標成分 1-8 分離。分析圖形如圖 3-3-7。

3-3-3-1.1緩衝溶液的條件選擇

(1)不同硼酸鈉濃度的探討

為了探討硼酸鹽濃度對牡丹皮成分分離的影響，在 20 mM SDS 中，

加入硼酸鈉，使成為 15、20、25、30 和 35 mM 等不同濃度的硼酸鈉溶液，

並以 10% H₃PO₄調 pH 值至 5.50，再加入異丙醇（7%），配置成一系列緩 衝溶液，分析結果如圖 3-3-1 及圖 3-3-2。

硼酸鈉濃度增加，會使離子強度增加，電流變大，增加 EOF 速度，減 少各成分的遷移時間；此外，當硼酸鈉濃度由 15mM 增加到 35mM 時，電 流強度會由 60μA 增加到 89μA 。

各成分的離子強度不同，往後遷移的速度亦不同，所以會造成分析物 與未知物間有所重疊；不同硼酸鈉濃度下，分析物間的解析度及理論板 數，整理如表 3-3-1 和表 3-3-2；15

mM

2/4

mM

2/4

mM

表 3-3-1 不同硼酸鈉濃度對解析度的影響 濃度

_{15 mM 20 mM 25 mM 30 mM 35 mM}

_{60 64 69 78 89}

2/4 0 0.95 2.00 0.99 0.97

表 3-3-2 不同硼酸鈉濃度與各成分 N 值(N×10⁴)的關係表 濃度

_{15 mM 20 mM 25 mM 30 mM 35 mM}

_{60 64 69 78 89}

1 3.61 5.52 6.35 3.41 3.38 2 * 4.34 6.10 3.04 4.34 3 2.88 2.68 4.74 3.34 3.78 4 * 1.65 4.52 2.81 3.92 5 1.80 3.72 3.83 3.26 3.26 6 2.69 4.03 5.33 2.10 4.13 7 3.85 2.25 6.75 2.91 2.72 8 4.96 4.88 8.46 7.68 4.68

(*為吸收峰重疊)

(2)不同pH值的探討

為了探討不同 pH 值對分析成分的影響，在 20mM SDS 及 25mM 硼酸 鈉中，分別以 10 % H₃PO4調 pH 值至 4.00、5.00、5.50、6.00 和 7.00，再 加入丙醇（7%），配置一系列的緩衝溶液。圖 3-3-3 為不同酸鹼值下，各 成分的遷移時間圖。

緩衝溶液的酸鹼值會影響醇基的解離，進而影響化合物與鹽類間的作 用力，造成不同的淌度，並使分離效果提高。由圖 3-3-3 來看，隨著 pH 值 增加，EOF 延後，會導致所有化合物的遷移時間往後延。

遷移時間延後，理論上各成分應該可以分離，但因各成分淌度不同，

往後遷移速度亦有不同，會造成解析度的差異。下表 3-3-3 可以發現，當 pH 值增加至 7.00 或 pH 值減低至 4.00 都無法分離

1-8

1-

以 pH=5.50 為最佳分析條件的酸鹼值。

115

表 3-3-3 不同 pH 值對解析度的影響

pH 值 4.00 5.00 5.50 6.00 7.00

1/7 0 0 1.08 1.17 0

2/4 0 0 2.00 0 0

2/6 0 0 4.53 2.51 0 5/8 0 1.28 1.69 1.08 0 6/8 0 0 2.49 1.84 0

(3)不同比例有機修飾劑的探討

為了探討有機修飾劑對分析成分的影響，在 20mM SDS 及 25mM 硼酸 鈉中，以 10%的 H₃PO4調 pH 值至 5.50，再加入異丙醇，依 0%、2.5%、

3.5%、5%、7%和 10%等不同比例，配成一系列的緩衝溶液，以探討有機 修飾劑對牡丹皮成分分離的影響；各分析成分在不同比例的有機修飾劑 下，遷移時間的變化，整理如圖 3-3-4。

添加有機修飾劑會增加緩衝溶液的黏滯性[90]及降低偶電層的 zeta 勢，因而降低了 EOF 速度，使遷移時間往後面延遲出現；由下表 3-3-4 當 異丙醇比例由 0%增加到 5%解析度漸增，但成分 5/8、6/8 的解析度仍差，

而異丙醇比例增加到 10%，成分

1/7

2/4

表 3-3-4 不同異丙醇比例對解析度的影響

Rs 0 % 2.5 % 3.5 % 5.0 % 7.0 % 10 % 1/7 0.91 0.96 1.14 1.12 1.08 0 2/4 0.83 0.82 0.92 0.91 2.00 0 5/8 0 0 0.74 0.82 1.69 1.13

6/8 0 0 0 0 2.49 1.98

(4) SDS和SC與pH值的探討

為了探討 SDS 和 SC 與 pH 值對分析成分的影響，在 25mM 硼酸鈉溶 液中，分別加入 SDS、SC，再用 10% H3PO4調 pH 值至 4.00、5.00、5.50、

