第三節 牡丹皮單寧成分之毛細管電泳分析
1. 牡丹皮的指標成 1-8 為大仁技術學院林大禎博士提供。
2. 內標準品protocatechuic acid購自Nacalai Tesque (Kyoto, Japan)；sodium borate(Na2B4O7) 購 自 Acros (New Jersey, USA) ； 界 面 活 性 劑 sodium cholate (SC)、sodium dodecylsulfate (SDS)購自Sigma (St. Louis, MO, USA)；磷酸購自Acros (New Jersey, USA)。
3. 異丙醇(isopropyl alcohol)購自Merck(Darmatadt,Germany)。
4. 配 置 樣 品 及 流 動 相 的 去 離 子 水 (deionized water) 取 自 於 Milli-Q System(Millipore, Bedford,MA,USA)。
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3-3-2-2 實驗儀器
1. 毛細管電泳系統：Spectra PHORESIS 1000
毛細管長度及內徑：70 cm× 75 μm I.D.uncoated (J&W Scientific, USA)，分析長度70 cm，有效長度62 cm。
偵測器：on-line UV detector 210 nm 數據積分處理系統：OS/2 system
PHORESIS 1000 v1.05b PC1000
2. 酸鹼度計(pH meter)：SP 2000(Suntex Instruments Co.,LTD) 3. 高速離心計：Hettich Universal D-7200 10 mL× 12
4. 超音波震盪器：Elma Transsonic Digital
3-3-2-3 最佳分析條件
3.在每次樣品注射前，去離子水3分鐘(30℃)，0.1 M NaOH 3分鐘(30℃) 及緩衝溶液4分鐘(25℃)。
樣品注射模式：hydrodynamic；注射時間 3 sec。
3-3-2-4 緩衝溶液的條件選擇
(1)不同硼酸鈉濃度的探討
配製含 20mM SDS 及 15、20、25、30 和 35 mM 等不同濃度的硼酸鈉 溶液，並以 10% H3PO4調 pH 值至 5.50，再加異丙醇（7%,v/v ），配製成 系列緩衝溶液，以探討硼酸鈉濃度對牡丹皮單寧成分分離的影響，各緩衝 溶液重覆操作三次。
(2)不同pH值的探討
在 20mM SDS 及 25mM 硼酸鈉溶液中，分別以 10% H3PO4調 pH 值至 4.00、5.00、5.50、6.00 和 7.00，再加入異丙醇（7%），配製成系列緩衝 溶液，以探討不同 pH 值對牡丹皮成分分離的影響，各緩衝溶液重覆操作 三次。
(3)不同比例有機修飾劑的探討
在 20mM SDS 及 25mM 硼酸鈉溶液中，以 10% H3PO4調 pH 值至 5.50，
再加入異丙醇，依 10%、7%、5%、3.5%和 2.5%不同比例（v/v），配製成 系列緩衝溶液，以探討不同比例有機修飾劑對牡丹皮成分分離的影響，各 緩衝
溶液重覆操作三次。
(4)SDS、SC 與 pH 值三變因相關性的探討
在 25mM 硼酸鈉 SDS（20mM）及 SC（20mM）溶液中，分別加入不 等量的 10% H3PO4調 pH 值至 4.00、5.00、5.50、6.00、6.50 和 7.00，再加 入異丙醇（7%），配製成系列緩衝溶液，以探討 SDS、SC 與 pH 值三者 對牡丹皮成分分離的影響，各緩衝溶液重覆操作三次。
(5)不同 SDS 濃度的探討
配製含 25mM 硼酸鈉及分別為 10、15、20、25 和 30 mM 等不同濃度 的 SDS 溶液，並以 10% H3PO4調 pH 值至 5.50，再加入異丙醇（7%），
配製成系列緩衝溶液，以探討不同 SDS 濃度對牡丹皮成分分離的影響，各 緩衝溶液重覆操作三次。
