在 總 菌 及 活 菌 數 方 面 本 研 究 參 閱 Cappelier et al.(1997) 與 Schwartz et al.(1998)等研究者之作法並修正如下：取適當之水樣與 CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride, Polysencieses, Germany) 先進行混合，於室溫下暗室培養 2 小時，並控制混合後之 CTC 濃度
為5 mM，取暗室培養過後之混合液以 0.2μm 黑色的碳酸纖維膜過濾 (polycarbonate, DMF, ref. 111156, Millipore, USA)，以無菌稀釋水 50 mL，沖洗及過濾上述濾膜兩次。並將 5μg/mL DAPI 染劑，覆蓋在濾 膜表面染色5 分鐘，再進行過濾動作將 DAPI 染劑去除，將濾膜放至 已備妥之無菌培養皿內部之 DAPI 染劑上，靜置培養 5~10 分鐘，之 後 並 取 出 濾 膜 至 於 載 玻 片 上 ， 於 配 有 兩 組 UV-2A(UV-2A(EX 330~380 nm, DM 400 nm, BA 420 nm)及 G-2A(EX510~560 nm, DM 575, BA 590 nm)濾光片之直立式螢光顯微鏡下觀察，利用透過 CCD 影像擷取器 (Evolution VF colled color, MediaCybernetics, USA)擷取 目鏡視野中影像，利用處理軟體(Image ProPlus 5.0, MediaCybernetics, USA)擷取目鏡視野中影像，並利用影像處理軟體進行總菌(藍色)及 活菌(紅色)之觀測及計數。計數公式如下：
cells=CCD 擷取視野之總菌落數
162×121(μm)=CCD 擷取視野之面積(μm2) 9.6×108=樣本之過濾有效面積(μm2)
X=過濾樣本菌液之體積 cells/mL=單位體積之總菌數
(二) 電子顯微鏡( Scanning Electron Microscope, SEM)
先將要拍攝之樣本以 0.2 μm 之 Nylon 濾膜(Nylon membrane filters, whatman, England)進行過濾取得菌樣，進行固定之動作再將樣 本放入磷酸緩衝溶液中( pH=7.0)浸泡 10-15 分鐘，倒掉後接著放入 2.5
% 戊二醇固定液中，置入 4℃冰箱 12-16 小時，去除 2.5%之戊二醇 再以磷酸緩衝溶液中( pH=7.0)浸泡 10-15 分鐘，去除後，接著以 90、
95 %之酒精浸泡清洗一次(每次約 30 分鐘)，最後以絕對酒精(酒精純 度為99.8 %)浸泡 3 次(每次 30 分鐘)，接著將樣本取出放置冷凍乾燥 機(FDU-2100, EYELA, Japan)中 24 hr，能使脫水之效果更優化，並且
mL cells mL
X m m cells
/ 稀釋倍數
10 6 . ) 9 ( 121 162
8 2
2
可以使鍍金及拍攝效果提高，冷凍乾燥後將樣本取出放置於真空盒，
並放入乾燥箱(CF-78, iBox, Taiwan)避免濕氣導致樣本潮濕。
(三) DNA 之萃取
萃取以採取酵素法為主(Bano et al., 2002)，是利用 lysozyme 及 Proteinase K 酵 素 作 用 將 水 中 的 微 生 物 細 胞 打 破 ， 接 續 利 用 Phenol-Chloroform 法將 DNA 與其他蛋白質等雜質給分離開來及純 化(Watanabe et al., 2000)。
取自來水水樣，利用0.2 μm 孔徑的過濾膜，經由抽氣過濾的方 式，使水樣品中的微生物停留在 0.2 μm 的濾膜上，進而將水中的 微生物收集起來(Watanabe et al., 2000; Sekiguchi et al., 2002)。加入 480μL lysis buffer 沖洗濾膜，目的使樣品均勻懸浮，隨後加入 20μL lysozyme(working conc.= 2 mg/mL)，於 37℃作用 30 分鐘後，陸續加 入 67μL lysis buffer，30μL 10% SDS (工作濃度(working conc.)=
