嗜熱菌Thermus thermophilus海藻糖合成酶之蛋白質工程

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 嗜熱菌 Thermus thermophilus 海藻糖合成酶之蛋白質工程 Protein engineering of the thermophilic trehalose synthase from Thermus thermophilus. 研究生：劉依萍 Yi-ping Liu 指導教授：李冠群博士 Dr.Guan-Chiun Lee. 中華民國 105 年七月.

(2) 目錄表目錄 ........................................................................................................ v 圖目錄 ....................................................................................................... vi 附錄目錄 ................................................................................................. viii 摘要 ........................................................................................................... ix Abstract ..................................................................................................... xi 壹、緒論 ................................................................................................- 1 一、海藻糖 ............................................................................................- 1 1. 性質與應用 ...............................................................................- 1 2. 生產與製備 ...............................................................................- 2 二、海藻糖合成酶(trehalose synthase，TS) .......................................- 3 1. TS 簡介 ......................................................................................- 3 2. TS 作用機制 ..............................................................................- 4 3. TS 作用受質 ..............................................................................- 5 4. TS 結構 ......................................................................................- 6 5. 嗜熱型海藻糖合成酶 (Thermus thermophilus TS， TtTS) ..- 7 三、蛋白質結構模擬 ............................................................................- 8 四、蛋白質工程( protein engineering) .................................................- 9 貳、研究目的 ..................................................................................... - 12 参、材料與方法 ................................................................................. - 13 一、質體構築 ..................................................................................... - 13 1. 宿主菌株與培養基 ................................................................ - 13 2. TtTS 基因重組質體................................................................ - 13 3. 質體 DNA 製備 ..................................................................... - 13 i.

(3) 4. DNA 電泳分析 ....................................................................... - 13 二、質體轉型 ..................................................................................... - 14 1. 勝任細胞 (competent cell)的製備........................................ - 14 2. E. coli 轉形作用 .................................................................... - 15 三、蛋白質表達與純化 ..................................................................... - 15 1. 蛋白質表達與純化 ................................................................ - 15 2. 高通量之蛋白表達與純化-親和性層析法 .......................... - 16 3. 高通量之蛋白表達與純化-熱變性純化法 .......................... - 17 四、蛋白質定量 ................................................................................. - 17 五、酵素反應 ..................................................................................... - 17 1. TtTS 活性分析-High-performance liquid chromatography (HPLC) ........................................................................................ - 17 2. TS 酵素動力學分析 .............................................................. - 19 3. TS 突變株篩選-Maltase-coupled TS assay........................... - 20 六、以澱粉製備 α-麥芽糖為主的反應受質 .................................... - 21 1. 配置可溶性澱粉 .................................................................... - 21 2. 置備 α-麥芽糖 ....................................................................... - 21 3. 酵素反應 α-麥芽糖 ............................................................... - 21 七、Glucose isomerase(GI)-偶合之 TtTS 反應 ................................ - 22 八、模擬 TtTS 蛋白質三級結構....................................................... - 22 九、模擬 TtTS 與麥芽糖的複合物立體結構 .................................. - 23 十、TtTS 蛋白質工程........................................................................ - 23 1. 定位突變引子設計 ................................................................ - 23 2. 定位飽和突變引子設計 ........................................................ - 23 ii.

(4) 3. 點突變 PCR ........................................................................... - 23 4. 多點飽和突變引子設計 ........................................................ - 24 5. 多點飽和突變 PCR ............................................................... - 24 6. 隨機突變引子設計 ................................................................ - 25 7. 隨機突變 error-prone PCR(ep PCR) ..................................... - 25 8. 限制酵素切割與 DNA 接合 ................................................. - 26 肆、結果 ............................................................................................. - 27 一、TtTS 活性分析............................................................................ - 27 1. TtTS 轉化率............................................................................ - 27 2. TtTS 動力學........................................................................... - 27 二、以 α-麥芽糖為主的 TtTS 反應分析 .......................................... - 28 三、GI-coupled TtTS 反應分析 ........................................................ - 28 四、模擬 TtTS 蛋白質三級結構....................................................... - 29 五、模擬 TtTS 與麥芽糖的複合物立體結構 .................................. - 30 六、TtTS 蛋白質工程........................................................................ - 31 1. TtTS 定位突變........................................................................ - 31 2. TtTS 定位飽和突變................................................................ - 31 3. TtTS 多點飽和突變................................................................ - 32 4. TtTS 隨機突變........................................................................ - 33 5. 定序突變株 ............................................................................ - 33 6. 定序之突變株轉化蔗糖產率分析........................................ - 34 伍、討論 ............................................................................................. - 35 一、TtTS 活性分析............................................................................ - 35 二、以 α-麥芽糖為主的 TtTS 反應分析 .......................................... - 36 iii.

(5) 三、GI-coupled TtTS 反應分析 ........................................................ - 37 四、TtTS 蛋白質工程........................................................................ - 38 1. 突變庫的建立 ........................................................................ - 38 2. 突變株的篩選 ........................................................................ - 39 3. 新突變庫的建立 .................................................................... - 40 4. 新的篩選方式 ........................................................................ - 41 陸、參考文獻 ..................................................................................... - 43 -. iv.

(6) 表目錄表一. 定位突變與定位飽和突變引子設計 ...................................... - 50 表二. 多點飽和突變引子設計 .......................................................... - 51 表三. PDB 資料庫中 TtTS 的胺基酸序列搜尋結果........................ - 52 表四. 距離麥芽糖 5Å 以內胺基酸與麥芽糖作用力整理............... - 53 表五. 比對與 TtTS 模擬之三級結構相似之 GH13 蛋白................ - 54 表六. 三級結構比對+1 subsite 胺基酸 ............................................ - 55 表七. 定位飽和突變胺基酸定序 ...................................................... - 56 表八. 多點飽和突變胺基酸定序 ...................................................... - 58 表九. 突變株異構化能力統整 .......................................................... - 59 -. v.

(7) 圖目錄圖一. TtTS 最適溫度 65℃轉化率分析 ...................................... - 61 圖二. TtTS 低溫 30℃轉化率分析.............................................. - 63 圖三. TtTS 酵素動力學 ............................................................ - 65 圖四. 以 α-麥芽糖為主反應的轉化率分析 ................................ - 66 圖五. GI-coupled TtTS 之反應 ................................................... - 67 圖六. 在不時間加入 GI-coupled TtTS 之反應 ............................ - 69 圖七. 模擬 TtTS 的蛋白質三級結構 ......................................... - 70 圖八. 模擬 TtTS 與麥芽糖的複合物立體結構 ........................... - 71 圖九. DrTS 模擬麥芽糖與 TtTS 模擬麥芽糖結構比較................ - 72 圖十. 距離受質 5Å 內的 TtTS 胺基酸....................................... - 73 圖十一. 突變株 TtTS 的 DNA 定序 .......................................... - 74 圖十二. 隨機突變定序結果 ...................................................... - 78 圖十三. 定位突變與定位飽和突變蛋白質 SDS-PAGE ............... - 79 圖十四. 突變株 F141Y 轉化率分析 ......................................... - 80 圖十五. 突變株 F141S 轉化率分析 ........................................... - 81 圖十六. 突變株 F163Y 轉化率分析 .......................................... - 82 圖十七. F163S 轉化率分析 ....................................................... - 83 vi.

(8) 圖十八. 突變株 Phe141X 突變庫轉化率分析 ............................ - 84 圖十九. 突變株.Phe163X 突變庫轉化率分析 ............................ - 85 圖二十. 放大培養定位飽和突變株蛋白純化 ............................. - 86 圖二十一. 放大培養定位飽和突變株之轉化率分析 .................. - 88 圖二十二. 突變株.Ile140X 突變庫轉化率分析 .......................... - 89 圖二十三. 突變株.Asn244X 突變庫轉化率分析 ........................ - 90 圖二十四. 多點飽和突變轉化率分析........................................ - 93 圖二十五. 隨機突變的轉化率分析 ........................................... - 96 -. vii.

(9) 附錄目錄附錄一.糖結構圖...................................................................... - 97 附錄二.海藻糖生合成途徑 ....................................................... - 98 附錄三.TS 性質 ........................................................................ - 99 附錄四.海藻糖合成酶與 α-澱粉酶家族所具有的四個保守區域及催化和受質結合位 ........................................................................ - 100 附錄五.TS 推測作用機制........................................................ - 101 附錄六. 已知 TS 立體結構活性中心 ..................................... - 102 附錄七.DrTS 結構 .................................................................. - 103 附錄八.PCR 流程 ................................................................... - 104 附錄九.多點飽和突變 PCR 流程示意圖 .................................. - 105 附錄十.隨機突變之基因突變率 .............................................. - 106 附錄十一.Maltase-coupled TS assay 原理 ................................ - 107 附錄十二. B factor 突變策略 ................................................... - 108 附錄十三. 微流系統篩選 TtTS 突變株流程圖 ......................... - 109 -. viii.

(10) 摘要海藻糖(trehalose)是由兩分子葡萄糖以 α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，能作為生物體內能量儲存與碳源的型式，以及在惡劣環境下，用以穩定生物膜與防止蛋白質變性的保護因子。因其具有許多特殊的物理及化學性質，海藻糖目前已廣泛應用於食品、化妝品及醫藥等工業。海藻糖合成酶(trehalose synthase，TS)可直接將麥芽糖異構化(isomerization)成海藻糖。由於反應只需要單一酵素且原料便宜，具有應用在工業上生產海藻糖的潛力。然而 TS 催化的反應為可逆反應，亦能將海藻糖轉化成麥芽糖，同時，TS 具有不可逆的麥芽糖水解副反應，此水解反應會隨溫度上升而增加，而且副反應產物葡萄糖對 TS 活性具有抑制作用。因此，逆反應及副反應兩者都會導致海藻糖產量下降，若能降低 TS 的逆反應速率，以及增進熱穩定性，使水解反應降低，則可以提升海藻糖轉化率，使 TS 更適於工業應用。Thermus thermophilus 海藻糖合成酶(TtTS)是目前已知的一種嗜熱性 TS，具有工業應用優勢，但基因重組之 TtTS 於高溫(65℃) 時轉化率僅 52%，產量不高，因此本研究期望藉由蛋白質工程技術提高 TtTS 反應速率與轉化率。提升反應速率方面使用兩種策略，一種為給予 TS 偏好的受質 alpha 麥芽糖為正反應作用的主要受質，結果顯示，TS 於含有較多 alpha 麥芽糖的反應中，反應速率提升，但轉化率沒有改變。另一種方法是利用偶合葡萄糖異構酶(Glucose isomerase，GI)，將 TS 副產物葡萄糖轉化成果糖，來減少副產物的抑制效果，結果顯示，適量的 GI 能提升 TS 反應速率，然而對於最終的轉化率仍沒有影響。在提升 TtTS 轉化率方面，根據模擬的嵌合 ix.

