2011)。(1)食品工業：海藻糖的非還原性特質，比起還原性糖類，較 不易產生 Maillard reaction 造成食物褐變，因此不會影響食品的色 澤、風味，且其化學性質相當穩定，可用做輔助添加劑來延長食品 延長保存時間與降低運輸成本(Chen et al., 2004)。此外，海藻糖已被 證實具有活化細胞自噬(autophagy)能力，來清除體內不正常累積的 Tau 蛋白以及 Poly-Q 蛋白，對於阿茲海默氏症及亨丁頓氏症有潛在 療效(Perucho et al., 2012)。
2. 生產與製備 重)，並不適合大規模的工業化生產。(Meleiro et al., 1993)。
(2)多重酵素系統 : 採用葡萄糖、麥芽糖或澱粉作為反應受質，
利用目前生物體內已知與海藻糖合成相關的酵素路徑生產海藻糖 (Paul et al., 2008) (附錄二)。(i)受質為葡萄糖 : 廣泛存在於古細菌、
細菌、真菌、植物或截肢動物中的 TPS/TPP(又稱 OtsA-OtsB)路徑，
經 trehalose-6-phophate synthase(TPS; EC 2.4.1.15) 轉 化 Uridine
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diphosphate-glucose(UDP-glucose)與 glucose-6-phosphate 成中間產物 trehalose-6-phosphate，再經由 trehalose-phosphate phosohatase(TPP;
EC3.1.3.12)去掉中間產物磷酸根，產生一個海藻糖分子(Kaasen et al., 1994)，此外，還有存在於古細菌與細菌中的 TreT 路徑，由 trehalose glycosyltransferring synhtase(TreT；EC 2.4.1.245)催化，將 ADP-glucose 與 glucose 聚合釋放 ADP 而生成海藻糖(Ryu et al., 2005)。由於上述 反應系統皆需要消耗高能物質，很難實現大規模的工業生產。(ii)受 質為澱粉 : TreY-TreZ(又稱 MTS-MTH)路徑，將一定鏈長的直鏈澱 粉 轉 化 為 海 藻 糖 。 首 先 由 maltooligosyltrehalose synthase(TreY ， MTS；EC 5.4.99.15)催化 maltooligosaccharise 位於還原端的 α-1，4-糖 苷 鍵 轉 換 成 α-1 ， 1- 鍵 結 ， 形成 maltooligosyltrehalose ， 再 由 maltooligosyltrehalose trehalohydrolase(TreZ，MTH；EC 3.2.1.141)作 用在鄰近 α-1，1-鍵結旁的 α-1，4- 鍵結上，釋放出海藻糖(Maruta et al., 1996)。隨後，日本林原公司(Hayashibara) 將該方法應用於大規 模工業化生產，使海藻糖價格大幅降低。(iii)受質為麥芽糖 : TS 路 徑 ， 存在 細菌 體內 的 海藻 糖合 成酶 (trehalose synthase ， TS ； EC 5.4.99.16)，能將 α，α-1， 4-麦芽糖在分子内重组成 α-α-1， 1 海藻 糖。由於反應只需要單一酵素，受質麥芽糖價格便宜，為工業生產 海藻糖的理想途徑(Nishimoto et al., 1995)。
二、海藻糖合成酶(trehalose synthase，TS) 1. TS 簡介
TS 能可逆催化麥芽糖分子內重組，將 α,α-1,4-鍵結轉化成 α,α-1,1 鍵結而形成海藻糖，並伴隨溫度升高而更加顯著的水解麥芽糖副反
- 4 -
(Nishimoto et al., 1996b)；Thermus aquaticus ATCC 33923 的 TS(TATS) 在最適作用溫度 60℃反應時有 70%的海藻糖轉化率，當溫度降至 40
℃時，海藻糖轉化率可達到 82%(Nishimoto et al., 1996a)；Deinococcus radiodurans TS (DrTS)反應溫度降至 5℃時則可增加至 92%的海藻糖 轉化率(Wang et al., 2007b)。
利用 TS 生產海藻糖，在流程控制上較容易，且原料價格便宜，
若能兼具下列幾項要點，使酵素符合工業化需求，有助於海藻糖的 工業發展。包括
(1).高溫熱穩定性，能減少糖化作用(saccharification)時受微生物 汙染可能性，如目前已受專利保護的 TATS(Nishimoto et al., 1996a)
(2).高海藻糖轉化率，能減少高溫時麥芽糖副產物的產生，如新 型海藻糖 Pseudomonas stutzeri CJ38(Lee et al., 2005)
(3).大量取得酵素，如用基因工程來大量表達 TreS。
