反應原理如附錄十一，取純化後 10μl TtTS與 125mM 麥芽糖液 Maltase(0.03U，amyloglucosidase from Aspergillus niger，SIGMA，
Cat#A7095)於96孔盤內 60℃ 反應 30 分鐘，同時取125mM麥芽糖 無酵素進行同樣的反應做為控制組。將反應完溶液稀釋 100 倍，取 25μl 加入 50μl Glucose assay reagent(SIGMA，Cat#GAGO20)於 37
℃ 反應 30 分鐘，最後加入 50μl、12N H2SO4 呈色，再將此96孔盤 放入ELISA reader讀取OD540nm吸光值，代入葡萄糖標準品所繪製的 標準曲線(如下)公式中，乘回稀釋倍數，計算對照組葡萄糖量與樣本 葡萄糖量相減所得差值得到海藻糖量，再將此數值除以對照組換算 成百分比算得轉化率。所得結果以突變株於96孔盤位置編號為橫
- 21 - 50μl、12N H2SO4呈色，再將此96孔盤放入ELISA reader讀取OD540nm 吸光值，橫軸為濃度，縱軸為吸光值，繪製標準曲線圖。
六、以澱粉製備α-麥芽糖為主的反應受質 1. 配置可溶性澱粉
秤取 10 g可溶性澱粉(SIGMA，cat#S2630)與50mL冷水混合，以 攪拌方式徐徐倒入150ml沸水中滾煮糊化至澄清狀態後熄火，定量至
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40μL β-amylase與40μL TtTS(終濃度為0.05μg/μL)，於55℃進行不 同反應時間(0、10、20、40、60、180、360、600 分鐘)後，100℃ 反 應 10 分鐘終止酵素作用，產物分析以HPLC進行定量。
七、Glucose isomerase(GI)-偶合之TtTS反應
反應分為兩部分，第一部分為 GI-coupled TtTS之反應，取 50μg TtTS(反應終濃度為0.05mg/mL)與 125mM 麥芽糖液(20mM sodium phosphate buffer pH7.0)，分別加入 40mg、100mg GI 於65℃摩天輪 翻轉反應0、0.5、1、2、4、12小時，以100℃熱水浴10分鐘終止反應， 資料庫(Protein Data Bank，PDB)中，藉由蛋白質三級結構模擬網站 (Swiss-Model)進行胺基酸序列比對(BLAST)，搜尋最相似胺基酸序列 的已知結構蛋白作為模板，建立 TtTS 蛋白質三級結構，並利用分子
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結構顯示軟體(PyMol)進行結構的顯示、疊合(superimposition)。
九、模擬 TtTS 與麥芽糖的複合物立體結構
藉 由 化 合 物 資 訊 中 心 (Hetero-Compound Information Centre ， HIC-Up)下載麥芽糖的分子結構模型。藉由電腦模擬分子嵌合軟體 (AutoDock Vina)模擬 TtTS 與麥芽糖的複合物立體結構，透過標記 TtTS 活性位置催化胺基酸設立嵌合範圍，進行能量最適化分析。
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根據QuickChange Osite-Directed Mutagenesis kit方法修改而來，
PCR總反應體積為50μL，組成如下：
Components Volume(μL)
Phusion DNA polymerase 5X buffer 10
Template DNA 1
Primer(10 μM) 2.5
dNTPs(2 mM) 4
ddH2O 32
Phusion DNA polymerase(1U) 0.5
進行點突變實驗中，為避免額外的突變發生而選擇具有校正功能之 聚合酶(Phusion DNA polymerase)，反應流程如附錄八，反應結束加 入0.5μL DpnI ， 於 37 ℃ 作 用 4 小 時 ， 切 除 具 有 甲 基 化 之 ds DNA，避免模板DNA片段經轉型而產生的背景值影響突變株的篩 選。
4. 多點飽和突變引子設計
利用 Wang 等人方式設計引子包含突變位置，藉由 overlapping PCR 方 式 創 造 包 含 所 有 突 變 位 置 的 megaprimer (Wang et al., 2007a)(表二)。
5. 多點飽和突變PCR
依照附錄九流程，進行三次PCR。 PCR I 和 PCRII 的做法與點 突變PCR流程一致，得到的產物藉由Geneaid廠牌之GenepHlowTM