(11) 麥芽糖與海藻糖之 TtTS 三級結構，分析酵素與受質的結合情況，預測出與麥芽糖無明顯結合力，並且不具有 TS 家族保守性的胺基酸有 Phe141、Phe163、Ile140、Asn244，搭配本研究所建立的高通量 TS 純化暨活性篩選系統，分別進行四個位點之定位飽和突變，以及多點飽和突變，此外，亦進行 TtTS 全基因的隨機突變，進行酵素定向演化。結果顯示，篩選足夠數量的單位點定位飽和突變庫後，未發現高於原 TtTS 轉化效率之突變株，而多點飽和突變與隨機突變庫中各挑了 1000 個突變株，亦尚未篩選到轉化率提升之突變株。經定序發現，當 Phe141 突變為 Leu141 且 Phe163 突變為 Val163 時，具有協同作用，能維持轉化率與原 TtTS 相當，此結果顯示，多點飽和突變的策略非常有機會能組合出轉化率提升的突變酵素。然而，多點飽和突變與隨機突變需要篩選龐大數量之突變株，研發更高效率的篩選系統將有助於得到轉化率提升之突變株。. 關鍵字 : 嗜熱型海藻糖合成酶；α-麥芽糖；葡萄糖異構酶；蛋白質工程；定位、定位飽和、多點飽和、隨機突變. x.

(12) Abstract Trehalose is a non-reducing disaccharide, formed by two glucose units with an α-1,1-glycosidic linkage. It has many important physiological functions such as carbon source and energy storage,a protectant of protein and lipid against various environmental stresses. Trehalose has been widely applied in foods, cosmetics and pharmaceuticals industries. Trehalose synthase (TS) can reversibly catalyze the intramolecular transglucosylation of maltose to trehalose. Since the reaction requires only a single enzymetic step and inexpensive substrate, TS has the potential for producing trehalose in industry.However, the use of TS in industry still faces the problem of low conversion rate due to the reversed reaction and the irreversible side-reaction of maltose hydrolysis. Especially, the maltose hydrolysis activity increases when the reaction temperature rises and the product glucose inhibits the TS activity. Therefore, enhancing the forward isomerization activity and reducing the side reaction activity may improving the conversion rate of TS. The thermophilic Thermus thermophilus trehalose synthase (TtTS) is a promising enzyme for the trehalose production. However, at the optimal temperature (65 ℃), the trehlaose conversion rate of the recombinant TtTS is only 52%. In this study, we applied the protein engineering to enhance catalytic activity and the trehalose conversion rate of TtTS. Two appproaches were performed to improving the catalytic activity of TtTS. One is providing TS-prefered α-maltose anomer as major substrate. The results indicated that the initial reaction rate was higher xi.

(13) when high concentrations of α-form maltose were used as substrates. However, the conversion rates were not affected. The other one is coupling TS with glucose isomerase(GI) which converts and thus removes the side-reaction product glucose into fructose to reduce the product inhibition. The results indicated that adequate amount and early addition of GI overwhelmed the glucose inhibition and enhanced the TtTS reaction rate, while the conversion rate was not affected. To improve the conversion rate of TtTS, we modeled the tertiary structures of TtTS and TtTS-maltose complexes and analyzed the residues located in close contact with maltose. Ile140, Phe141, Phe163 and Asn244 were found not unique in TS family features and showed no significant interactions with maltose. These 4 residues were chosen for site-specific saturation and multiple-sites saturation mutagenesis. In addition, random mutagenesis was also performed on whole TtTS gene, By using high-throughput TS screening system, 200 mutants for site-specific saturation and 1000 mutants for multiple-sites saturation and random mutagenesis, respectively, have been screened. The results indicated that no mutants with improving conversion rate were identified. By DNA sequencing, the combination of Phe141Leu and Phe163Val showed similar conversion rate to that of the wild type and implicated that simultaneous multiple mutations in a random manner possibly result in improved mutants due to the synergistic effects. In general, large-amount and labor-intensive screening are necessary for multiple-sites saturation and random mutagenesis. Some other xii.

(14) high-throughput screen system should be established to screen the mutant library for the beneficial combination of mutations in the future.. Keyword：Thermus thermophilus trehalose synthase；α-maltose；glucose isomerase；protein engineering；rational、semi-ratinal、random mutation. xiii.

(15) 壹、緒論一、海藻糖 1. 性質與應用海藻糖（trehalose）是由兩分子葡萄糖以 α,α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖(附錄一)，普遍存在於細菌、真菌、植物、昆蟲、無脊椎動物等生物體內，可作為生物體能量的儲存形式，以及生物細胞所需的碳源之一，如昆蟲體內的血淋巴中，含有 80%以上的海藻糖，扮演著血糖的角色(Elbein et al., 2003)。當生物暴露於高溫，嚴寒，脫水等惡劣環境下，海藻糖會大量合成，協助穩定及維持生物的生命系統，其相關的作用機制尚未確認，大致分為三種假說 : 水替代假說(water-replacement hypoth-esis)－認為海藻糖能取代水分子與生物體蛋白質、核酸、糖類、脂質等重要分子形成穩定的氫鍵，維持其分子結構與功能(Carpenter and Crowe, 1989)；水誘捕假說(water entrapment hypothesis)－認為海藻糖並無直接與分子作用，而是阻卻自身與水分子結合能力，使大分子優先水結合，提升化學勢，進而穩定大分子(Belton and Gil, 1994)；玻璃化假說(vitrification hypothesis)－認為液態中的醣類經高溫蒸發後可以轉化或保持玻璃態而不結晶。海藻糖的獨特性質就在可於高溫及完全乾燥的狀態下形成穩定不吸濕的玻璃態，這樣的構造具有支撐性質，能使生物分子在經過脫水後，仍可恢復原來的結構(Crowe et al., 2001)；由於諸多的特殊性質與獨特的作用機制，目前海藻糖已被廣泛應用於食品加工、醫藥、化妝品產業、生物化學等領域(Ohtake and Wang, - 1 -.

(16) 2011)。(1)食品工業：海藻糖的非還原性特質，比起還原性糖類，較不易產生 Maillard reaction 造成食物褐變，因此不會影響食品的色澤、風味，且其化學性質相當穩定，可用做輔助添加劑來延長食品保存時間，提高保存品質(Colaço & Roser， 1994)。(2)化妝品工業 : 海藻糖具極高保水吸濕力，及避免異味產生，能作為皮膚保濕劑、除臭劑，並添加於美妝產品中，以提升其質地及貯放時間(Yang et al., 2010)。(3)生物醫學 : 海藻糖具有穩定細胞膜、抑制細胞損傷的性質，可作為生化藥品、疫苗、移植器官的保護劑(如 ET-Kyoto)，以延長保存時間與降低運輸成本(Chen et al., 2004)。此外，海藻糖已被證實具有活化細胞自噬(autophagy)能力，來清除體內不正常累積的 Tau 蛋白以及 Poly-Q 蛋白，對於阿茲海默氏症及亨丁頓氏症有潛在療效(Perucho et al., 2012)。 2. 生產與製備海藻糖製備方式包含: (1)生物提取法：屬於傳統海藻糖製備方式，利用營養培養基使細菌與酵母菌生長，經過乾燥、改變滲透壓等處理，使其體內累積大量海藻糖，再抽取其培養液收集海藻糖。雖然製程簡單，透過有機溶劑精制後純度也能達到 98%以上，但最後產量僅有 20%W/W(乾重)，並不適合大規模的工業化生產。(Meleiro et al., 1993)。 (2)多重酵素系統 : 採用葡萄糖、麥芽糖或澱粉作為反應受質，利用目前生物體內已知與海藻糖合成相關的酵素路徑生產海藻糖 (Paul et al., 2008) (附錄二)。(i)受質為葡萄糖 : 廣泛存在於古細菌、細菌、真菌、植物或截肢動物中的 TPS/TPP(又稱 OtsA-OtsB)路徑，經 trehalose-6-phophate synthase(TPS; EC 2.4.1.15) 轉化 Uridine - 2 -.

(17) diphosphate-glucose(UDP-glucose)與 glucose-6-phosphate 成中間產物 trehalose-6-phosphate，再經由 trehalose-phosphate phosohatase(TPP; EC3.1.3.12)去掉中間產物磷酸根，產生一個海藻糖分子(Kaasen et al., 1994)，此外，還有存在於古細菌與細菌中的 TreT 路徑，由 trehalose glycosyltransferring synhtase(TreT；EC 2.4.1.245)催化，將 ADP-glucose 與 glucose 聚合釋放 ADP 而生成海藻糖(Ryu et al., 2005)。由於上述反應系統皆需要消耗高能物質，很難實現大規模的工業生產。(ii)受質為澱粉 : TreY-TreZ(又稱 MTS-MTH)路徑，將一定鏈長的直鏈澱粉轉化為海藻糖。首先由 maltooligosyltrehalose synthase(TreY ， MTS；EC 5.4.99.15)催化 maltooligosaccharise 位於還原端的 α-1，4糖苷鍵轉換成 α-1 ， 1- 鍵結，形成 maltooligosyltrehalose ，再由 maltooligosyltrehalose trehalohydrolase(TreZ，MTH；EC 3.2.1.141)作用在鄰近 α-1，1-鍵結旁的 α-1，4- 鍵結上，釋放出海藻糖(Maruta et al., 1996)。隨後，日本林原公司(Hayashibara) 將該方法應用於大規模工業化生產，使海藻糖價格大幅降低。(iii)受質為麥芽糖 : TS 路徑，存在細菌體內的海藻糖合成酶 (trehalose synthase ， TS ； EC 5.4.99.16)，能將 α，α-1， 4-麦芽糖在分子内重组成 α-α-1， 1 海藻糖。由於反應只需要單一酵素，受質麥芽糖價格便宜，為工業生產海藻糖的理想途徑(Nishimoto et al., 1995)。二、海藻糖合成酶(trehalose synthase，TS) 1. TS 簡介 TS 能可逆催化麥芽糖分子內重組，將 α,α-1,4-鍵結轉化成 α,α-1,1 鍵結而形成海藻糖，並伴隨溫度升高而更加顯著的水解麥芽糖副反 - 3 -.