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應(Koh et al., 2003)。比對數種已知 TS 胺基酸序列發現，TS 具有 α-澱粉酶家族(α-amylase，glycoside hydrolase family 13，GH13)所具有 的四個保守區(附錄四)，據此推測 TS 與 GH13 家族有著類似的催化 用(glycosylation)，使得麥芽糖分子的糖苷鍵斷裂，位於-1 結合位(-1 subsite)的葡萄糖分子與 TS 形成共價結合的中間產物。此時，伴隨活 性中心入口處關閉，另一個位於+1 subsite 的游離葡萄糖分子相對位 到平衡(Isbell and Pigman, 1969)。近來研究發現，以核磁共振(NMR)
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檢測 Mycobacteriasmegmati TS 反應時受質麥芽糖不同構型變化，反 應時 β-form 麥芽糖與自然狀態下變旋速率相等，而 α-form 則急速下 降，且降低 TS 反應濃度後，α-form 麥芽糖消耗速率減緩，但 β-form 變旋速率仍不變，顯示 TS 只會轉化 α-form 麥芽糖，而對 β-form 麥 芽糖並無作用(Miah et al., 2013)。此外，除了正逆反應可作用麥芽糖 與海藻糖，某些嗜熱菌的 TS 還具有蔗糖異構酶(sucrose isomerase，
SI) 中 的 海 藻 酮 糖 合 成 酶 (trehalulose synthase) 功 能 ， 如 Thermus aquaticus (Nishimoto et al., 1997)、Thermus thermophilus HB-8 (Wei et al., 2013)、Thermomonospora curvata DSM 43183 (Liang et al., 2013)，
能異構化蔗糖(α-D-glucosylpyranosyl-1,2-β-D-fructofuranoside)為海藻 酮糖(α-D-glucosylpyranosyl-1,1-β-D-fructofuranoside)，相較於應用廣 泛的異麥芽酮糖(α-D-glucosylpyranosyl-1,6-β-D-fructofuranoside)甜度 為蔗糖的 42%(Matsukubo and Takazoe, 2006)，海藻酮糖具有更高甜 度為蔗糖 60%，且經動物實驗發現，攝食此糖能減緩分解後單糖進 入血液的速度(Yamada et al., 1985)，以及降低齲齒發生率(Ooshima et al., 1991)。
4. TS 結構
目前有三個 TS 的結構被解出，分別 Mycobacteria tuberculosis TS(MtTS，PDB entry 4LXF)、MsTS(PDB entry 3ZO9)、DrTS (PDB entry 4TVU)。晶體結構顯示，TS 屬於 glycoside hydrolase family 13(GH13)，GH13 家族的結構主要是以 N 端的 TIM barrel 及 C 端的 C domain 為主體，外加圍繞於之間的 additional subdomains 所組成。
由蛋白質相互作用軟體 PISA(Krissinel, 2010)與分析型超高速離心實 驗分析 TS 在水溶液中的四級結構，發現 TS 能藉由兩單體的 C
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domain 胺基酸彼此疏水作用，以及 TIM barrel 間某些胺基酸鹽橋作 用力而形成雙聚體(dimetric)以上的結構，其中 MsTS 與 MtTS 多為四 聚體(tetramer)，而 DrTS 則多為雙聚體(dimer)。除了 DrTS 結構呈現 關閉且有活性的催化中心外，其餘兩個 TS 結構的活性中心塌陷(附 錄六)，其中，MsTS 與抑制劑阿卡波糖(acarbose)共結晶，發現 acarbose 與酵素結合在 C domain，此區域在許多 GH13 成員中被視為具有醣 類吸附模組 (carbohydrate-binding modules， CBMs)功能，為一種可 與 碳 水 化 合 物 進 行 特 定 的 辨 識 與 結 合 之 蛋 白 區 段 (Caner et al., 2013)，而 MtTS 與麥芽糖磷酸酶 Pep2 的組合結構能提升 Pep2 活性，
減 少 會 抑 制 GlgE pathway 的 中 間 產 物 磷 酸 麥 芽 糖 (maltose-1-phosphate)堆積(Roy et al., 2013)，以上的結果顯示 TS 與參 與葡聚糖合成路徑(GlgE pathway)有關(Miah et al., 2013)。TS 結構以 結晶較為完整的 DrTS 為例(附錄七)，主要可分為五個區域，其中主 體是 N 端的一個由(β/α)8 組成的桶狀結構 TIM barrel (α1－α8 和 β1