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3-3-2-5 配製標準品溶液及製作檢量線
稱取26.0 mg 的protocatechuic acid 以70%甲醇配成25 mL溶液，做為 內標準品溶液(IS)。
稱取 4,6-di-GG (1) 4.2 mg，1,2,3,6-tetra-GG (2) 4.0 mg，1,2,3,4,6- penta-GG (3) 2.3 mg， 1,3,4,6-tetra-GG (4) 3.2 mg，3,4,6-tri-GG (5) 3.7 mg，
1,3,6-tri-GG (6) 1.5 mg， 4,6-di-GG (7) 3.7 mg，1,2,6-tri-GG (8) 1.5 mg，分 別以 70%甲醇配成 10 mL 標準品母液 1-8 【I】。
分別以吸量管取標準母液【I】中4,6-di-GG (1)6.0mL、1,2,3,6-tetra-GG (2) 6.0mL 、1,2,3,4,6-penta-GG (3) 6.0 mL為標準母液【II】，分別取標準母 液【II】5.0、3.0、2.0、1.0、0.5 mL之標準品於量瓶中，各加入1.0 mL之 內標準品溶液，再以70%甲醇配成10 mL溶液。
分別以吸量管取標準母液【I】中 1,3,4,6-tetra-GG (4)5.0mL、4,6-di-GG (7) 5.0 mL、 1,2,6-tri-GG (8) 6.0 mL為標準母液【III】，分別取標準母液【III】 4.5、3.5、3.0、2.5、1.5、0.5 mL之標準品於量瓶中，各加入1.0 mL之內標 準品溶液，再以70%甲醇配成10 mL溶液。
分別以吸量管取標準母液【I】中3,4,6-tri-GG (5) 5.0 mL 、1,3,6-tri-GG (6) 6.0mL為標準母液【IV】，分別取標準母液【IV】3.5、3.0、2.5、1.5、
0.5 mL之標準品於量瓶中，各加入1.0 mL之內標準品溶液，再以70%甲醇 配成10 mL溶液。
各濃度的標準品1-8，分別在280 nm波長下，以3-3-2-3之最佳分析條件 重覆三次注射，取其平均值作檢量線。
3-3-2-6 分析條件之適宜性的評估
(1)再現性(Reproducibility)
取標準母液【II】1.0 mL、標準母液【III】1.0 mL及標準母液【IV】
1.0 mL於量瓶中，加入1.0 mL之內標準品溶液，以70%甲醇水溶液稀釋至
10mL，作為檢液。同一天內重覆六次 ( intraday )，不同天總計重覆六次 ( interday ) 。
(2)回收率(Recovery)
精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以70%甲醇10 mL作為萃取溶劑，超音波震盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至10 mL，取5mL於10mL 量瓶，加入0.5 mL標準母液【II】、0.5 mL標準母液【III】及0.5 mL標準母 液【IV】，再加入1.0 mL之內標準品溶液，以70%甲醇水溶液稀釋至10mL，
經 0.45μm濾膜過濾，作為檢液。以3-3-2-3之最佳分析條件重覆三次分 析，取其平均值，計算回收率。
(3)偵測極限
將各檢量線之最低濃度檢測液，逐步稀釋，每次稀釋一倍，注入分析，
直至S/N<3/1為止，計算其偵測極限。
3-3-2-7 藥材之定量分析
精稱牡丹皮粉末 1.0 g，以 70%甲醇 10 mL 作為萃取溶劑，超音波震 盪 15 分鐘後離心，重覆三次，合併萃取液，濃縮至 10 mL，取 5mL 於 10mL 量瓶中，加入 1 mL 的內標準品溶液，再以 70%甲醇稀釋至 10 mL，
經 0.45μm 濾膜過濾，作為檢液。以 3-3-2-3 之最佳分析條件重覆三次分 析，取其平均值。
3-3-3 結果與討論
3-3-3-1 最佳分析條件之選擇