(18) 應產生葡萄糖。目前已有許多來自不同菌株的 TS 被定性，除了嗜熱菌的 TS，其他大部分 TS 最適反應溫度為 25~35℃，最適作用 pH 值在 6.5~8.5 左右(D. Xie, 2013) (附錄三)。不同來源的 TS 在不同反應溫度下，海藻糖轉化率(conversion rate)有所不同，但普遍隨著溫度降低都能獲得較高轉化率，例如 Pimelobacter sp. R48 的 TS 在 25℃反應下有 76.7%轉化率，當溫度降為 5℃時海藻糖轉化率提升為 82% (Nishimoto et al., 1996b)；Thermus aquaticus ATCC 33923 的 TS(TATS) 在最適作用溫度 60℃反應時有 70%的海藻糖轉化率，當溫度降至 40 ℃時，海藻糖轉化率可達到 82%(Nishimoto et al., 1996a)；Deinococcus radiodurans TS (DrTS)反應溫度降至 5℃時則可增加至 92%的海藻糖轉化率(Wang et al., 2007b)。利用 TS 生產海藻糖，在流程控制上較容易，且原料價格便宜，若能兼具下列幾項要點，使酵素符合工業化需求，有助於海藻糖的工業發展。包括 (1).高溫熱穩定性，能減少糖化作用(saccharification)時受微生物汙染可能性，如目前已受專利保護的 TATS(Nishimoto et al., 1996a) (2).高海藻糖轉化率，能減少高溫時麥芽糖副產物的產生，如新型海藻糖 Pseudomonas stutzeri CJ38(Lee et al., 2005) (3).大量取得酵素，如用基因工程來大量表達 TreS。 2. TS 作用機制韓國的 Koh 利用電灑式質譜儀 (Electrospray Ionizsation MassSpectrometry，EIMS)的分析方法發現，兩葡萄糖單元標記重氫的海藻糖與無標記海藻糖於 TS 反應後，並不會形成僅有一糖單元標有重氫的麥芽糖，顯示 TS 的作用機制是催化糖分子內鍵結重組的反 - 4 -.

(19) 應(Koh et al., 2003)。比對數種已知 TS 胺基酸序列發現，TS 具有 α澱粉酶家族(α-amylase，glycoside hydrolase family 13，GH13)所具有的四個保守區(附錄四)，據此推測 TS 與 GH13 家族有著類似的催化機制，藉由催化兩次取代反應來完成海藻糖與麥芽糖的異構化過程 (Zhu et al., 2009)。透過 Zhang 等人研究 Mycobacterium smegmatis TS(MsTS)催化機制，利用 EIMS 與同位素標定，推測 TS 與受質結合時的構型改變為催化反應進行的速率決定步驟(Zhang et al., 2011)。首先，TS 具有可開啟與關閉的活性中心口袋，來調節催化反應中受質與產物的進出。當 TS 與麥芽糖在催化中心結合後，酶活性中心的胺基酸 Glu 與 Asp 分別扮演酸與鹼的催化腳色。親核體 Asp 會攻擊在麥芽糖非還原端的第一個碳上，以及作為酸/鹼催化劑 Glu 會提供一個氫質子給糖苷鍵上的氧原子，進行第一次取代反應，糖基化作用(glycosylation)，使得麥芽糖分子的糖苷鍵斷裂，位於-1 結合位(-1 subsite)的葡萄糖分子與 TS 形成共價結合的中間產物。此時，伴隨活性中心入口處關閉，另一個位於+1 subsite 的游離葡萄糖分子相對位置發生改變，使其 C1-OH 基正好能作親核性攻擊 TS 與葡萄糖形成共價鍵的 C1，發生第二次取代反應，去糖基化作用(deglycosylation)，產生 α，α-1，1-海藻糖(附錄五)。在過去研究中，將 TS 催化胺基酸 Asp 和 Glu 突變成 Ala，TS 的活性則幾乎喪失，證明此兩胺基酸對催化作用進行相當重要(Chen et al., 2006) (Chow et al., 2015)。 3. TS 作用受質麥芽糖包含兩種構型，α-form 和 β-form(附錄一)，兩種狀態於無酵素作用的溶液下，本身會進行變旋作用(mutarotation)直到兩構型達到平衡(Isbell and Pigman, 1969)。近來研究發現，以核磁共振(NMR) - 5 -.

(20) 檢測 Mycobacteria smegmati TS 反應時受質麥芽糖不同構型變化，反應時 β-form 麥芽糖與自然狀態下變旋速率相等，而 α-form 則急速下降，且降低 TS 反應濃度後，α-form 麥芽糖消耗速率減緩，但 β-form 變旋速率仍不變，顯示 TS 只會轉化 α-form 麥芽糖，而對 β-form 麥芽糖並無作用(Miah et al., 2013)。此外，除了正逆反應可作用麥芽糖與海藻糖，某些嗜熱菌的 TS 還具有蔗糖異構酶(sucrose isomerase， SI) 中的海藻酮糖合成酶 (trehalulose synthase) 功能，如 Thermus aquaticus (Nishimoto et al., 1997)、Thermus thermophilus HB-8 (Wei et al., 2013)、Thermomonospora curvata DSM 43183 (Liang et al., 2013)，能異構化蔗糖(α-D-glucosylpyranosyl-1,2-β-D-fructofuranoside)為海藻酮糖(α-D-glucosylpyranosyl-1,1-β-D-fructofuranoside)，相較於應用廣泛的異麥芽酮糖(α-D-glucosylpyranosyl-1,6-β-D-fructofuranoside)甜度為蔗糖的 42%(Matsukubo and Takazoe, 2006)，海藻酮糖具有更高甜度為蔗糖 60%，且經動物實驗發現，攝食此糖能減緩分解後單糖進入血液的速度(Yamada et al., 1985)，以及降低齲齒發生率(Ooshima et al., 1991)。 4. TS 結構目前有三個 TS 的結構被解出，分別 Mycobacteria tuberculosis TS(MtTS，PDB entry 4LXF)、MsTS(PDB entry 3ZO9)、DrTS (PDB entry 4TVU)。晶體結構顯示，TS 屬於 glycoside hydrolase family 13(GH13)，GH13 家族的結構主要是以 N 端的 TIM barrel 及 C 端的 C domain 為主體，外加圍繞於之間的 additional subdomains 所組成。由蛋白質相互作用軟體 PISA(Krissinel, 2010)與分析型超高速離心實驗分析 TS 在水溶液中的四級結構，發現 TS 能藉由兩單體的 C - 6 -.

(21) domain 胺基酸彼此疏水作用，以及 TIM barrel 間某些胺基酸鹽橋作用力而形成雙聚體(dimetric)以上的結構，其中 MsTS 與 MtTS 多為四聚體(tetramer)，而 DrTS 則多為雙聚體(dimer)。除了 DrTS 結構呈現關閉且有活性的催化中心外，其餘兩個 TS 結構的活性中心塌陷(附錄六)，其中，MsTS 與抑制劑阿卡波糖(acarbose)共結晶，發現 acarbose 與酵素結合在 C domain，此區域在許多 GH13 成員中被視為具有醣類吸附模組 (carbohydrate-binding modules， CBMs)功能，為一種可與碳水化合物進行特定的辨識與結合之蛋白區段 (Caner et al., 2013)，而 MtTS 與麥芽糖磷酸酶 Pep2 的組合結構能提升 Pep2 活性，減少會抑制 GlgE pathway 的中間產物磷酸麥芽糖 (maltose-1-phosphate)堆積(Roy et al., 2013)，以上的結果顯示 TS 與參與葡聚糖合成路徑(GlgE pathway)有關(Miah et al., 2013)。TS 結構以結晶較為完整的 DrTS 為例(附錄七)，主要可分為五個區域，其中主體是 N 端的一個由(β/α)8 組成的桶狀結構 TIM barrel (α1－α8 和 β1 －β8)，具有活性中心，負責催化的功能，以及 C 端由 β-strands 所組成的 domain C(Cβ1－Cβ7)，此外還有三個 additional subdomains，其中一個 subdomain 是大部分的 GH13 成員皆有的區域，位於 TIM barrel 的 β3 和 α3 之間，稱為 subdomain B；第二個 subdomain 位於 TIM barrel 的 β7 和 α7 之間，稱為 subdomain 7 (S7)；最後一個 subdomain 位於 TIM barrel 的 β8 和 α8 之間，稱為 subdomain 8 (S8)，一般 GH13 成員沒有 S7 與 S8 的結構，故 S7 與 S8 是 TS 特有的結構。其中 S7 與 subdomainsB 位在活性中心口袋的上方，在催化反應的過程中，會調節活性中心口袋入口處的開關(Wang et al., 2014)。 5. 嗜熱型海藻糖合成酶 (Thermus thermophilus TS， TtTS) - 7 -.