0.5%)，3μL Proteinase K(工作濃度=0.1 mg/mL)，此時總體積為 600 μL，混合均勻後 37℃作用 1 小時。加入 100μL 5M NaCl，均勻混 合後再加入80μL CTAB，反複以手輕搖均勻，於 65℃反應至少 10 分 鐘。於抽氣櫃下方加入等體積之C. I. 溶液，vortex 30 秒，使溶液呈 現均勻混濁後離心 (12,000 rpm, 4℃,15 分鐘)，取上清液至新微量離 心管。加入等體積之 P.C.I. 溶液進行萃取，vortex 30 秒，使溶液呈 現混濁後離心(12,000 rpm, 4℃,15 分鐘)，取上清液至新微量離心管。
(於低溫試驗)以 0.6 倍體積之 Isopropanol 進行沉澱反應，並來回翻 轉離心管數次。於高速離心機(Z233MK-2, HERMLE, Germany) 進行 12,000 rpm, 4℃,15 分鐘，後去除上清液，以 70%酒精(1 mL)清洗沉 澱物，並來回翻轉後離心(12,000 rpm, 4℃,15 分鐘)。除去酒精後置於 無菌操作台，開啟抽氣開關使殘餘酒精揮發 2 小時以上。接著加入 無 菌 水 約 100 μL 溶 解 30 分 鐘 以 上 ， 在 置 於 -20℃ 之 恆 溫 箱 (FFU-2064, Frost Free, USA)下保存。
(四) 利用 PCR 增殖 16S rDNA 片段
PCR 反應器為 PCR Express Thermal Cycle(Bio-Rad My Cycler,
Bio-Rad, USA)。PCR 反應試劑為 2.0× Tag Master Mix RED (Ampliqon liqon Ⅲ)，其內容量包括 PCR buffer(含 150 mM Tris-HCl pH8.5、40 mM (NH)4SO2、4.0 mM MgCl2、0.2% Tween 20，pH＝8.5、0.4 mM dNTPs mixture、0.05 unit/μL Ampliqon Taq DNA polymerase 及 red dye)。操作過程中，在總體積 50 μL 的 PCR 反應試劑中，包含 Template DNA 約 1 μL、25 μL Taq Master Mix RED 及各 0.5 μL forward-primer 與 reverse-primer，最後利用滅過菌的 d.d. H2O 將體積 加至 50 μL。以上全部的步驟皆必須在無菌操作檯中完成，避免使 PCR 反應試劑遭受污染，而影響 PCR 產物的正確性，而 PCR 反應 溶液比例如表5 及 PCR 反應條件如表 6。
利用細菌16S rDNA 核酸序列中，具有保留性高的變異區特性，
來設計本實驗中的 primer。將細菌 16S rDNA 基因中第 968 至 1401 個核甘酸間序列的V6-V8 region，進行大量複製，產生分子量大小約 473 bp(包括 GC clamp 部分)的目標 DNA 片段。
Forward 968 FGC 序列：
5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG AACGCGAAGAACCTTAC-3' （with GC clamp）
Forward 968 序列：5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3' Reverse 1401R 序列：5'-GCGTGTGTACAAGACCC-3
表 5 PCR 反應溶液
添加試劑 添加體積 (μL) 最終濃度
Taq Master Mix RED
25 1XPrimer A (forward) 0.5 100 nM Primer B (reverse) 0.5 100 nM
Template DNA 1 ---
無菌水 23 ---
總體積 50
表6 PCR 反應條件
Temperature Time Cycle number Reaction Stage 1 95℃ 3 min 1 cycle denaturing
95℃ 1 min denaturing
46℃ 1 min anneling
Stage 2
72℃ 1 min
30 cycle
extension Stage 3 72℃ 5 min 1 cycle extension Stage 4 4℃ ∞ min 1 cycle storage
(五) Agarose Gel Method