以本篇第二章第三節曾使用的 MEKC 條件為基礎，進行桂皮單寧之分 析方法開發，該條件用 20mM SC(sodium cholate)、25 mM 硼酸鈉溶液以 10%H3PO4配製 pH 值至 7.00 再加入異丙醇（7%）作為緩衝溶液。
發現用上述分析條件，並無法將牡丹皮之單寧 1-8 指標成分分離，由 於牡丹皮單寧為水解型化合物，在酸性溶液下易解離，修飾上述條件用
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20mM SC(sodium cholate)、25 mM 硼酸鈉溶液以 10%H3PO4配製 pH 值 7.00、6.50 和 6.00 再加入異丙醇（7%）作為緩衝溶液，改變 pH 值依然無 法分離牡丹皮 1-8 之指標成分，卻發現 pH 值越小解析度越好，由於 pH 值 6.00 以下 SC(sodium cholate)會產生沉澱；用 SDS (sodium dodecylsulfate) 取代 SC，成功的將牡丹皮之單寧指標成分 1-8 分離。分析圖形如圖 3-3-7。
3-3-3-1.1緩衝溶液的條件選擇
(1)不同硼酸鈉濃度的探討
為了探討硼酸鹽濃度對牡丹皮成分分離的影響，在 20 mM SDS 中，
加入硼酸鈉，使成為 15、20、25、30 和 35 mM 等不同濃度的硼酸鈉溶液，
並以 10% H3PO4調 pH 值至 5.50，再加入異丙醇（7%），配置成一系列緩 衝溶液，分析結果如圖 3-3-1 及圖 3-3-2。
硼酸鈉濃度增加，會使離子強度增加，電流變大，增加 EOF 速度，減 少各成分的遷移時間；此外，當硼酸鈉濃度由 15mM 增加到 35mM 時，電 流強度會由 60μA 增加到 89μA 。
各成分的離子強度不同，往後遷移的速度亦不同，所以會造成分析物 與未知物間有所重疊；不同硼酸鈉濃度下，分析物間的解析度及理論板 數，整理如表 3-3-1 和表 3-3-2；15 mM硼酸鈉濃度2/4的解析度甚差，各 種情況下，以 25mM 硼酸鈉濃度 2/4 的解析度最好；理論板數也是 25mM 硼酸鈉濃度最高，綜合比較之下，以硼酸鈉濃度為 25mM 時的解析度、理 論板數最佳。
表 3-3-1 不同硼酸鈉濃度對解析度的影響 濃度 15 mM 20 mM 25 mM 30 mM 35 mM 電流(μA) 60 64 69 78 89
2/4 0 0.95 2.00 0.99 0.97
表 3-3-2 不同硼酸鈉濃度與各成分 N 值(N×104)的關係表 濃度 15 mM 20 mM 25 mM 30 mM 35 mM 電流(μA) 60 64 69 78 89
1 3.61 5.52 6.35 3.41 3.38 2 * 4.34 6.10 3.04 4.34 3 2.88 2.68 4.74 3.34 3.78 4 * 1.65 4.52 2.81 3.92 5 1.80 3.72 3.83 3.26 3.26 6 2.69 4.03 5.33 2.10 4.13 7 3.85 2.25 6.75 2.91 2.72 8 4.96 4.88 8.46 7.68 4.68
(*為吸收峰重疊)
(2)不同pH值的探討
為了探討不同 pH 值對分析成分的影響，在 20mM SDS 及 25mM 硼酸 鈉中，分別以 10 % H3PO4調 pH 值至 4.00、5.00、5.50、6.00 和 7.00，再 加入丙醇（7%），配置一系列的緩衝溶液。圖 3-3-3 為不同酸鹼值下，各 成分的遷移時間圖。
緩衝溶液的酸鹼值會影響醇基的解離，進而影響化合物與鹽類間的作 用力，造成不同的淌度，並使分離效果提高。由圖 3-3-3 來看，隨著 pH 值 增加，EOF 延後，會導致所有化合物的遷移時間往後延。
遷移時間延後，理論上各成分應該可以分離，但因各成分淌度不同，