(22) 嗜熱菌(Thermus thermophilus)屬於格蘭氏陰性菌，目前最常用於研究的 HB8 與 HB27 菌種已被定序完成(Henne et al., 2004)。從嗜熱菌中中得到的 TS 能於高溫下(65℃)生產海藻糖，可減少糖化作用所造成微生物汙染情形，並有助於受質與酵素的均勻混合，極具有工業應用價值。三、蛋白質結構模擬 1. 蛋白質三級結構模擬蛋白質三級結構的獲得方式主要分為兩大類: 第一類是透過實驗的方式，解出實際的蛋白質結構，包括以 X 光繞射(X-ray diffraction)分析形成晶體蛋白的繞射圖譜，再經由一連串計算建構蛋白質結構模型；或利用 NMR 方式，外加磁場改變電子自旋(Spin)，再經計算電子圖譜，獲得蛋白質結構。第二類則是依據現有蛋白質的結構資訊，配合電腦進行理論運算，獲得蛋白質的模擬結構，模擬方法包括: (1).同源模擬法(Homology modeling) : 將目標蛋白質序列比對現存於蛋白質結構資料庫(Protein Data Bank， PDB)的已知序列，找出序列相似度最高的三級結構作為模板，經分子動能(molecular dynamics)及能量最小化(energy minimization)運算後，獲得目標序列的蛋白質結構。由於以同源比較的方式，具有相當的可信度，其結構的變異性相對較低，因此是目前最主要的蛋白質結構模擬方法 (Biasini et al., 2014)。 (2).摺疊辨識法(Folding recognition) : 將目標蛋白序列分段，代入已知蛋白質結構序列的相似摺疊模板，計算二者在某一區域內之相似度，依序列順序跟結構排列的法則，經能量最小化，來找出符合 - 8 -.

(23) 要求的分子。此方法雖然能獲得較準確的蛋白質核心部份，但對外圍的二級結構解析較差，且需耗費大量的計算資源(Yang et al., 2011)。 (3).重頭起算法(Ab initio) : 利用分子動力學的原理，考慮胺基酸和溶液的所有交互作用力，由胺基酸序列開始，找出分子間最穩定的狀態，獲得蛋白質三級結構。此一預測法同樣需要大量計算，且只能對短鏈胜肽進行預測(Wang et al., 2012)。 2. 蛋白質與受質嵌合模擬利用電腦模擬分子及分子之間的作用情況，預測蛋白質與受質分子的可能結合結構，透過一系列的電腦程式計算，獲得能量最低的嵌合結構，能量越低代表此嵌合結構越穩定，因此結構亦越可信 (Thomsen and Christensen, 2006)。四、蛋白質工程( protein engineering) 蛋白質工程是利用基因工程技術，改造或提升原有蛋白質的穩定度、催化性質、與受質分子辨認結合與專一性等，以便獲得功能更符合工業應用所需的蛋白質。方法分為三大類，第一類為理性的設計(rational design)，透過蛋白質已知結構和功能，來設計胺基酸的突變位點，利用定位突變(site-directed mutagenesis)技術來進行蛋白質改造，屬於能節省成本且較快速的方法，但缺點是對於此蛋白質的結構、作用機制、甚至分子的動態資訊都需要非常詳細的了解 (Bornscheuer and Pohl, 2001)。第二類為定向演化，仿造自然演化模式進行蛋白質改造，包括隨機突變(random mutagenesis)，如利用易錯聚合酶連鎖反應技術(error prone polymerase chain reaction，error - 9 -.

(24) prone PCR)，在基因放大過程中，藉由改變反應的緩衝溶液或使用無校對功能的聚合酶(ex. Taq polymerase)，來增加突變機率；另一種為同源基因重組(homologous gene recombination)或稱為家族混合 (family shuffling)的方式，將兩個或更多的蛋白質親代基因重組成一個嵌合型基因庫，能減少序列變異對蛋白質結構與功能的影響，並產生新穎的催化功能。利用定向演化進行蛋白質改造，最大的優點是不需要預先知道蛋白質的立體結構，並且會比理性設計還會有更佳的蛋白質改善，然而缺點是需要大量、大規模的篩選(Eijsink et al., 2005)。第三大類為半理性設計(semi-rational)，對於結構已知、催化作用機制尚不明確的蛋白質，進行特定胺基酸位點的隨機突變，又稱定位飽和突變(site-specific saturation mutations)，優點是結合理性設計與定向演化策略的優點，簡化篩選的基因庫數量(Chica et al., 2005)。不同酵素可利用不同的突變策略來改進其性質包含 1. 提升熱穩定性: 根據結構比對尋找 Bacillus subtilis 葡萄糖去氫酶(glucose dehydrogenase)同源酵素中之非保守胺基酸，以定位突變方式置換成保守胺基酸，並協同多點突變而得到耐熱性提升 106 倍之突變酵素 (Vázquez‐Figueroa et al., 2007)。 2. 提升反應速率: 结合了 error prone PCR 和分段 DNA shuffling 兩種方法，經過兩輪的篩選獲得反應速率提升 2 倍的 Meiothermus ruber TS (Liu et al., 2013)。. - 10 -.

(25) 3. 改變受質專一性: 定位突變 Thermomonospora curvata TS 距離活性中心口袋 3.5Å 的胺基酸，發現 L116 可決定受質專一性，突變成特定胺基酸能分別增強對蔗糖或麥芽糖的反應速率(Liang et al., 2013)。 4. 改變產物專一性: 突變 Klebsiella sp. LX3 麥芽酮糖異構酶(isomaltulose synthase)受質結合之 RLDRD 保守區域的胺基酸，發現 R325 和 R328 可決定產物專一性，突變成特定胺基酸能使產物從麥芽酮糖(82%)偏向海藻酮糖 (73%)(Zhang et al., 2003)。. - 11 -.

(26) 貳、研究目的酵素轉化法是一種可降低成本、大量生產海藻糖的方式，然而如何進一步提高酵素的轉化率和穩定性，仍是現今所面臨的問題。嗜熱型海藻糖合成酶 TtTS 雖具有極高的耐熱性，具有應用於工業上生產海藻糖優勢，但於最嗜作用溫度時轉糖效率僅有約 50%，仍具有改善空間，因此本研究期望藉由蛋白質工程技術，擬定以下幾項研究目標來增進 TtTS 於工業應用潛力： 1. 增進 TtTS 的反應速率 : (１) 以澱粉製備 α-麥芽糖為主的反應受質 (２) 添加葡萄糖異構酶(glucose isomerase，GI)與 TtTS 共同反應，利用 GI 將 TtTS 水解作用產生的副產物葡糖糖轉化成果糖，來減少葡萄糖的抑制作用 2. 增進 TtTS 的轉化效率 : 根據 TtTS 與麥芽糖複合物立體模擬結構，找出可能增加與受質親和力之胺基酸進行定位、定位飽和和多點飽和突變；此外，亦利用 error prone PCR 仿造酵素自然演化模式進行全基因之隨機突變，以篩選轉化率提升之突變株。. - 12 -.

(27) 参、材料與方法一、質體構築 1. 宿主菌株與培養基宿主細胞選自 E. coli 品系 : DH5α 用於高效率基因選殖以及質體的大量複製；Tuner(DE3)藉由 T7 RNA polymerase 啟動蛋白質大量表達，培養條件為 37 ℃，每分鐘 225 rpm 震盪培養於 LB (Luria Bertani) medium (1 L 含 10 g 的 Bio-tryptone、 5 g 的 yeast extract 及 10 g 的 NaCl)，並搭配 Ampicillin (100μg/mL) 作為篩選培養之抗生素。 2. TtTS 基因重組質體自嗜熱菌(Termus thermophilus)選殖出 TS 基因(Wang et al.， 2007)，包含 NdeI 與 SalI 切位，接入 pET-20b(+) 質體內，大小為 6506bp。將質體送入 Escherichia coli(Ecoli)品系 Tuner(DE3)進行表達。此質體含 6 個 Histidine-tag 方便使用 Ni2+ resin 進行 TS 基因表達後之蛋白質純化。 3. 質體 DNA 製備將帶有 pET-20b(+)-TtTS 的 DH5α 菌株接種到含有 3 mL LB medium （含抗生素，100 μg/mL 之 Ampcillcin）中，進行隔夜培養。以 3，000 rpm，10 分鐘離心，收集沉澱菌體，以 GeneMark 廠牌之 Plasmid Miniprep Purification Kit 操作條件進行，取得質體 DNA。 4. DNA電泳分析依 5：1 比例，將 DNA 樣品加入 6X DNA loading dye，注入 1% - 13 -.

(28) 瓊脂(agarose)電泳膠片，電泳槽(Major science MP250)電壓設為 120 伏特，運行 20 分鐘後，膠片於 0.6% Ethdium Bromide(SIGMA， Cat#E7637)染 10 分鐘，以 DNA 膠片影像擷取系統(Vilber Lourmat ECX-20.M)進行分析。 5. DNA 定量取 1μlDNA 以光譜儀(spectrophotometer，Thermo，Nano-Drop ND-1000)測 OD260 下之吸光值，並以二次去離子無菌水(ddH2O)作為對照組，測其吸光值並轉化成 DNA 濃度。 6. DNA 定序分析此部分委託基隆米克斯生物科技股份有限公司進行二、質體轉型 1. 勝任細胞 (competent cell)的製備挑取 E. coli 品系 BL21(DE3) 或 DH5α之單一菌落，接種於 3 mL LB mdeium，37℃、225 rpm 隔夜培養 16 小時，取 1mL 菌液加入 30 mL LB mdeium，於 37℃、225 rpm 培養3小時，冰浴 10 分鐘，再以 4℃、3000 rpm 離心 10 分鐘。去除上清液，再以預冷的 30mL、100 mM CaCl2 重新懸浮菌體，置於冰上 30 分鐘後離心，以預冷的 3mL 100mM CaCl2 重新懸浮菌體，每 200 μL 分裝至微量離心管，可放置於 4℃，其轉形效率於 24 小時內可達到最高，或加入 glycerol 至濃度 15%，於 –80℃ 溫度下保存，使用期限不超過一個月。. - 14 -.