平均每塊瓊酯電泳製作取0.5 g agarose powder，加入 25 mL 的 1×TAE buffer，1×TAE buffer 是由 50×TAE (242 g Tris base、57.1 mL glacialacetic acid 及 100 mL 0.5×EDTA pH 8.0)稀釋 50 倍而成。以微 波爐加熱完全溶解至沒顆粒狀物質，將液態瓊脂膠體等待至徒手可拿 取之溫度，即可倒入電泳膠體模型中，利用毛細Tip 將氣泡去除，凝 固 後 放 置 於 1×TAE buffer 的 水 平 式 電 泳 槽 中 (MJ-105-S, Major Science, Taiwan)。將 DNA extract solution 與 loading dye (6X) 均勻混 和後注入瓊脂膠體的凹槽中，以 100 伏特電壓進行 25 分鐘電泳。將 agarose gel 放置到 0.5 μg/mL EtBr(ethidium bromide)溶液中染色。利 用核酸會與螢光染劑 EtBr 鍵結，且 EtBr 會吸收 254 nm 與 312 nm 波長的紫外光，所以置於UV 電泳照膠系統((DGIS-8, TOP BIO CO, Taiwan)，可觀察是否有 genomic DNA 亮帶出現。
(六) 膠體中 DNA 回收純化
本 實 驗 之 方 法 為 購 買 Protech Technology 所 販 售 之 Gene-SpinTM 1-4-3 Extraction for Gel Extraction Flow Chatr 之方法進 行純化；其步驟先將切下之膠體以每100 mg + 100 μL Binding Buffer 進行水域加熱 60℃ 5~15min，接著取出 700 μL 加到 Column 再套上 Collection Tubes 以轉速 12,000~14,000 rpm 進行離心 1 min，再將離 心液倒掉，再加入500 μL Binding Buffer 以相同方式離心，離心後將
離心液倒掉，再加入700 μL Washing Buffer 以相同方式離心，再將 離心液倒掉，並持續以相同方式離心時間增加為3 min，離心後將離 心液倒掉，並且於37~60℃烘箱放置 5 min，再加入 30~50 μL Elution Buffer/ddH2O，以相同方式離心，時間為 1 min，離心後將 Column 丟 棄，將離心液放置於 -20℃保存。
(七) 變性梯度膠體電泳
本實驗以Bio-Rad 「The DCodeTM Universal Mutation Detection System」及「Model 475 Gradient Delivery System」作為進行與凝膠製 程 之 設 備 。 凝 膠 設 置 條 件 為 6% polyacrylamide (base pair separation:300-1000 bp) ， 凝 膠 之 中 具 有 30%-60% 變 性 梯 度 (urea/formamide)而膠體配置條件如表 7、8。將純化後的 PCR 的產物 加入變性梯度膠體中，進行變性梯度膠體電泳。
表7 梯度膠體配置
Percentage(%) Acrylamide/Bis40 (mL)
50X TAE buffer (mL)
Formamide
(mL) Urea (g) D.D. H2O (mL)
30 2.4 0.32 1.92 2.016 To 16
40 2.4 0.32 2.56 2.688 To 16
50 2.4 0.32 3.20 3.360 To 16
60 2.4 0.32 3.84 4.032 To 16
*上述均加入 160 μL TEMED
*配製方式：Acrylamide/Bis→TAE buffer→Formamide→Urea→D.D.H2O
表 8 底膠配製表
Percentage (%) Acrylamide/Bis40(mL)
50X TAE buffer
(mL) Formarmide (mL) Urea (g) D.D. H2O (mL)
60 3.0 0.40 4.80 5.040 To 20
*抽取 4 mL 做為底層之膠體
*底層膠體加入 40 μL 的 APS 及 10μL 的 TEMD
*剩餘之 16 mL 作為高濃度之梯度使用
當進行變性梯度膠體電泳時首先須開啟電泳槽之加熱系統，將水 槽中的running buffer (1x TAE buffer) 預熱達到溫度 65 ℃，如此才能 使DNA 在電泳進行的過程中達到穩定溫度的梯度變性效應，隨後將 液體循環系統(perist)啟動，將凝固的膠體及框架放入電泳槽中，並隨 後將經純化後之PCR 產物與 loading dye(6x)均勻混和，約 24μL 緩慢 注入膠體上的凹槽中，以電壓 60 volt，溫度 65 ℃條件下進行電泳 14 個小時。