往後遷移速度亦有不同，會造成解析度的差異。下表 3-3-3 可以發現，當 pH 值增加至 7.00 或 pH 值減低至 4.00 都無法分離1-8的化合物，pH=5.00 的1-8 解析度都不佳，而在 pH=6.00 時 2/4 的解析度不好；綜合比較之下，
以 pH=5.50 為最佳分析條件的酸鹼值。
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表 3-3-3 不同 pH 值對解析度的影響 pH 值 4.00 5.00 5.50 6.00 7.00
1/7 0 0 1.08 1.17 0
2/4 0 0 2.00 0 0
2/6 0 0 4.53 2.51 0 5/8 0 1.28 1.69 1.08 0 6/8 0 0 2.49 1.84 0
(3)不同比例有機修飾劑的探討
為了探討有機修飾劑對分析成分的影響，在 20mM SDS 及 25mM 硼酸 鈉中，以 10%的 H3PO4調 pH 值至 5.50，再加入異丙醇，依 0%、2.5%、
3.5%、5%、7%和 10%等不同比例，配成一系列的緩衝溶液，以探討有機 修飾劑對牡丹皮成分分離的影響；各分析成分在不同比例的有機修飾劑 下，遷移時間的變化，整理如圖 3-3-4。
添加有機修飾劑會增加緩衝溶液的黏滯性[90]及降低偶電層的 zeta 勢，因而降低了 EOF 速度，使遷移時間往後面延遲出現；由下表 3-3-4 當 異丙醇比例由 0%增加到 5%解析度漸增，但成分 5/8、6/8 的解析度仍差，
而異丙醇比例增加到 10%，成分1/7、2/4解析度反而變更差；綜合以上探 討，以異丙醇 7%之比例為最佳分析條件。
表 3-3-4 不同異丙醇比例對解析度的影響
Rs 0 % 2.5 % 3.5 % 5.0 % 7.0 % 10 % 1/7 0.91 0.96 1.14 1.12 1.08 0 2/4 0.83 0.82 0.92 0.91 2.00 0 5/8 0 0 0.74 0.82 1.69 1.13
6/8 0 0 0 0 2.49 1.98
(4) SDS和SC與pH值的探討
為了探討 SDS 和 SC 與 pH 值對分析成分的影響，在 25mM 硼酸鈉溶 液中，分別加入 SDS、SC，再用 10% H3PO4調 pH 值至 4.00、5.00、5.50、
6.00、6.50 和 7.00，再加入異丙醇（7%），配製成系列緩衝溶液，以探討
SDS 和 SC 與 pH 值對牡丹皮成分分離的影響；由下表 3-3-5 得知 pH=7.00 無法分離牡丹皮 1-8 之指標成分，卻發現 pH 值越小解析度越好，由於 pH 值 6.00 以下 SC(sodium cholate)會產生沉澱；用 SDS (sodium dodecylsulfate) 取代 SC，pH 值 5.00 以下也無法分離牡丹皮 1-8 之指標成分，綜合比較之 後取決於 pH 值 5.50 和 20 mM SDS 為最佳分析條件。
表 3-3-5 SDS 和 SC 與 pH 值對解析度的影響
SDS SDS SDS SDS SDS SC SC pH 值 4.00 5.00 5.50 6.00 7.00 6.50 7.00
1/7 0 0 1.08 1.17 0 0 0
2/4 0 0 2.00 0 0 分叉 0
2/6 0 0 4.53 2.51 0 分叉 0 5/8 0 1.28 1.69 1.08 0 分叉 0 6/8 0 0 2.49 1.84 0 分叉 0
(5)不同SDS濃度的探討
為了探討 SDS 濃度對牡丹皮成分分離的影響，在 25 mM 硼酸鈉中，
加入 SDS 配製 10、15、20、25 和 30 mM 等不同濃度的 SDS 溶液，並以 10% H3PO4調 pH 值至 5.50，再加入異丙醇（7%），配置成一系列緩衝溶 液，分析結果如圖 3-3-5 及圖 3-3-6。
前述實驗曾嘗試以 SC 進行分析，發現其無法分離 1-8 八種成分，因 此仍以 SDS 進行 MEKC 分析。