－β8)，具有活性中心，負責催化的功能，以及 C 端由 β-strands 所組 成的 domain C(Cβ1－Cβ7)，此外還有三個 additional subdomains，其 中一個 subdomain 是大部分的 GH13 成員皆有的區域，位於 TIM
- 8 - 現存於蛋白質結構資料庫(Protein Data Bank， PDB)的已知序列，找 出序列相似度最高的三級結構作為模板，經分子動能(molecular dynamics)及能量最小化(energy minimization)運算後，獲得目標序列 的蛋白質結構。由於以同源比較的方式，具有相當的可信度，其結 構的變異性相對較低，因此是目前最主要的蛋白質結構模擬方法 (Biasini et al., 2014)。
(2).摺疊辨識法(Folding recognition) : 將目標蛋白序列分段，代入 已知蛋白質結構序列的相似摺疊模板，計算二者在某一區域內之相 似度，依序列順序跟結構排列的法則，經能量最小化，來找出符合
- 9 - (Thomsen and Christensen, 2006)。
四、蛋白質工程( protein engineering)
蛋白質工程是利用基因工程技術，改造或提升原有蛋白質的穩定
(Bornscheuer and Pohl, 2001)。第二類為定向演化，仿造自然演化模 式進行蛋白質改造，包括隨機突變(random mutagenesis)，如利用易 錯聚合酶連鎖反應技術(error prone polymerase chain reaction，error
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prone PCR)，在基因放大過程中，藉由改變反應的緩衝溶液或使用無 校對功能的聚合酶(ex. Taq polymerase)，來增加突變機率；另一種為 同源基因重組(homologous gene recombination)或稱為家族混合
(family shuffling)的方式，將兩個或更多的蛋白質親代基因重組成一 稱定位飽和突變(site-specific saturation mutations)，優點是結合理性 設計與定向演化策略的優點，簡化篩選的基因庫數量(Chica et al., 2005)。不同酵素可利用不同的突變策略來改進其性質包含
1. 提升熱穩定性:
根據結構比對尋找 Bacillus subtilis 葡萄糖去氫酶(glucose
dehydrogenase)同源酵素中之非保守胺基酸，以定位突變方式置換成 保守胺基酸，並協同多點突變而得到耐熱性提升 106倍之突變酵素 (Vázquez‐Figueroa et al., 2007)。
2. 提升反應速率:
结合了 error prone PCR 和分段 DNA shuffling 兩種方法，經過兩輪 的篩選獲得反應速率提升 2 倍的 Meiothermus ruber TS (Liu et al., 2013)。
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3. 改變受質專一性:
定位突變 Thermomonospora curvata TS 距離活性中心口袋 3.5Å 的胺 基酸，發現 L116 可決定受質專一性，突變成特定胺基酸能分別增強 對蔗糖或麥芽糖的反應速率(Liang et al., 2013)。
4. 改變產物專一性:
突變 Klebsiella sp. LX3 麥芽酮糖異構酶(isomaltulose synthase)受質結 合之 RLDRD 保守區域的胺基酸，發現 R325 和 R328 可決定產物專 一性，突變成特定胺基酸能使產物從麥芽酮糖(82%)偏向海藻酮糖 (73%)(Zhang et al., 2003)。
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貳、研究目的
酵素轉化法是一種可降低成本、大量生產海藻糖的方式，然而如 何進一步提高酵素的轉化率和穩定性，仍是現今所面臨的問題。嗜 熱型海藻糖合成酶 TtTS 雖具有極高的耐熱性，具有應用於工業上 生產海藻糖優勢，但於最嗜作用溫度時轉糖效率僅有約 50%，仍具 有改善空間，因此本研究期望藉由蛋白質工程技術，擬定以下幾項 研究目標來增進 TtTS 於工業應用潛力：
1. 增進 TtTS 的反應速率 :
(１) 以澱粉製備 α-麥芽糖為主的反應受質
(２) 添加葡萄糖異構酶(glucose isomerase，GI)與 TtTS 共同反應，
利用 GI 將 TtTS 水解作用產生的副產物葡糖糖轉化成果糖，