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Gel/PCR kit 純化DNA後定量，取等量之 PCR I 和 PCR II 的產物進 行 第 三 次 PCR ， 得 到 的 產 物 以 DNA 電 泳 確 認 大 小 後 進 行 gel purification，得到megaprimer與含TtTS質體DNA以莫爾數 40 : 1 的 比例進行PCR，反應總體積為 100μL，組成如下 :
Components Volume(μL)
Phusion DNA polymerase 5X buffer 20
Template DNA 1.6
Megaprimer 3.2
dNTPs(2 mM) 8
ddH2O 66.2
Phusion DNA polymerase(1U) 1 反應流程如附錄八，反應結束加入0.5μL DpnI，於 37℃ 作用 4
7. 隨機突變error-prone PCR(ep PCR)
為避免隨機突變中的突變偏誤(mutational bias，ex Taq polymerase
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偏向 A，TN)減少基因的突變數量，採用 Mutazyme II (Agilent) 作 為 error-prone PCR 酵素，並依據 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit 方法，調整加入模板 DNA 的量，來控制基因突變率為每一千個 鹼基有三個突變鹼基，屬於突變率低的組別(附錄十)，PCR 總反應體 積為 100μL 組成如下 ：
Components Volume(μL)
10x Mutazyme II reaction buffer 10
Tmplate DNA 20
Forward/Reverse Primer(10 μM) 5/5
dNTPs(40mM) 2
ddH2O 56
Phusion DNA polymerase(2.5U/μL) 2
突變率為 0-4.5 bp/Kb 時所添加的 TS DNA 量為 500-1000 ng，又 TS 佔總質體比例約 46% (2898 bp / 6506 bp)，依據換算得到需加全質體 DNA 1μg，PCR 反應流程如附錄八。
8. 限制酵素切割與 DNA 接合
將 epTtTS 基因使用兩種限制酶進行切割(SalI 和 NdeI，Biolab) 以產生兩端不同的 sticky end，另一方面，為了減少背景值干擾，使 用載有不同基因之 pET-23b 質體進行相同限制酵素的切割，並操作 Gel elution kit 取得質體片段與 epTtTS 基因。將兩種 DNA 片段以莫 爾數 1 : 3 進行混合，並添加 T4 DNA Ligase (總反應體積的 1/20)與 10X Ligase buffer，放於 4℃ 隔夜。之後取 Ligation 樣本 5μL 進行
- 27 - 71.2%，麥芽糖生成仍只有 28.3%，海藻酮糖生成則提升至 87.8%，
但並無生成麥芽酮糖(圖二)。 催化效率(catalytic efficiency)，即 Kcat 與 KM比值，顯示麥芽糖為 TtTS 最適作用受質，有最高的催化效率為 1.83 (圖三 H)，額外添加 15mM
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三、GI-coupled TtTS 反應分析
在GI-coupled TtTS 之反應，依方法七.加入 GI 的量為 TtTS量 (50μg)的2000倍(100mg)，會使 TtTS 異構化作用明顯偏向水解反應 生成葡萄糖，比起沒有GI的組別，TtTS反應 30 分鐘產生的海藻糖
- 29 - 為已經解出結構的海藻糖合成酶，分別來自 Mycobacterium
smegmatis (PDB entry: 3ZO9，MsTS)、Mycobacterium tuberculosis (PDB entry: 4LXF，MtTS)、Deinococcus radiodurans(PDB entry:
4TVU，DrTS)其胺基酸序列與 TtTS 有 50%以上的一致性，另外依照 催化性質還有兩類酵素，一類是只有水解活性的水解酶(hydrolase)，