6.00、6.50 和 7.00，再加入異丙醇（7%），配製成系列緩衝溶液，以探討

SDS 和 SC 與 pH 值對牡丹皮成分分離的影響；由下表 3-3-5 得知 pH=7.00 無法分離牡丹皮 1-8 之指標成分，卻發現 pH 值越小解析度越好，由於 pH 值 6.00 以下 SC(sodium cholate)會產生沉澱；用 SDS (sodium dodecylsulfate) 取代 SC，pH 值 5.00 以下也無法分離牡丹皮 1-8 之指標成分，綜合比較之 後取決於 pH 值 5.50 和 20 mM SDS 為最佳分析條件。

表 3-3-5 SDS 和 SC 與 pH 值對解析度的影響

SDS SDS SDS SDS SDS SC SC pH 值 4.00 5.00 5.50 6.00 7.00 6.50 7.00

1/7 0 0 1.08 1.17 0 0 0

2/4 0 0 2.00 0 0 分叉 0

2/6 0 0 4.53 2.51 0 分叉 0 5/8 0 1.28 1.69 1.08 0 分叉 0 6/8 0 0 2.49 1.84 0 分叉 0

(5)不同SDS濃度的探討

為了探討 SDS 濃度對牡丹皮成分分離的影響，在 25 mM 硼酸鈉中，

加入 SDS 配製 10、15、20、25 和 30 mM 等不同濃度的 SDS 溶液，並以 10% H₃PO₄調 pH 值至 5.50，再加入異丙醇（7%），配置成一系列緩衝溶 液，分析結果如圖 3-3-5 及圖 3-3-6。

前述實驗曾嘗試以 SC 進行分析，發現其無法分離 1-8 八種成分，因 此仍以 SDS 進行 MEKC 分析。

十二烷基磺酸鈉(SDS)為具有親水端磺酸根及疏水性長碳鏈的分子結 構，當濃度大於 8~10 mM (臨界濃度 CMC)時，則可形成膠束。膠束內部 是一疏水性內核，外部則佈滿 SO^３－離子，故為一帶大量負電的膠束，其 移動方向與 EOF 相反。當化合物的極性越小與膠束作用越強，移動速度也 就越慢。

從圖 3-3-5 及圖 3-3-6 亦可看出 SDS 濃度為 10 mM 時，完全無法分離 1-8 八種成分，這是因為界面活性劑濃度必須在 CMC 以上才能形成微膠 粒，以進行 MEKC 的分離。由圖可看出幾乎所有成分的遷移時間皆隨 SDS

117

濃度增加而增加。各成分在不同 SDS 濃度下的解析度列於表 3-3-6，SDS 濃度增加至 20 mM 時，即有不錯的分離效果，當濃度增加至 35 mM 時，

除了分析時間加長，對於分離效果幫助不大，另外，理論板數以 20mM SDS 濃度時為最佳。結果如表 3-3-7 及圖 3-3-6。綜合比較之後取決於 20 mM SDS 為最佳分析條件。

表 3-3-6 不同 SDS 濃度對解析度之影響

Rs 10 mM 15 mM 20mM 25 mM 30 mM 1/7 0 0.98 1.08 0.94 0.90 2/4 0 1.02 2.00 1.17 1.12 5/8 0 0.88 1.69 0.98 0.97 6/8 0 1.13 2.49 0.97 0.98

表 3-3-7 不同 SDS 濃度與各成分 N 值(N×10⁴)的關係表 濃度

10 mM 15 mM 20mM 25 mM 30 mM

1 0 3.31 6.35 2.96 3.28

2 0 5.02 6.10 3.55 5.95

3 0 3.59 4.74 1.92 2.95

4 0 4.45 4.52 3.04 2.60

5 0 3.11 3.83 2.72 2.72

6 0 4.80 5.33 2.55 2.62

7 0 2.71 6.75 1.88 1.56

8 0 5.73 8.46 5.16 6.52

圖 3-3-1 硼酸鹽濃度與遷移時間的關係

15 20 25 30 35 40

15 20 25 30 35

Sodium Borate conc.(mM)

Migration time (min)

1 2 3 4 5 6 7 8

119

圖 3-3-2 硼酸鹽濃度與各成分 N 值的關係圖

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

15 20 25 30 35

Sodium Borate conc. (mM)

N (theoretical plate number)x10

1 2 3 4 5 6 7 8

10 15 20 25 30 35 40

4 5 5.5 6 7

pH value

Migration time (min)

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-3-3 pH 值與遷移時間的關係

121

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

0 2.5 3.5 5 7 10

isopropanol cono.(%)

Migration time (min)

1 2 3 4 5 6 7 8

圖 3-3-4 異丙醇比例（v/v）遷移時間的關係

圖 3-3-5 SDS 濃度與遷移時間的關係

15 20 25 30 35 40

10 15 20 25 30

SDS cono.(mM)

Migration time (min)

1 2 3 4 5 6 7 8

123

圖 3-3-6 SDS 濃度與各成分 N 值的關係圖

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 15 20 25 30

SDS conc. (mM)

N (theoretical plate number)x10

1 2 3 4 5 6 7 8