(29) 2. E. coli 轉形作用將純化好的質體 DNA 與勝任細胞混合均勻，冰浴 30 分鐘後，42℃ 熱處理（heat shock）2 分鐘，冰浴 2 分鐘後加入1 mL LB 培養液，於 37℃ 培養一小時，再以 3000 rpm 離心 10 分鐘，留下約100 μL上清液，重新懸浮菌體後，塗於含 Ampcillcin 之 LB 洋菜培養基中，置於 37℃ 培養箱中隔夜培養，挑選菌落培養。三、蛋白質表達與純化 1. 蛋白質表達與純化挑選 LB-Ampicillin agar plate 上之菌落，培養在 3 mL LB medium，內含 100 μg/mL Ampcillcin 中，於 37℃經隔夜培養後，取 1 mL 加入 50 mL(突變株放大培養條件則為取400μL菌液加入 20mL) 之含有 100 μg/mL Ampcillcin 的 LB 培養液於 37℃、225 rpm培養至 OD600 =1.0 時，以0.4mM IPTG，25℃、225 rpm誘導24 小時，以3000 rpm、4℃，離心 10 分鐘後，除去上清液，將菌體重新懸浮於 10 mL sonication lysis buffer ( 0.1M NaCl，50 mM Sodium phosphate, SPB，pH 7.0 ) 中，以超音波破菌法破菌 (震盪 20 秒、休息 10 秒，約 8 次循環)，以 10000 rpm，於 4℃ 離心 10 分鐘，取部分上清液跑SDS-PAGE，於marker相對111.3 kDa位置有一個主要band，即為目標蛋白。剩餘上清液注入填充 1 mL His-tag resin (GE Healthcare Ni Sepharose 6 Fast Flow) 的His-bind column，收集流出液，並以 5 mL Wash buffer (含0.5M NaCl，100 mM Imidzaole，20 mM SPB，pH 7.0)，清洗管柱以去除雜蛋白，最後再以 5 mL Eoution buffer (含0.5M NaCl，500 mM Imidzaole，20 mM - 15 -.

(30) SPB，pH 7.0)，將目標蛋白質沖提，並收集具有目標蛋白部分，於 4 ℃下進行透析(20 mM SPB，pH 7.0)。每次透析溶液的體積為 1 L，第一次透析 2 小時後更換透析溶液，第二次透析 2 小時後更換透析溶液，之後可放置隔夜透析，透析完成後將蛋白質液取出，分裝至微量離心管中，可長期保存於 -80℃ 冰箱中。 2. 高通量之蛋白表達與純化-親和性層析法挑選 LB-Ampicillin agar plate 上之菌落，培養於1ml的96孔深盤，每個深孔孔內含500μl LB (100μg/mL Ampicilin )，在37℃培養箱 (TAITEC，model：M˙BR-022UP)，1500rpm 隔夜震盪，接著準備兩個 2ml 的 96 孔深盤，每個深孔內含 600μl LB(100μg/mL Ampicilin ， 0.5mM IPTG) ，各加入 30μL 培養菌液，於 25 ℃ ， 1000rpm， 48hr 誘導TtTS表現。之後加入 60 μl破菌液(Promega FastBreak lysis)，製於培養箱(TAITEC，model：M˙BR-022UP)，於25 ℃，1500rpm震盪20分鐘後，3700rpm離心 10 分鐘，取上清液置於含有 100μl nickle rein 的 filtration plate 中流洗 10 分鐘，進行 binding，而後2000rpm，10 秒離心去掉所有上清液，分兩次加入1ml binding buffer 共2ml去除雜蛋白，再加入110μl elute buffer，震盪10 分鐘，離心後取10μl 檢視有無得到蛋白，剩餘 100μl 加入親和性層析純化的 96 孔盤 (PD MultiTrap G25) ，最後可得到平均濃度 0.1mg/ml的蛋白約100μl。以 Gel filtration resin的清洗方式，先以 300μl 二次去離子水沖洗五次，再使用 300μl、0.2M的 NAOH 隔夜浸泡 resin 以去除殘留蛋白，之後使用二次去離子水沖洗五次將NAOH洗淨，再用 20% 酒精保存。 - 16 -.

(31) 3. 高通量之蛋白表達與純化-熱變性純化法挑選 LB-Ampicillin agar plate 上之菌落，培養於1ml的96孔深盤，每個深孔孔內含500μl LB (100μg/mL Ampicilin )，在37℃培養箱 (TAITEC， model: M˙BR-022UP)，1500rpm隔夜震盪，取15μl菌液加入 2ml 的 96 孔深盤，每個深孔內含 300μl LB(100μg/mL Ampicilin，0.5mM IPTG)，於25℃，1500rpm，24hr誘導TtTS表現。之後加入 30 μl 破菌液 (Promega FastBreak lysis) ，製於培養箱 (TAITEC，model : MBR-022UP)，於25℃，1500rpm震盪 20 分鐘後，3700rpm離心 10 分鐘，取上清液 180μl 置於乾淨的96孔微量盤(Cat#: BL6072)，封上矽膠軟蓋(Labcon)，於PCR machine 80℃加熱 10 分鐘破壞雜蛋白，3700rpm離心 10 分鐘，上清液即為TtTS。四、蛋白質定量利用 Bradford 定量法（Bradford，1976），先以牛血清白蛋白（Bovine serum albumin）當作標準品，製備一組包含 0、0.1、0.2、 0.3、0.4 以及 0.5 μg/μL 等濃度系列之標準品，分別取 10 μL 標準品及待測樣品加入 96 孔微量滴定盤中，每槽加入五倍稀釋的染劑 200 μL ，使用 Multiskan™ FC Microplate Photometer (Thermo scinentific) 測定 595 nm 之吸光值，畫出標準校正線，並決定未知樣品之濃度。五、酵素反應 1. TtTS活性分析-High-performance liquid chromatography (HPLC) 取純化後TtTS與麥芽糖液(溶於20mM SPB，pH7.0)混合，使反應 - 17 -.

(32) 酵素終濃度為0.05 mg/ml，受質濃度為 125mM，反應於65℃與30℃，不同反應時間(0、0.5、1、2、4、8、12、24、36 小時)後，以PCR machine 於99℃加熱 10 分鐘終止酵素反應。TtTS與蔗糖溶液反應的酵素終濃度則為 0.3 mg/ml，受質濃度為 50mM，反應於65℃(0、0.33、0.67、 2、5、10、22 小時)與30℃(0、2、5、10、22、48、60 小時)；若為突變株則僅於最適作用溫度65℃反應(0、12、24 小時)，反應時間一到於99℃加熱 10 分鐘終止酵素反應。而後將樣品以 4mm PVDF 0.22μm syringe filter(MS® ，SFPVDF004022N)過濾，以HPLC分析，儀器設定條件如下 : 流速. 1.0 mL/min. 管柱恆溫. 分析麥芽糖反應物 : 60℃；分析蔗糖反應物 : 40℃. 偵測器. 40℃ 分析麥芽糖反應物 :. 移動相. Acetonitrile : ddH2O : formic acid =75:25:1 v/v% 分析蔗糖反應物 : Acetonitrile : ddH2O =85:15 v/v%. 幫浦. SFD 2100 Quaternary gradient pump. 偵測器. RI2000 Refractive index detector. 樣本體積. 20 μl. 分析時間. 15 分鐘. 管柱. 分析麥芽糖反應物 : Shodex SZ5532 6 x 150 (mm) 分析蔗糖反應物 : SUPELCOSIL LC-NH2 4.6 x 250(mm). 反應所得結果代入標準曲線(如下)算得濃度後，繪製橫軸為時間，縱軸為產物組成百分比，將所算得糖量除以總糖量求得百分比，來呈 - 18 -.

(33) 現酵素的反應結果。HPLC標準曲線製作如下 : 將葡萄糖(SIGMA， Cat#G5767) 、麥芽糖 (SIGMAC ， Cat#M5885) 、海藻糖 (SIGMA ， Cat#T9531)、果糖(SIGMA，Cat#F0127)、蔗糖(SIGMA，Cat#S7903) 配成不同濃度之標準溶液(1、5、10、25、50、75、100、150mM)，以專用注射針筒將上述標準溶液注入系統分析，每次樣本皆取20μl，並使用操作軟體紀錄HPLC分析圖譜。將分析圖譜之訊號峰積分所得面積為縱軸，標準品濃度為橫軸，繪製標準曲線。SZ5532管柱分析的波峰出現時間順序分別為葡萄糖(約 5 分)、麥芽糖(約 7 分)與海藻糖(約 9 分)；NH2管柱分析分析的波峰出現時間順序分別為果糖 (約 6 分)、葡萄糖(約 7 分)、蔗糖(約 11 分)與海藻酮糖(約 13 分)。取樣本與標準相同滯留時間下之訊號峰面積代入上述之標準曲線後，即可求得該樣本所含海藻糖濃度，其中海藻酮糖由於尚未得到標準品，其計算藉由原始反應蔗糖總量扣除反應後剩餘蔗糖以及產生副產物之果糖與葡萄糖量即為所求。 2. TS 酵素動力學分析麥芽糖與海藻糖之50μl 反應中，取 0.5μg TtTS 酵素加入不同濃度受質溶液(10、25、50、75、100、180、250、400、500、750、1000 mM)，分別於酵素反應線性時間內：65℃反應 10 分鐘，30℃反應 30 分鐘，此外，為了檢測葡萄糖對 TtTS 反應影響，另外取 0.6μg TtTS 加入含15mM 葡萄糖之不同濃度麥芽糖受質在65℃反應10分鐘；蔗糖之60μl反應中，取 6μg TtTS 與不同濃度受質溶液(10、40、 60、80、100、200、400、600、800、1000、1500 mM)，於酵素反應線性時間內：65℃反應 1 小時，30℃反應 12 小時；待反應時間到，以 PCR machine 99℃，10 分鐘終止反應，將高於標準曲線範圍 - 19 -.