來減少葡萄糖的抑制作用 2. 增進 TtTS 的轉化效率 :
根據 TtTS 與麥芽糖複合物立體模擬結構，找出可能增加與受質親 和力之胺基酸進行定位、定位飽和和多點飽和突變；此外，亦利 用 error prone PCR 仿造酵素自然演化模式進行全基因之隨機突 變，以篩選轉化率提升之突變株。
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参、材料與方法
一、質體構築
1. 宿主菌株與培養基
宿主細胞選自 E. coli 品系 : DH5α 用於高效率基因選殖以及質 體的大量複製；Tuner(DE3)藉由 T7 RNA polymerase 啟動蛋白質大量 表達，培養條件為 37 ℃，每分鐘 225 rpm 震盪培養於 LB (Luria Bertani) medium (1 L 含 10 g 的 Bio-tryptone、 5 g 的 yeast extract 及 10 g 的 NaCl)，並搭配 Ampicillin (100μg/mL) 作為篩選培養之 抗生素。
2. TtTS 基因重組質體
自嗜熱菌(Termus thermophilus)選殖出 TS 基因(Wang et al.，
2007)，包含 NdeI 與 SalI 切位，接入 pET-20b(+) 質體內，大小為 6506bp。將質體送入 Escherichia coli(Ecoli)品系 Tuner(DE3)進行表 達。此質體含 6 個 Histidine-tag 方便使用 Ni2+ resin 進行 TS 基因表達 後之蛋白質純化。
3. 質體 DNA 製備
將帶有 pET-20b(+)-TtTS 的 DH5α 菌株接種到含有 3 mL LB medium （含抗生素，100 μg/mL 之 Ampcillcin）中，進行隔夜培養。
以 3，000 rpm，10 分鐘離心，收集沉澱菌體，以 GeneMark 廠牌 之 Plasmid Miniprep Purification Kit 操作條件進行，取得質體 DNA。
4. DNA電泳分析
依 5：1 比例，將 DNA 樣品加入 6X DNA loading dye，注入 1%
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瓊脂(agarose)電泳膠片，電泳槽(Major science MP250)電壓設為 120 伏特，運行 20 分鐘後，膠片於 0.6% Ethdium Bromide(SIGMA，
Cat#E7637)染 10 分鐘，以 DNA 膠片影像擷取系統(Vilber Lourmat ECX-20.M)進行分析。
5. DNA 定量
取 1μlDNA 以光譜儀(spectrophotometer，Thermo，Nano-Drop ND-1000)測 OD260下之吸光值，並以二次去離子無菌水(ddH2O)作為
- 15 - 新懸浮於 10 mL sonication lysis buffer ( 0.1M NaCl，50 mM Sodium phosphate, SPB，pH 7.0 ) 中，以超音波破菌法破菌 (震盪 20 秒、
休息 10 秒，約 8 次循環)，以 10000 rpm，於 4℃ 離心 10 分 鐘，取部分上清液跑SDS-PAGE，於marker相對111.3 kDa位置有一 個主要band，即為目標蛋白。剩餘上清液注入填充 1 mL His-tag resin (GE Healthcare Ni Sepharose 6 Fast Flow) 的His-bind column，
收集流出液，並以 5 mL Wash buffer (含0.5M NaCl，100 mM Imidzaole，20 mM SPB，pH 7.0)，清洗管柱以去除雜蛋白，最後再 以 5 mL Eoution buffer (含0.5M NaCl，500 mM Imidzaole，20 mM
- 16 - 箱 (TAITEC，model：M˙BR-022UP)，1500rpm 隔夜震盪，接著準 備兩個 2ml 的 96 孔深盤，每個深孔內含 600μl LB(100μg/mL Ampicilin ， 0.5mM IPTG) ， 各 加 入 30μL 培 養 菌 液 ， 於 25 ℃ ， 1000rpm， 48hr 誘導TtTS表現。之後加入 60 μl破菌液(Promega
- 16 - 箱 (TAITEC，model：M˙BR-022UP)，1500rpm 隔夜震盪，接著準 備兩個 2ml 的 96 孔深盤，每個深孔內含 600μl LB(100μg/mL Ampicilin ， 0.5mM IPTG) ， 各 加 入 30μL 培 養 菌 液 ， 於 25 ℃ ， 1000rpm， 48hr 誘導TtTS表現。之後加入 60 μl破菌液(Promega