(八) SYBR green I 染色與膠體拍攝與分析統計
在一般普遍的DNA 染劑的偵測靈敏度高低而言，SYBR green Ⅰ 的靈敏度較優於 Silver staining 與 Ethidium bromide，故本實驗採取 SYBR greenⅠ螢光染色的方式 (Bano et al., 2002; Seghers et al., 2004)。將變性梯度膠體於電泳系統中取出，放置於平底盤中，用滅 菌二段水作初步清洗，隨即進行 SYBR greenⅠ螢光染色，將變性梯 度膠體放入150 ml 1X TAE buffer solution 中，加入 10 μl SYBR greenⅠ (amresco) ， 使 用 平 板 振 盪 器 (SB-9D, SECIENTIFIC CO, HIPOINT)以 150 rpm 轉速，搖晃反應 1 個小時。再進行 SYBR green I 進行染色時必須以避光處理。染色完畢利用螢光偵測系統，進行螢 光激發與影像攝取，並且使用套裝軟體Quantity One Version 4.5(網路 試用版)，進行 DGGE 電永圖上的條帶影像的定位與統計分析(Röing et al., 2001；Boon et al., 2002)。
(九) Ligation
本 實 驗 所 使 用 之 載 體 材 料 為 yT&A Cloning Vector Kit QC Report，內含有 yT&A® cloning vector (25 ng/μL)、10X Ligation Buffer A、10X Ligation Buffer B 及 YEA T4 DNA Ligase (2 unit/μL)。依照內 附之 Protocol 進行添加如表 9 並以 Tip 混合均勻，接著在先在 22℃
下反應20 分鐘，再以 65 度水域下進行 10 分鐘反應。
表9 Method of ligation 混合表 Background
Control (μL)
Self-ligation Control(μL)
Positive Contorl(μL) yT&A® cloning vector (25 ng/μL) 2 2 2
10X Ligation Buffer A 1 1 1
10X Ligation Buffer B 1 1 1
Control Insert DNA (10 ng/μL) 0 0 3
YEA T4 DNA Ligase (2 unit/μL) 0 1 1
Deionized Water (無菌水) 6 5 2
Total Volume 10 10 10
(十) Transformation
在進行實驗前需先Make LB ampicillin plates，首先 Agar 15g/L、
LB broth 25g/L 並加入適當之無菌水及一顆磁石，接著放入滅菌釜中 進行滅菌，待溫度約降至手可拿取，再加入Ampicillin 100 μg/mL 並 以磁石攪拌器進行攪拌均勻，接著將培養基倒入置培養皿中，等凝固 後則可進行 Transformation 步驟，則先取 2 μL 的 Ligationru 加入 Competent cells 中並放置在碎冰上，而此時 LB ampicillin plate 需先以 IPTG(0.1M) 40μL 再以 X-gal(100 mg/mL) 40 μL 於培養基上進行塗 抹，接著從Competent cells 內取 50-100 μL 加至培養基上進行塗抹，
再放入恆溫培養箱(OSI-500R，TKY，Taiwan)以 37 ℃ 進行 13-17 hr 之培養，培養過後挑選出 LB plate 內的白色菌落，並以 1401 R 及 968 兩組Primer 進行 PCR 檢驗 DNA 片段。
(十一) 菌相序列之比對
訂序之樣本需要 100 μL 以純化之樣本，則 Primer 濃度則為 10 μM、體積為 10 μL 並以冷凍寄至波仕特生技股份有限公司，並從各 DGGE 片段形成之 Plasmid 所得到的定序結果，參照 pGEM®-T Easy Vector 的說明，而從定序結果中所得到 Vector 本身之序列去除，即 為 DGGE 中各菌種之片段，並透過網路之 16S rDNA 資料庫進行各