(34) 濃度之樣本稀釋後，以HPLC分析海藻糖、麥芽糖及海藻酮糖的量，以μmol/min 代表反應速率 (V) 橫軸繪以不同反應物之濃度，利用 Origin軟體繪製Michaelis-Menten 酵素動力圖，計算 KM 值與 Vmax 值，當受質濃度遠大於KM 時，Kcat = Vmax/[enzyme]，因此將Vmax 值除以反應酵素量(μmol)求得 Kcat 值，其中，酵素量(μmol )= 酵素總量( μg) / 酵素分子量(112263.2 Da)。酵素分子量計算是藉由Bioedit 軟體的protein composition分析。 3. TS 突變株篩選-Maltase-coupled TS assay 反應原理如附錄十一，取純化後 10μl TtTS與 125mM 麥芽糖液 (溶於 20mM SPB(pH7.0)混合，反應 65℃，為避免蛋白經去鹽純化系統後有蛋白量不同所導致突變株達到最大轉化率時間的差異，進行短時間與長時間等反應時間(12hr、24hr、48hr，熱純化處理蛋白則反應8hr、16hr)，以 PCR machine於 99℃ 加熱 10 分鐘終止酵素反應。取 10μl 反應後樣本與70μl 20mM SPB，pH = 4.0 與 20 μl Maltase(0.03U，amyloglucosidase from Aspergillus niger，SIGMA， Cat#A7095)於96孔盤內 60℃ 反應 30 分鐘，同時取125mM麥芽糖無酵素進行同樣的反應做為控制組。將反應完溶液稀釋 100 倍，取 25μl 加入 50μl Glucose assay reagent(SIGMA，Cat#GAGO20)於 37 ℃ 反應 30 分鐘，最後加入 50μl、12N H2SO4 呈色，再將此96孔盤放入ELISA reader讀取OD540nm吸光值，代入葡萄糖標準品所繪製的標準曲線(如下)公式中，乘回稀釋倍數，計算對照組葡萄糖量與樣本葡萄糖量相減所得差值得到海藻糖量，再將此數值除以對照組換算成百分比算得轉化率。所得結果以突變株於96孔盤位置編號為橫 - 20 -.

(35) 軸，轉化率為縱軸繪製圖表，其中A1位置固定為野生型TtTS (WT)， A2位置為無加入酵素反應之對照組，因此A2並不繪製於圖表上。葡萄糖標準曲線 : 先製備1mg/ml葡萄糖溶液，再分別稀釋成12.5、 25、50、100、150、200μg/ml等濃度，取不同濃度葡萄糖標準品25μl 加入50μl Glucose assay reagent於 37℃ 反應 30 分鐘，最後加入 50μl、12N H2SO4呈色，再將此96孔盤放入ELISA reader讀取OD540nm 吸光值，橫軸為濃度，縱軸為吸光值，繪製標準曲線圖。六、以澱粉製備α-麥芽糖為主的反應受質 1. 配置可溶性澱粉秤取 10 g可溶性澱粉(SIGMA，cat#S2630)與50mL冷水混合，以攪拌方式徐徐倒入150ml沸水中滾煮糊化至澄清狀態後熄火，定量至總體積為200mL(為5%澱粉溶液)，冷卻至室溫後立即用以反應。放置於室溫約莫三天後，因澱粉分子重新排列形成氫鍵，會產生不溶性的乳白色沉澱。 2. 置備α-麥芽糖取1μL千倍稀釋的α-amylase(SIGMA，Cat#A3306)，與上述配置好的澱粉溶液 200μL 於 85℃ 分別反應 5 分鐘、15 分鐘、30 分鐘，可得到不同數量含α-還原端之寡糖，以 100℃ 反應 10 分鐘終止α-amylase作用，立即加入糖化酵素β-amylase (SIGMA，Cat#A7005) 與TtTS一同反應，將生成之麥芽糖供給TtTS反應。 3. 酵素反應α-麥芽糖. - 21 -.

(36) 40μL β-amylase與40μL TtTS(終濃度為0.05μg/μL)，於55℃進行不同反應時間(0、10、20、40、60、180、360、600 分鐘)後，100℃ 反應 10 分鐘終止酵素作用，產物分析以HPLC進行定量。七、Glucose isomerase(GI)-偶合之TtTS反應反應分為兩部分，第一部分為 GI-coupled TtTS之反應，取 50μg TtTS(反應終濃度為0.05mg/mL)與 125mM 麥芽糖液(20mM sodium phosphate buffer pH7.0)，分別加入 40mg、100mg GI 於65℃摩天輪翻轉反應0、0.5、1、2、4、12小時，以100℃熱水浴10分鐘終止反應，產物分析以HPLC定量。其中對照組no GI處理組別，為加入 40mg GI 與麥芽糖溶液先於100℃反應10分鐘，使GI失活後再加入TtTS反應。另一部分為在不同時間加入 GI-coupled TtTS 之反應，取 50μg TtTS(反應終濃度為 0.05mg/mL) 與 125mM 麥芽糖液(溶於 20mM SPB，pH7.0)，加入 20mg GI 於 65℃ 摩天輪翻轉反應，以GI 加入的時間分為 GI-0，GI-1，GI-2，GI-3 處理組別，GI-0 代表GI 與 TtTS 同時間加入反應，GI-1 則代表 TtTS 反應 1 小時後再加入 GI 反應，依此類推，並皆在加入 GI 後繼續反應 1、2、4、12 小時。其中 no-GI 處理組別與上述方法相同。反應時間到，於100℃熱水浴 10 分鐘終止反應，產物分析以HPLC定量。八、模擬 TtTS 蛋白質三級結構將 TtTS 蛋白質 N 端屬於海藻糖合成酶的胺基酸序列輸入蛋白質資料庫(Protein Data Bank，PDB)中，藉由蛋白質三級結構模擬網站 (Swiss-Model)進行胺基酸序列比對(BLAST)，搜尋最相似胺基酸序列的已知結構蛋白作為模板，建立 TtTS 蛋白質三級結構，並利用分子 - 22 -.

(37) 結構顯示軟體(PyMol)進行結構的顯示、疊合(superimposition)。九、模擬 TtTS 與麥芽糖的複合物立體結構藉由化合物資訊中心 (Hetero-Compound Information Centre ， HIC-Up)下載麥芽糖的分子結構模型。藉由電腦模擬分子嵌合軟體 (AutoDock Vina)模擬 TtTS 與麥芽糖的複合物立體結構，透過標記 TtTS 活性位置催化胺基酸設立嵌合範圍，進行能量最適化分析。十、TtTS 蛋白質工程輸入 Pymol 語法 select br. polymer within 5Å of TtTS 尋找距離麥芽糖 5Å 所有胺基酸，選擇具有改善 TtTS 異構化性質之胺基酸，以下列方法進行突變，所得突變株依方法五.3.進行活性篩選 : 1. 定位突變引子設計每個突變點設計一條引子，序列中間包含欲突變之核苷酸，並利用靜默突變搜尋 (silent mutation scanning) 的 Watcut 網站 (http;//watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=silent_new)，設計含有新限制酶切位之引子，以便進行突變株篩選(表一)。 2. 定位飽和突變引子設計每個突變點設計一條引子，序列中間包含欲突變之核苷酸設計成 NNK，只需要 150 個菌株即能取代成各種胺基酸 (Kretz et al., 2004)(表一)。. 3. 點突變PCR. - 23 -.

(38) 根據QuickChange Osite-Directed Mutagenesis kit方法修改而來， PCR總反應體積為50μL，組成如下： Volume(μL). Components Phusion DNA polymerase 5X buffer. 10. Template DNA. 1. Primer(10 μM). 2.5. dNTPs(2 mM). 4. ddH2O. 32. Phusion DNA polymerase(1U). 0.5. 進行點突變實驗中，為避免額外的突變發生而選擇具有校正功能之聚合酶(Phusion DNA polymerase)，反應流程如附錄八，反應結束加入 0.5μL DpnI ，於 37 ℃ 作用 4 小時，切除具有甲基化之 ds DNA，避免模板DNA片段經轉型而產生的背景值影響突變株的篩選。 4. 多點飽和突變引子設計利用 Wang 等人方式設計引子包含突變位置，藉由 overlapping PCR 方式創造包含所有突變位置的 megaprimer (Wang et al., 2007a)(表二)。 5. 多點飽和突變PCR 依照附錄九流程，進行三次PCR。 PCR I 和 PCRII 的做法與點突變PCR流程一致，得到的產物藉由Geneaid廠牌之GenepHlowTM - 24 -.

(39) Gel/PCR kit 純化DNA後定量，取等量之 PCR I 和 PCR II 的產物進行第三次 PCR ，得到的產物以 DNA 電泳確認大小後進行 gel purification，得到megaprimer與含TtTS質體DNA以莫爾數 40 : 1 的比例進行PCR，反應總體積為 100μL，組成如下 : Volume(μL). Components Phusion DNA polymerase 5X buffer. 20. Template DNA. 1.6. Megaprimer. 3.2. dNTPs(2 mM). 8. ddH2O. 66.2. Phusion DNA polymerase(1U). 1. 反應流程如附錄八，反應結束加入0.5μL DpnI，於 37℃ 作用 4 小時，切除具有甲基化之ds DNA，避免模板DNA片段經轉型而產生的背景值影響突變株的篩選。 6. 隨機突變引子設計由於突變後基因需要藉由限制酶移轉至表達載體上，因此在TtTS 全基因之5端與3端引子設計上，須含有 NdeI 與 SalI 切位，且一併置於引子之3端，可避免後續限制酶作用時基因片段過短導致限制酶作用效率不佳的問題。 7. 隨機突變error-prone PCR(ep PCR) 為避免隨機突變中的突變偏誤(mutational bias，ex Taq polymerase - 25 -.

