利用分子生物的技術檢測環境中的微生物，其中的優點為不需經 過長時間的培養與分離過程，即可快速檢測環境中的微生物，並且對 於環境中數量較少的微生物族群亦可偵測(Stahl et al., 1985)。
近年來分子生物技術利用微生物特定的DNA 分子序列分析，而 不需要經過傳統方法培養，有效減少在微生物培養上所花費的時間與 人力；且相對培養出的細菌種類可提供更多完整的微生物菌相，有利 於直接進行環境微生物菌相與菌種鑑定分析及研究；而運用在微生物 多 樣 性 的 分 子 生 物 技 術 如 下 列 ： 逢 機 複 製 多 型 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) (Williams et al., 1990) 、 DNA-DNA hybridization (Gellego et al., 2005)、限制片段長度多型性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) (Botstein et al., 1980)、變性梯度膠體電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) (Muyzer et al., 1993)、Nested PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Shabir et al., 2005) 、 增 殖 片 段 長 度 型 (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) (Blears et al., 1998)、Horizontal fluorophore-enhanced repetitive extragenic palindromic-PCR (HFERP)及 DNA fingerprint analysis (Satoshi et al., 2005)等。
並且利用這些分子生物技術直接萃取環境中微生物DNA 來分析 水中微生物的多樣性(Bano et al., 2000; Gich et al., 2001; Hollibaugh et al., 2002)以及對於環境微生物生態的探討(van Elsas et al., 1997)等；而 Emtiazi et al., (2004)從淨水系統不同位置取出生物膜(biofilm)之菌相
族群，在以聚合酶鏈鎖反應(PCR, Polymerase Chain Reaction) 及變性 梯度膠體電泳(DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis)進行分 析，結果顯示不同水廠形成之生物膜DNA 片段之型態由所不同。
分子生物技術已被廣泛地應用在環境微生物族群結構的研究，而 目前得以探知最為完整菌相結構的分子生物技術為 PCR-DGGE 法；
從自然環境中取得樣品，並進行菌相檢測，例如:環境樣品經由微生 物 genomic DNA 的萃取後，透過聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)將微生物物種的 16S rDNA 基因中的變異區段的序列 進行大量的複製，因此能獲得許多不同16S rDNA 基因序列片段；再 利 用 變 性 梯 度 膠 體 電 泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)來分離各 16S rDNA 基因片段中分子量大小相同，但序列組 成或排列不同的核苷酸序列。變性梯度膠體電泳原是一種用來檢測 DNA 內鹼基對多樣性的方法，最早的技術主要運用於醫學研究為主 (Fischer et al., 1979)，因經過修正與改良並將實驗原理運用在微生物 族群的分析研究上(Muyzer et al., 1993)。
(一) 16S rDNA 的特性與應用
依照傳統方式培養的菌種分類方法，通常只是利用其外觀、生理 以及其生化代謝路徑來做區分。由於目前分子生物學的進步，演化分 類學轉變為由基因的觀點來作基礎，不管是微生物或是動植物的分 類，在根據基因作演化分類時，都必須選擇一段基因來當做親源演化 的標記(phlogenetic marker)，親源演化的標記是必須同時存在於各物 種中，且具同源性和安定性，而作為標記的分子大小必須適當，分子 太小則無法顯示出差異，分子太大則不利於定序與分析比較(Woese et al., 1987)。