片段之菌種比對，可依其所得之親緣性較高之菌種，因而得知最相 近之菌種名稱。
六、 化學性參數分析
(一) 非揮發性之溶解性有機碳(NPDOC)
本實驗主要以總有機分析儀測定分析有機物之含碳量，不同性質 之樣本需以該樣有機碳(Organic Carbon, OC)儲備溶液進行檢量線配 製 ， 原 水 之 樣 品 必 須 以 KHP (C8H5KO4)、醋酸鈉試程以醋酸鈉 (CH3COONa)及草酸鈉試程則以草酸鈉(C2NaO4)，再以有機碳儲備溶 液配製成ㄧ系列的檢量線濃度，製作完成檢量線 R 值需達 0.995 以上 方可進行樣本分析。
原水之採樣後，便立即以過濾方式去除水中的雜質，其步驟首先 以GF/A 濾紙先行以 1.6 及 0.7µm 之孔徑初濾，之後並分別以 0.45 及 0.20 µm (cellulose acetate, MFS, USA )細濾後，便立刻將樣本以高純氮 氣加以曝氣，直至 5-10 分鐘後，即可將水樣以人工方式放入 TOC 測 定儀(Multi N/C 3000, Analytik Jena AG, Germany)之吸取位置，水樣並 經由吸取器，注入裝填有高感度觸媒(Cerium Oxide, Merck, Germany) 之高溫爐中，在 850℃下與氧氣反應生成 CO2，並藉載流氣體攜帶CO2
流經無機碳反應器及除濕、降溫與乾燥，最後 CO2 送至非分散紅外 線吸收偵檢器(Non-dispersive Infrared Absorption Detector)中並配合由 一系列適當濃度之總碳(Total Carbon, TC)標準溶液所得之檢量線，而 測定出水樣之TC 量，及為 NPDOC 值(mg/L)。
(二) 有機物分子量大小
分 子 量 之 定 性 參 閱 修 正 Toda et al.(2000) 之 研 究 ， 以 HPLC(pump L-2130, HITACHI, Japen)配合 ELSD 偵檢器(evaporized light scattered detector,ELSD)(Model 200, SofTA, USA)進行有機物分 子量之測定，將Sigma Aldrich—Fluka (0.5~42×104) 做為標準品，依 照不同偵測感度配製不同濃度之標準品。分析管柱使用 TSK-gel GMPWXL(7.8x300 mm)，移動相為經過濾後之純水，分析流速 1.5
mL/min，DT (Drift Tube)：50 ℃；SC (Spray Chamber)：10 ℃，注入 體積100 μL，分析時間設定 12 min，並利用 peak ABC 數據解析軟 體，進行分子量測定。
(三) 醣類
參閱Nogueira et al.(2005)醣類分析方法，以 HPLC(pump L-2130, HITACHI, Japen) 配 合 ELSD 偵 檢 器 (evaporized light scattered detector，ELSD)(Model 200, SofTA, USA)進行醣類之測定，標準品為 從 Sigma 購 置 之 棉 子 糖 (Raffinose) 、 半 乳 糖 (Galactose) 、 麥 芽 糖 (Maltose)、蔗糖(Maltose)、鼠李糖(rhamnose)、葡萄糖(Glucose)，依 照不同偵測感度配製不同濃度之標準品。分析管柱使用SUPELCOSIL LC-NH2 (5 μm, 250 x 4.6 mm, SUPELCO, USA)，移動相為經過濾後 之乙腈：水=75：25，分析流速 1.0 mL/min， Drift Tube (DT)：60 ℃；
Spray Chamber (SC)：45 ℃，注入體積 100 μL，分析時間設定 60 min，
並利用peak ABC 數據解析軟體，進行醣類測定。
(四) 胺基酸
以HPLC(high performance liquid chromatograph)配合以光二偶極 陣列偵測器(diode array detector, DAD) (楊雅雯, 2004)進行水中胺基 酸測定之研究，流洗液與試劑混合主要參考 Metaxatosa et al. (2003) 之方法進行，流洗條件主要修正Molnár-Perl et al.(2000; 2003)之方法。