(40) 偏向 A，TN)減少基因的突變數量，採用 Mutazyme II (Agilent) 作為 error-prone PCR 酵素，並依據 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit 方法，調整加入模板 DNA 的量，來控制基因突變率為每一千個鹼基有三個突變鹼基，屬於突變率低的組別(附錄十)，PCR 總反應體積為 100μL 組成如下： Volume(μL). Components 10x Mutazyme II reaction buffer. 10. Tmplate DNA. 20. Forward/Reverse Primer(10 μM). 5/5. dNTPs(40mM). 2. ddH2O. 56. Phusion DNA polymerase(2.5U/μL). 2. 突變率為 0-4.5 bp/Kb 時所添加的 TS DNA 量為 500-1000 ng，又 TS 佔總質體比例約 46% (2898 bp / 6506 bp)，依據換算得到需加全質體 DNA 1μg，PCR 反應流程如附錄八。 8. 限制酵素切割與 DNA 接合將 epTtTS 基因使用兩種限制酶進行切割(SalI 和 NdeI，Biolab) 以產生兩端不同的 sticky end，另一方面，為了減少背景值干擾，使用載有不同基因之 pET-23b 質體進行相同限制酵素的切割，並操作 Gel elution kit 取得質體片段與 epTtTS 基因。將兩種 DNA 片段以莫爾數 1 : 3 進行混合，並添加 T4 DNA Ligase (總反應體積的 1/20)與 10X Ligase buffer，放於 4℃ 隔夜。之後取 Ligation 樣本 5μL 進行 - 26 -.

(41) 轉型作用，而剩餘樣本可冰於 -20℃ 等待往後使用。. 肆、結果一、TtTS 活性分析 1. TtTS 轉化率依據方法五.1.進行活性分析，結果顯示 TtTS 於最適作用溫度 65 ℃下反應麥芽糖，海藻糖最大轉化率為 52.1%；反應海藻糖，麥芽糖轉化率為 31.5%；反應蔗糖，海藻酮糖轉化率則為 59.8%，會伴隨些許異麥芽酮糖生成約 2.1%(圖一)。低溫 30℃時，海藻糖產率提升至 71.2%，麥芽糖生成仍只有 28.3%，海藻酮糖生成則提升至 87.8%，但並無生成麥芽酮糖(圖二)。 2. TtTS 動力學依方法五.2.進行酵素動力學，結果顯示，65℃反應麥芽糖 KM 為 79.8 mM，海藻糖生成 Vmax 為 0.039 μmol/min，30℃時 KM 為 28.7 mM，Vmax 為 0.003 μmol/min；65℃反應海藻糖 KM 為 98.0 mM，麥芽糖生成 Vmax 為 0.034 μmol/min；30℃時 KM 為 85.1 mM，Vmax 為 0.004 μmol/min；65℃反應蔗糖 KM 為 281.6 mM，海藻酮糖生成 Vmax 為 0.031 μmol/min；30℃時 KM 為 282.0 mM，Vmax 為 0.003 μmol/min (圖三 A~F)，若額外添加 15mM 葡萄糖於麥芽糖中，TtTS 65℃反應麥芽糖 KM 為 374.1mM，Vmax 為 0.048 μmol/min(圖三 G)。進一步統整高溫與低溫反應不同受質所得結果，分析 TtTS 各反應的催化效率(catalytic efficiency)，即 Kcat 與 KM 比值，顯示麥芽糖為 TtTS 最適作用受質，有最高的催化效率為 1.83 (圖三 H)，額外添加 15mM - 27 -.

(42) 葡萄糖，會使得 KM 上升，但 Vmax 值沒有減少(較高之值，應為誤差)，顯示葡萄糖為競爭性抑制，使得 TtTS 整體催化效率從 1.81 降為 0.42 (圖三 I )。二、以 α-麥芽糖為主的 TtTS 反應分析依方法六.3 進行酵素反應，由於搭配 β-amylase，會水解寡糖成麥芽糖使總糖量持續增加，因此以海藻糖絕對量隨時間變化作圖，結果顯示，反應一小時內，要產生 35μg 海藻糖，α-amylase 處理 30 分鐘組別較處理 5 分鐘組別所需反應時間快了一倍，然而以長時間反應來看，最終產生海藻糖量並無差異(圖四)。三、GI-coupled TtTS 反應分析在GI-coupled TtTS 之反應，依方法七.加入 GI 的量為 TtTS量 (50μg)的2000倍(100mg)，會使 TtTS 異構化作用明顯偏向水解反應生成葡萄糖，比起沒有GI的組別，TtTS反應 30 分鐘產生的海藻糖量從 41.2mM 降為 4.9mM，且使最終海藻糖產量從反應 2 小時能達到 70.8mM 延長至 12 小時只有 54.3mM；將GI量減至TtTS量 (50μg) 的800 倍 (40mg) 時，仍會使得 TtTS 達到海藻糖最大產量 69.3mM 時間延長至 4 小時(圖五)。而在不同時間加入GI-coupled TtTS之反應，減低 GI 加入量為 TtTS 量的400倍(20mg)，並且控制 GI加入時間，結果顯示，這樣比例的GI與TtTS一起反應能減少水解副反應葡萄糖的抑制作用，使TtTS反應速率提升。沒有加入GI的組別達到 50% 海藻糖轉化時間為 8 小時，而加入 GI，則可使達到海藻糖 50% 轉化所需時間縮短為 4 小時，其中控制 GI 加入時間. - 28 -.

(43) 為TtTS反應後 1 小時，可使達到海藻糖 50% 轉化時間縮短為 3 小時(圖六)。四、模擬 TtTS 蛋白質三級結構聚焦於 TtTS 具有海藻糖合成酶催化性質的 N 端序列胺基酸序列 (~540a.a)置於 PDB 資料庫進行比對，相似度高於 40%以上的蛋白質為已經解出結構的海藻糖合成酶，分別來自 Mycobacterium smegmatis (PDB entry: 3ZO9，MsTS)、Mycobacterium tuberculosis (PDB entry: 4LXF，MtTS)、Deinococcus radiodurans(PDB entry: 4TVU，DrTS)其胺基酸序列與 TtTS 有 50%以上的一致性，另外依照催化性質還有兩類酵素，一類是只有水解活性的水解酶(hydrolase)，如: Geobacillus HTA-462 α-glucosidase、Halothermothrix orenii α-amylase、Bacillus subtilis isomaltase；另一類是具有異構化 (isomerization)活性的蔗糖異構酶(sucrose isomerase，SI)，如: Pseudomonas mesoacidophila MX-45 trehalulose synthase(PDB entry :1ZJA)或 Protaminobacter rubrum isomaltulose synthase(PDB entry :3GBD)(表三)。其中與 TtTS 相似最高的蛋白 MsTS，因胺基酸 Leu344 佔據，阻擋了受質結合位，相似度次之的 MtTS 也因為其結構缺少 S7 區域而使活性位呈現開放狀態，因此我們選擇相似度也極高而活性位置呈現完整封閉的 DrTS 作為 TtTS 結構模擬模板，方便進行酵素與受質作用關係的探討(附錄六)。利用 Swiss-Model 進行 TtTS 蛋白質三級結構模擬，以 DrTS 為模板，模擬片段為 3 到 534 個胺基酸，胺基酸序列之間的一致性為 57%。模擬的 TtTS 結構中央由(β/α)8 的桶狀結構所組成，胺基酸包含 3-102、175-303、351-372 - 29 -.

(44) 與 440-451(紅色)，末端 C 區域由反向平行的 β 摺疊所組成，胺基酸包含 452-534(淡藍色)，DrTS 參與受質進出開關的 S7 區域以及 B 區域，對應 TtTS 為 304-350(S7 區域，綠色)、103-174(B 區域，深藍色)，還有富含環狀但無明顯二級結構的 S8 區域，胺基酸包含 373-439(黃色)(圖七)。五、模擬 TtTS 與麥芽糖的複合物立體結構利用 AutoDock Vina 軟體將麥芽糖嵌合入 TtTS 蛋白質分子三級結構，嵌合範圍選定催化性胺基酸 ASP199，ASP308，GLU242 位置，進行能量最適化運算，挑選結合能最低的結構(圖八)。結果顯示，麥芽糖所結合的位置與 DrTS 活性中心模擬的麥芽糖結合位置相似，其中非還原性端葡萄糖在-1 subsite 結構相同，而+1subsite 有些微不同 (圖九)，選定 TtTS 與麥芽糖距離 5Å 之內共有 18 個胺基酸(圖十)，依據空間位置分類，在-1subsite 胺基酸分別為 Asp60、Tyr63、His103、 Gln167、Arg197、Asp199、Glu242、His307、Ap308、Arg387，而 +1subsite 胺基酸為 Ile140、Phe141、Phe163、Ala200、Tyr203、Asn244、 Glu309、Glu313，利用 Pymol 軟體分析麥芽糖分子與胺基酸作用力整理(表四)，其中+1subsite 和麥芽糖無明顯作用力的胺基酸有 6 個分別為 Ile140、Phe141、Phe163、Ala200、Tyr203，Asn244。比對與 TtTS 三級模擬結構相似的 GH13 family 蛋白(表五)，分析位於+1 subsite 與麥芽糖無明顯作用力的 6 個胺基酸，發現 Ile140、Phe141、 Phe163、Asn244 於水解酵素中有相同的胺基酸，推測可能因此參與水解作用，能透過突變進行改造；而 Ala200、Tyr203 屬於 TS unique 的胺基酸，對 TS 異構化作用可能扮演重要的腳色，因此不納入突變 - 30 -.

(45) 設計(表六)。. 六、TtTS 蛋白質工程 1. TtTS 定位突變四個可能扮演重要催化角色的胺基酸中，以 Phe141、Phe163 於 GH13 成員中最為保守，因此將此兩個位點進行定位突變成極性胺基酸，包含維持與原胺基酸空間類似的 Tyrosine，及縮小胺基酸側鏈為 Serine，分別為 : Phe141Tyr(TTC→TAC)、Phr141Ser(TTC→TCC)、 Phe163Tyr(TTC→TAC)、Phe163Ser(TTC→TCC)。依據方法十.3.進行點突變，並以限制酶篩選突變株進行自動核苷酸定序圖譜分析(圖十一-A) ，定序結果與 WT 基因比對，確認突變皆完成後，進行蛋白質表達與純化，所得突變株與 WT 純度和表達量相近(圖十三-A)。依據方法五.1.進行突變株轉化率分析，結果顯示 Phe141Tyr、Phe141Ser 突變株失去異構化能力，僅剩部分水解作用，Phe141Tyr 正反應水解為 9.6%，逆反應水解為 4.6%，蔗糖水解為 2.1% (圖十四)，Phe141Ser 突變株正反應水解為 6.2%，逆反應水解為 2.5%，蔗糖水解為 1.4% (圖十五)；而 Phe163Tyr 突變株仍保有異構化能力，但正反應、逆反應以及蔗糖異構化效率降為野生型 TtTS 的 1/3，分別為 21.3%、13.2% 及 22.6% ，水解作用則分別為 16.2%、19.2%及 19.2% (圖十六)； Phe163Ser 對麥芽糖及蔗糖無反應，而異構化海藻糖及水解比率皆為 3% (圖十七)。 2. TtTS 定位飽和突變將四個可能扮演重要催化角色的胺基酸進行定位飽和突 - 31 -.