如: Geobacillus HTA-462 α-glucosidase、Halothermothrix orenii α-amylase、Bacillus subtilis isomaltase；另一類是具有異構化 (isomerization)活性的蔗糖異構酶(sucrose isomerase，SI)，如:
Pseudomonas mesoacidophila MX-45 trehalulose synthase(PDB entry :1ZJA)或 Protaminobacter rubrum isomaltulose synthase(PDB entry :3GBD)(表三)。其中與 TtTS 相似最高的蛋白 MsTS，因胺基酸 Leu344 佔據，阻擋了受質結合位，相似度次之的 MtTS 也因為其結 構缺少 S7 區域而使活性位呈現開放狀態，因此我們選擇相似度也極 高而活性位置呈現完整封閉的 DrTS 作為 TtTS 結構模擬模板，方便 進行酵素與受質作用關係的探討(附錄六)。利用 Swiss-Model 進行 TtTS 蛋白質三級結構模擬，以 DrTS 為模板，模擬片段為 3 到 534 個胺基酸，胺基酸序列之間的一致性為 57%。模擬的 TtTS 結構中央 由(β/α)8的桶狀結構所組成，胺基酸包含 3-102、175-303、351-372
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與 440-451(紅色)，末端 C 區域由反向平行的 β 摺疊所組成，胺基酸 包含 452-534(淡藍色)，DrTS 參與受質進出開關的 S7 區域以及 B 區 域，對應 TtTS 為 304-350(S7 區域，綠色)、103-174(B 區域，深藍色)，
還有富含環狀但無明顯二級結構的 S8 區域，胺基酸包含 373-439(黃 色)(圖七)。
五、模擬 TtTS 與麥芽糖的複合物立體結構
利用 AutoDock Vina 軟體將麥芽糖嵌合入 TtTS 蛋白質分子三級 結構，嵌合範圍選定催化性胺基酸 ASP199，ASP308，GLU242 位置，
進行能量最適化運算，挑選結合能最低的結構(圖八)。結果顯示，麥 芽糖所結合的位置與 DrTS 活性中心模擬的麥芽糖結合位置相似，其 中非還原性端葡萄糖在-1 subsite 結構相同，而+1subsite 有些微不同 (圖九)，選定 TtTS 與麥芽糖距離 5Å 之內共有 18 個胺基酸(圖十)，
依據空間位置分類，在-1subsite 胺基酸分別為 Asp60、Tyr63、His103、
Gln167、Arg197、Asp199、Glu242、His307、Ap308、Arg387，而 +1subsite 胺基酸為 Ile140、Phe141、Phe163、Ala200、Tyr203、Asn244、
Glu309、Glu313，利用 Pymol 軟體分析麥芽糖分子與胺基酸作用力 整理(表四)，其中+1subsite 和麥芽糖無明顯作用力的胺基酸有 6 個分 別為 Ile140、Phe141、Phe163、Ala200、Tyr203，Asn244。比對與 TtTS 三級模擬結構相似的 GH13 family 蛋白(表五)，分析位於+1 subsite 與麥芽糖無明顯作用力的 6 個胺基酸，發現 Ile140、Phe141、
Phe163、Asn244 於水解酵素中有相同的胺基酸，推測可能因此參與 水解作用，能透過突變進行改造；而 Ala200、Tyr203 屬於 TS unique 的胺基酸，對 TS 異構化作用可能扮演重要的腳色，因此不納入突變
- 31 - Serine，分別為 : Phe141Tyr(TTC→TAC)、Phr141Ser(TTC→TCC)、
Phe163Tyr(TTC→TAC)、Phe163Ser(TTC→TCC)。依據方法十.3.進行 為 9.6%，逆反應水解為 4.6%，蔗糖水解為 2.1% (圖十四)，Phe141Ser 突變株正反應水解為 6.2%，逆反應水解為 2.5%，蔗糖水解為 1.4% (圖 十五)；而 Phe163Tyr 突變株仍保有異構化能力，但正反應、逆反應 以及蔗糖異構化效率降為野生型 TtTS 的 1/3，分別為 21.3%、13.2%
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變，分別為 : Phe141X(TTC→NNK)、Phe163X(TTC→NNK)、
Ile140(ATC→NNK)、Asn244(AAC→NNK)，依據方法十.3.進行定位
- 33 - 此胺基酸仍維持為 Proline(CCC→CCT)而非 Leucine(CTT)，突變率依 據判讀核苷酸數量中所含突變之比例，平均 5 端與 3 端定序突變率， 合為 I140、F140L、F163V、N244，其餘皆為 WT；失去活性之突變