以 HPLC-DAD 系統進行測定。管柱為 Agilent HC-C18 (4 μm, 250×4.6 mm, Agilent Technologies, U.S.)及偵測器為 Diode Array detector 進行分析，波長設定為 334 nm 進行測定。其中流洗液 A((0.025 M Sodium acetate)緩衝溶液(pH=5.17)，含 3％THF))需以 0.2 μm 濾膜過濾，及去氣體 30 min。流洗液 B 為 HPLC 級甲醇，樣本流 入體積為100 μL，並以線性梯度控制 Mobile phase 混合比例與流量 如表10。
表10 梯度與流洗液配比與流速條件
停留時間 A (%) B (%) Flow (mL)
0 100 0 0.8
10 82 18 0.8
20 70 30 1.1
30 55 45 1.2
40 40 60 1
50 30 70 0.95
OPA 溶液配製，則取 50 mg OPA 溶於 50 µL HPLC 級之甲醇後，
再加25 µL 之 2-mercaptoethanol，最後加入含 4.45mL 之 borate buffer 容器(6~8 mL 之琥珀色之容器裝)；關於 borate buffer 之配製為取以 6N KOH 調整 pH 值至 10.5 之 0.8 M 硼酸(Boric acid)。而 OPA 需當 日配製，並儲存於冰箱且避光，之後取60 µL OPA 溶液及 100 µL 緩 衝溶液(1：1 0.1M CH3COONa(pH=4.11)及流洗液 A，加入 1 mL 經水 解過濾之樣本，混合 5 min，即可注入 HPLC 系統進行測定。本研究 選用之標準品為 Sigma 公司生產，包括 Leucine、Aspartic acid、
trans-4-Hydroxy-L-proline、Asparagine、Alanine、Isoleucine、Valine、
Cystine 、 Threonine 、 Lysine monohydro-chloride 、 Cysteine hydrochloride 、 Arginine monohydrochloride 、 Phenylalanine 、 Methionine 、 Glycine 、 Serine 、 Histidine monohydro 、 Tyrosine 、 Glutamine、Glutamic acid、Proline 與 Tryptophan。
而混合標準品之層析圖譜如圖 13 所示。物種出現順序依序為 Aspartic acid (13.15 min)、Asparagine (18.83 min)、Glutamine (19.47 min)、Serine (22.21 min)、Arginine monohydrochloride (27.09 min)、
Threonine (27.84 min)、Alanine (32.53 min)、Tyrosine (33.44 min)、
Methionine (41.79 min)、Valine (42.75 min)、Phenylalanine (43.84 min) 、 Isoleucine (46.88 min) 、 Leucine (47.95 min) 、 Cysteine hydrochloride (50.67 min)及 Lysine monohydrochloride (54.16 min)，其 中 之 Trans-4-Hydroxy-L-Proline 、 Cystine 、 Glycine 、 Histidine
monohydrochloride、Glutamic acid、Proline 及 Tryptophan 於此 HPLC 條件下，無法有效分離。
圖13 混合標準品之層析圖譜(波長：334 nm)；(1) Aspartic acid；(2) Asparagine；(3) Serine；(4) Glutamine；(5) Arginine；(6) Threonine；
(7) Alanine ； (8) Tyrosine ； (9) Methionine ； (10) Valine ； (11) Phenylalanine；(12) Isoleucine；(13) Leucine
檢量線之製作，配製不同濃度之混合標準品與OPA 進行衍生後，
進行胺基酸混合標準品之測定，胺基酸標準品檢量線彙整於表11。
表11 胺基酸標準品檢量線濃度、對應停留時間及 R 值