(46) 變，分別為 : Phe141X(TTC→NNK)、Phe163X(TTC→NNK)、 Ile140(ATC→NNK)、Asn244(AAC→NNK)，依據方法十.3.進行定位飽和突變，並分別挑選 200 顆轉型菌株作為突變庫，以自動核苷酸定序圖譜分析(圖十一 B)，確認突變位置包含核苷酸多樣性，進行 WT 與突變株蛋白質表達與純化，所得突變株與 WT 純度和表達量以去鹽純化方式會有所差異，但以熱處理方式則相近(圖十三-B、C)。依據方法五.3. 進行突變株轉化率分析，以 96 孔盤為突變庫單位，每個位點共建立三盤突變庫，以 WT(A1)之最高轉化率為分界，挑選具有高於 A1 轉化率之突變株以及隨著反應時間，轉化率持續上升之突變株，F141X 挑選了 27 隻突變株(圖十八)，F163X 挑選了 5 隻(圖十九)，依方法三.1.進行放大 20X 培養，依方法三.2.表達蛋白、去鹽純化(圖二十)，以 HPLC 分析放大後酵素最高轉化率(圖二十一)，結果顯示，所有篩選出的 32 隻突變株於 65℃反應之海藻糖最大轉化率均與 WT 相當。以方法三.3 進行蛋白表達與純化後反應之 I140X 挑選了 27 隻突變株(圖二十二)，N244X 挑選了 11 隻突變株(圖二十三)，以 HPLC 進行二次分析，確認突變株轉化率皆無高於 WT(與圖二十一結果相近)。 3. TtTS 多點飽和突變依據方法十.5.進行多點飽和突變，挑選 1000 顆轉型菌株作為突變庫，以自動核苷酸定序圖譜分析(圖十一 C) ，確認突變位置包含核苷酸多樣性，取 WT 與突變株以方法，所得突變株與 WT 純度和表達量以去鹽純化方式會有所差異，但以熱處理方式則相近(圖十三 -B、C)。依據方法五.3. 進行突變株轉化率分析，以 96 孔盤為突變庫單位，每個位點共建立十盤突變庫，以 WT(A1)之最高轉化率為分 - 32 -.

(47) 界，挑選高於 A1 轉化率之突變株以及隨著反應時間，轉化率持續上升之突變株共 24 隻(圖二十四)，進行二次分析，確認突變株轉化率皆無高於 WT(與圖二十一結果相近)。 4. TtTS 隨機突變依據方法十.7.進行隨機突變，並隨機挑選兩樣品以自動核苷酸定序圖譜分析 5 端與 3 端各 900 個鹼基，其中突變株 1 之 5 端定序結果判讀第 884 核苷酸為 T 但透過定序圖譜確認此位置應仍為 C，因此胺基酸仍維持為 Proline(CCC→CCT)而非 Leucine(CTT)，突變率依據判讀核苷酸數量中所含突變之比例，平均 5 端與 3 端定序突變率，可得兩突變株之突變率與設定值相近，為每一千個鹼基含三個突變，這樣突變率下所得胺基酸改變，突變株 1 結合 5 端與 3 端定序結果，為 3 個以上胺基酸，而突變株 2 則為 4 個以上胺基酸(圖十二)。依方法三.3..進行蛋白表達純化(蛋白表達結果與圖十三-C 一致)。依據方法六.3. 進行突變株轉化率分析，以 96 孔盤為突變庫單位，每個位點共建立十盤突變庫，以 WT (A1)之最高轉化率為分界，挑選高於 A1 轉化率之突變株以及隨著反應時間，轉化率持續上升之突變株共 24 隻(圖二十五)，進行二次分析，確認突變株轉化率皆無高於 WT 與圖二十一結果相近)。 5. 定序突變株定位飽和突變挑選轉化率與 WT 相當以及失去活性之突變株各 3 隻進行定序，發現轉化率維持與 WT 相當之突變株除了 I140V，其餘位點皆為 WT；失去活性之突變株則突變成不同胺基酸(表七)；而多點飽和突變則各挑 5 隻定序，其中一突變株轉化率與 WT 相當之組合為 I140、F140L、F163V、N244，其餘皆為 WT；失去活性之突變 - 33 -.

(48) 株則突變成不同胺基酸(表八)。. 6. 定序之突變株轉化蔗糖產率分析確認序列之突變株依方法五.1.反應蔗糖之海藻酮糖最大轉化率與反應麥芽糖所得產物組成結果合併(表九)，可發現能異構化麥芽糖之突變株，能力與異構化蔗糖相當，而完全無法異構化或水解麥芽糖之突變株，對於蔗糖同樣沒有反應。如多點飽和突變株 I140、 F140L、F163V、N244，海藻糖最大轉化率為 50.4%，海藻酮糖最大轉化率 58.2%，與 WT 相當，而突變株 I140A 對麥芽糖與蔗糖皆無反應，這樣的結果顯示 TtTS 具有相同活性中心，是透過類似的催化方式異構化麥芽糖與蔗糖；其中，N244V 突變株異構化蔗糖生成產物偏向異麥芽酮糖，從 WT 海藻酮糖與異麥芽酮糖組成比為 30 : 1 變為 1: 1.5，顯示 N244 位點可決定產物專一性(product specificity)。. - 34 -.

(49) 伍、討論一、TtTS 活性分析 TtTS 於低溫時有較高的海藻糖轉化率，或許可從水解副反應以及酵素動力學間的正逆反應催化效率來探討。正反應的葡萄糖水解量在低溫下為 5.32%明顯比高溫的 12.71% 為低 (圖一與圖二)，使得海藻糖產率從 53.9% 提升至 71% ；反觀，逆反應水解於高溫 (19.92%)，低溫(20.25%) 都維持較高的比例，使得麥芽糖產率皆只有約 30% 。這樣的結果顯示水解作用降低是提升 TtTS 海藻糖轉化率的關鍵；此外，也意味著低溫下 TtTS 結構，以麥芽糖為受質時可避免水分子進入催化中心阻斷異構化作用而減少葡萄糖的生成，然而以海藻糖為受質時，高溫與低溫下的結構，皆容易生成水解反應。除了水解作用影響，隨著溫度上升而增加的逆反應催化效率 (kcat/KM)同樣影響 TtTS 轉化率的高低(圖三、H)。分析正反應與逆反應的催化效率，顯示低溫時，正反應催化效率(0.39)為逆反應(0.18) 的 2.2 倍。當反應溫度升高，正反應催化效率(1.83)僅為逆反應(1.3) 的 1.4 倍，亦即逆反應催化效率因升溫而提升了 7.2 倍(從 0.18 至 1.3)，而正反應催化效率卻只提升 4.7 倍(0.39 至 1.83)，此結果會使低溫時反應偏向海藻糖生成，但當溫度升高，逆反應增加，則會將海藻糖再轉化為麥芽糖，因此於 TtTS 最適溫度下作用，海藻糖轉化率反而較低溫反應來的低。水解反應影響轉化率高低的現象在蔗糖異構化成海藻酮糖也可發 - 35 -.

(50) 現，高溫時水解單糖含約 34.2%，海藻酮糖含約 60%，隨著溫度下降，單糖產率剩下約 5%，使得海藻酮糖產率增加為約 88%(圖一與圖二)，此外，高溫時有些微比例(2.1%)的異麥芽酮糖生成，也反映了活性中心口袋於高溫時的不穩定狀態，會使得異構化作用中糖甘鍵結形成較不專一，能從蔗糖(α-β-1,2)形成海藻酮糖(α-β-1,1)與異麥芽酮糖(α-β-1,6)。至於 TtTS 是否會反應海藻酮糖而有逆反應，雖需要得到海藻酮糖標準品進一步反應證實，但從高溫蔗糖反應持續消耗現象可以推測，應無逆反應的形成(圖一)。二、以 α-麥芽糖為主的 TtTS 反應分析一般麥芽糖製作流程是先將澱粉於水中加熱，使澱粉粒糊化後容易被澱粉液化酶 α-amylase 水解成含有 α 還原端之寡糖，再藉由糖化酵素 β-amylase 水解寡糖之非環源端產生含有 β 還原端的 β-麥芽糖，當 β-amylase 作用寡糖到最末還原端時則會產生 α-麥芽糖，而藉由結晶作用形成麥芽糖晶體時，會因為 α-構型熔點較 β-構型高 30℃，使得最後製得麥芽糖晶體以 β-構型居多(Xiaoling, 1998)。雖然當麥芽糖晶體溶於水中會發生自發性變旋作用產生 α-麥芽糖，但最終平衡時兩構型的比例接近 1 : 1 (Weise et al., 2005)。因此為了得到 α-構型為主的麥芽糖，本研究利用控制 α-amylase 作用時間長短，以控制 α 還原端寡糖之數量，之後同時加入 β-amylase 與 TtTS 一同反應，是為了避免單獨以 β-amylase 完全作用 α 寡糖後，所產生的 α-麥芽糖受到變旋作用又再轉變成 β-麥芽糖。依據前人的實驗顯示達到平衡比例所需的半生期約為 38 分鐘(Bailey et al., 1967)。從最後的 TtTS 反應結果來看(圖四、B)，只有一小時內 TtTS 反應速率有因為 α-amylase 處理較久而提升，再長時間的海藻糖產量不論任何處理組皆相近， - 36 -.