目前在微生物演化分類上最常用的片段就是16S rDNA 基因，此 段基因在序列上是由高度保留區域與高度變異區域所組成，且 16S rDNA 是原生生物內特有的基因，其轉錄、轉譯後的產品為核糖體的 小次單元體(small subunit)的組成成分之一，是核糖體合成蛋白質時辨 認及容納tRNA 的場所；因具演化上獨特的優點，己被科學界廣泛的 研究(Muyzer and Ramsing, 1995)。而 16S rDNA 具有以下幾點特點：
(1)普遍性(universe)：主要產物為構成核糖體的成分，因此存在於各 原核生物體之中；(2)高度保守性(highly conservation)：16S rDNA 非 常地保守，在演化的過程中，變異度不大且變異速度穩定，非常適合 作為演化上的【分子時鐘】；(3)16S rDNA 基因長度約具有 1542 bp 核 酸 序 列 ， 其 複 雜 程 度 足 以作 為鑑定與 分類的 依據(Brosius et al., 1978)；(4)16S rDNA 基因不會像質體中的基因能互相轉換，所以各 物種中都具有自己的獨特序列(Muyzer et al., 1995)；(5)經由學者的廣 泛研究，已經建立起16S rDNA 相當完備的基因資料庫(Maidal et al., 1994)，因此可以透過網路提供序列分析比對，只要將某部分的 16S rDNA 序列送上網路，經基因資料庫做比對，便可將此物種加以鑑定 與分類。
(二) 聚合酶連鎖反應(PCR)
PCR 之原理為利用耐高溫菌的 DNA 聚合酵素(Taq polymerase) 耐高溫的特性，配合特殊設計的引子(primer)，經由溫度循環來控制 酵素反覆發揮活性的過程，來大量複製某一目標 DNA 序列。PCR 過 程反應之過程如圖 9 所示，而每一循環包括三個不同溫度的步驟如 下：(1)Denaturation：把模板 DNA 加熱，使雙股變單股，變性而分開 形成兩條單股的DNA；(2)Annealing：使用人工合成一對引子將溫度 下降到 Annealing 的溫度，使引子能與模板 DNA 互補結合上，而引 子的設計就是讓我們挾出我們要分析的特定DNA 片段，正確地複製 出來；(3)Extension：在 Taq DNA 聚合酶的最適溫度下，以 4 種 dNTP (dATP、dGTP、dCTP、dTTP)為原料，利用 DAN 模板及 2 個引子進 行DNA 的複製延伸，引子會沿著單股 DNA 以 5＇到 3＇的方向聚合 延伸，形成新的雙股 DNA，如此便完成一個循環。經由三個主要步 驟，稱為一個循環，並進行倍增放大，而完成n 個循環後，則目標序 列被放大(1+m)n倍。此方法可將在自然環境中極少量的目標 DNA 序 列經過此系列反應後，使得原本難以分析的微量DNA 序列能夠放大 而以上之三步驟過程會重複25-40 回(張建裕、張建國, 2004)。
圖9 增殖反應示意圖(http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/docs/cotton/) (三) 變性梯度膠體電泳(DGGE)
一般的 DNA 片段，大多利用基本的 Agarose 電泳的方式來分離 各種不同分子量大小的片段，卻無法分離分子量相同但序列組成不同 的DNA 片段，然而 DGGE 卻可以辦到，以 500 bp DNA 序列而言，
即使只有單一鹼基對(base pair)的組成不同也能夠鑑別，其準確度可 達到 98%以上，其中鑑別突變株的能力遠比直接定序來的高且敏銳 (Barbara et al., 1999)。
DGGE 主要分離原理，是利用 urea 及 formamide 兩種變性物質製 造一由低至高濃度的變化來建立梯度，用來分離各不一樣序列的基因 片段；由於變性物質的作用，膠體上進行電泳的雙股DNA 序列便會 產生部分變性，DNA 序列變性的程度與 melting point (Tm)有關；一 般而言，含有較高 G+C 鹼基對比例的序列有較高的 Tm 值，不同的 DNA 序列會有不同的 Tm 值，低 Tm 值的 DNA 序列會在低濃度的 變性物質作用下即產生變性(形成 partial single strand)，而高 Tm 值的 DNA 序列則必須在高濃度的變性物質作用下才會產生變性。隨著加 入各種不同的DNA 序列，各部分變性解離的程度也不相同，因此在 變性梯度膠體電泳中的移動速度也有所不同，使得部分變性的 DNA 會在相同時間內在膠體上跑出不同的距離(Muyzer et al., 1993)，如此
便可將分子量大小相同但序列組成或排列卻不同的DNA 基因片段給 分開；分離後的16S rDNA 片段可進行定序，便可進一步與資料庫中 的菌種進行比對並鑑定出菌種。此種技術分析環境中的微生物種類，
不僅克服傳統菌種培養技術裡無法培養環境中大部分微生物的瓶 頸，更加縮短了研究的時間，大大提高了時效性，因此被廣泛的使用 在分析環境微生物相及生態的研究上(Smalla et al., 2001)。