偵測Height 值 (μg/L) 標準品 停留時間(min)
8.6 25.9 43.1 86.2 258.6 431 689.7 R 值 Aspartic acid 13.2 --- 239 399 683 2107 3297 5562 0.9993 Asparagine 22.1 --- 252 471 909 2835 4340 7372 0.9992
Serine 24.4 --- 228 512 893 2749 4234 7027 0.9994 Glutamine 25.5 --- 153 265 524 1642 2589 4328 0.9996
Arginine 28.3 96 226 446 718 1830 2789 4754 0.9986 Threonine 29.3 69 206 383 736 2319 3543 6058 0.9992
Alanine 33.6 97 269 521 1005 3227 4978 8396 0.9994 Tyrosine 34.1 --- 186 295 551 1736 2656 4441 0.9994 Methionine 42.6 59 249 445 799 2553 3999 6767 0.9995
Valine 43.4 109 342 632 1156 3494 5349 9180 0.9991 Phenylalanine 44.9 --- 200 360 661 2083 3225 5477 0.9993
Isoleucine 47.7 135 294 503 1006 3073 4791 8147 0.9994 Leucine 48.9 122 260 466 877 2606 4025 6756 0.9995
對於酸性水解之胺基酸(acid hydrolysable amino acid)主要參考並 修正Wu et al.(2003)之方法，取 5 mL 水樣，加入 6 N HCl 使 pH 小 於 2 以下並放置於 103℃進行 24 hr 的熱酸化水解，冷卻後之水解樣 本，再以6N 之 NaOH 進行中和，接著以 0.2 μm 之過濾頭進行過濾並 保存於4℃冰箱等待分析。
(五) 螢光激發與發射光譜圖（EEFM）
樣品以 0.2 μm 之濾頭過濾再進行冷藏保存及分析，三種分析參 數分別為全譜掃描、同步掃瞄及特徵螢光光譜圖，並利用螢光光譜儀
（F-4500, Hitach, Japan）三度位向測量 EEFM（excitation emission Fluorescence Matrix）之功能特性，進行水樣之螢光分析，偵測樣本 進行螢光光譜分析時，其所產生波峰則為溶解性有機物質之螢光波 峰，該設備光源採用氙燈作為光源，功率為 150 W，偵測器為光電 倍增管，其功能除了傳統單一波長掃描外，並具有三度位向測量 EEFM（excitation emission Fluorescence Matrix）之功能，藉此功能可 將激發及發射波長分別繪製於 X 及 Y 軸上，並將螢光強度顯示於 Z
軸，依光柵寬度設定，產生數百至數千筆之數據資料，儀器附屬分析 FL Solutions 軟體進行 3-D 圖譜之繪製，爾後將其數據轉成 EXCEL.csv 檔後，將檔案轉入 SURFER 軟體進行圖形繪製。水樣樣本圖譜均需 扣除超純水之空白圖譜。
全 譜 掃 描 之 輸 出 之 激 發 / 發 射 (Ex/Em) 波 長 範 圍 為 200-400/280-550 nm，數據輸出後，參考 Chen et al(2003)之研究將水 中有機物區分為五大區塊，包括區塊I：屬芳香族蛋白質(如：酪胺酸)；
區塊 II：屬芳香族蛋白質 (如:BOD5)；區塊 III：似黃酸；區塊 IV：
溶解性微生物產物之蛋白質(如：色胺酸及酪胺酸)；區塊 V：屬似腐 植酸。將各區塊之螢光強度進行累加及計算平均強度，即可瞭解有機 物之性質變化及差異。及組成百分比，再製作成表格或分佈圖即可完 成 。 另 利 用 螢 光 激 發 與 發 射 光 譜 儀 之 同 步 掃 描(Synchronous scanning)，則是將激發範圍設定 300 to 600 nm，螢光發射與激發波長 差值(Δλ)固定為 20 nm，將激發及發射之 slit 設定為 10 nm，藉以觀察 有機物在特殊波長之變化Ngoc et al.(2009)。
肆、 結果與討論
一、 人工基質經生物濾床分解後出水中有機碳量及有機物性質