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株則突變成不同胺基酸(表八)。
6. 定序之突變株轉化蔗糖產率分析
確認序列之突變株依方法五.1.反應蔗糖之海藻酮糖最大轉化率 與反應麥芽糖所得產物組成結果合併(表九)，可發現能異構化麥芽糖 之突變株，能力與異構化蔗糖相當，而完全無法異構化或水解麥芽 糖之突變株，對於蔗糖同樣沒有反應。如多點飽和突變株 I140、
F140L、F163V、N244，海藻糖最大轉化率為 50.4%，海藻酮糖最大 轉化率 58.2%，與 WT 相當，而突變株 I140A 對麥芽糖與蔗糖皆無 反應，這樣的結果顯示 TtTS 具有相同活性中心，是透過類似的催化 方式異構化麥芽糖與蔗糖；其中，N244V 突變株異構化蔗糖生成產 物偏向異麥芽酮糖，從 WT 海藻酮糖與異麥芽酮糖組成比為 30 : 1 變為 1: 1.5，顯示 N244 位點可決定產物專一性(product specificity)。
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- 36 - 得最後製得麥芽糖晶體以 β-構型居多(Xiaoling, 1998)。雖然當麥芽糖
晶體溶於水中會發生自發性變旋作用產生 α-麥芽糖，但最終平衡時 結果來看(圖四、B)，只有一小時內 TtTS 反應速率有因為 α-amylase 處理較久而提升，再長時間的海藻糖產量不論任何處理組皆相近，
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三、GI-coupled TtTS 反應分析
加入 GI 至 TtTS 反應麥芽糖溶液中，可將水解副產物葡萄糖異構
- 38 - 實驗只使用單一引子進行 QuickChange 突變，即便後續有以 DpnI 處 理，但含有半甲基化(hemimethylated)之親代股 DNA 抵抗 DpnI 作用 能力較高，不易清除，且後續含有缺口(nick)之新合成 DNA 又較完 整親代股 DNA 難轉型至 E.coli，使得最後突變庫中包含高比例之親 代股基因(Vovis and Lacks, 1977)。這樣的現象可透過互補引子對的 設計，排除傳統 QuickChange 操作時無法以新合成股作為模板進行 放大的缺點，以提高基因合成效率、減少親代股基因相對數量(Liu and Naismith, 2008)。
而本實驗使用 NNK 進行多點飽和突變，所需篩選突變庫數量可 減少為 NNN 之一半(Patrick et al., 2003)，但為了避免前述所產生之現 象，需要進行更多的篩選(over sampling)，勢必會造成實驗負擔，且 NNK 仍有胺基酸冗贅現象(codon redundancy)，如 Arginine、Leucine 包含了三種密碼子組成，會因此增加特定胺基酸出現頻率。若使用 NDT/VHG/TGG (D,G = no C、V = no T、H = no G) 搭配，只需要 22
- 39 - 株異構化能力不到 WT 的一半(圖二十五)。根據 Arnold and Georgiou 的統計分析結果，失活突變株約占突變庫之 40%~50%為最適合操作 定向演化的突變率，其基因(平均為含一千個鹼基)約含有 1 至 2 個胺 基酸突變(Arnold and Georgiou, 2003)。越高突變率則可能因為引入終 止密碼子或不利於結構摺疊之胺基酸而提高失活突變株的比例(Guo 證 96 孔突變株之反應結果，可發現利用 Maltase-coupled TS assay 作 為篩選改善異構化能力之突變株方式，分析所得突變株轉化率須高
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20 倍體積培養後，分離 TtTS 蛋白再反應結果與高通量反應結果一 致，顯示此高通量系統大致上能反映酵素異構化程度，但顧及 Maltase-coupled TS assay 會有誤差存在，因此後續進行 I140X、N244X 以及多點飽和與隨機突變所得可能突變株，直接取反應結果(尚未進
20 倍體積培養後，分離 TtTS 蛋白再反應結果與高通量反應結果一 致，顯示此高通量系統大致上能反映酵素異構化程度，但顧及 Maltase-coupled TS assay 會有誤差存在，因此後續進行 I140X、N244X 以及多點飽和與隨機突變所得可能突變株，直接取反應結果(尚未進