十二烷基磺酸鈉(SDS)為具有親水端磺酸根及疏水性長碳鏈的分子結 構，當濃度大於 8~10 mM (臨界濃度 CMC)時，則可形成膠束。膠束內部 是一疏水性內核，外部則佈滿 SO３－離子，故為一帶大量負電的膠束，其 移動方向與 EOF 相反。當化合物的極性越小與膠束作用越強，移動速度也 就越慢。
從圖 3-3-5 及圖 3-3-6 亦可看出 SDS 濃度為 10 mM 時，完全無法分離 1-8 八種成分，這是因為界面活性劑濃度必須在 CMC 以上才能形成微膠 粒，以進行 MEKC 的分離。由圖可看出幾乎所有成分的遷移時間皆隨 SDS
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濃度增加而增加。各成分在不同 SDS 濃度下的解析度列於表 3-3-6，SDS 濃度增加至 20 mM 時，即有不錯的分離效果，當濃度增加至 35 mM 時，
除了分析時間加長，對於分離效果幫助不大，另外，理論板數以 20mM SDS 濃度時為最佳。結果如表 3-3-7 及圖 3-3-6。綜合比較之後取決於 20 mM SDS 為最佳分析條件。
表 3-3-6 不同 SDS 濃度對解析度之影響 Rs 10 mM 15 mM 20mM 25 mM 30 mM 1/7 0 0.98 1.08 0.94 0.90 2/4 0 1.02 2.00 1.17 1.12 5/8 0 0.88 1.69 0.98 0.97 6/8 0 1.13 2.49 0.97 0.98
表 3-3-7 不同 SDS 濃度與各成分 N 值(N×104)的關係表 濃度 10 mM 15 mM 20mM 25 mM 30 mM
1 0 3.31 6.35 2.96 3.28 2 0 5.02 6.10 3.55 5.95 3 0 3.59 4.74 1.92 2.95 4 0 4.45 4.52 3.04 2.60 5 0 3.11 3.83 2.72 2.72 6 0 4.80 5.33 2.55 2.62 7 0 2.71 6.75 1.88 1.56 8 0 5.73 8.46 5.16 6.52
圖 3-3-1 硼酸鹽濃度與遷移時間的關係
15 20 25 30 35 40
15 20 25 30 35
Sodium Borate conc.(mM)
Migration time (min)
1 2 3 4 5 6 7 8
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圖 3-3-2 硼酸鹽濃度與各成分 N 值的關係圖
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
15 20 25 30 35
Sodium Borate conc. (mM)
N (theoretical plate number)x104
1 2 3 4 5 6 7 8
10 15 20 25 30 35 40
4 5 5.5 6 7
pH value
Migration time (min)
1 2 3 4 5 6 7 8
圖 3-3-3 pH 值與遷移時間的關係
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20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
0 2.5 3.5 5 7 10
isopropanol cono.(%)
Migration time (min)
1 2 3 4 5 6 7 8
圖 3-3-4 異丙醇比例（v/v）遷移時間的關係
圖 3-3-5 SDS 濃度與遷移時間的關係
15 20 25 30 35 40
10 15 20 25 30
SDS cono.(mM)
Migration time (min)
1 2 3 4 5 6 7 8
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圖 3-3-6 SDS 濃度與各成分 N 值的關係圖
圖 3-3-6 SDS 濃度與各成分 N 值的關係圖