第一章、 緒論
第二節、 研究動機與目的
腫瘤細胞可能藉由不同方式來逃避宿主免疫反應，由本實驗室先前的研究結 果發現，口腔鱗狀細胞癌病患之腫瘤組織內浸潤CD3+CD4+之淋巴細胞中，
CD4+CD25+T 細 胞 佔 所 有 CD4+T 細 胞 比 例 有 22.81% ， 而 病 患 的 周 邊 血 液 CD4+CD25+T細胞只有7.8%，因此存在於腫瘤組織內的CD4+CD25+T細胞，相對 於該病患的周邊血液CD4+CD25+T細胞比例高許多。存在於口腔鱗狀細胞癌組織 內的CD4+CD25+Foxp3+之調節性T細胞，大約有16.19％，而在病患的周邊血液 中 ， 偵 測 到 比 例 大 約3.67% 的 CD4+CD25+Foxp3+ 之 調 節 性 T 細 胞 ， 高 量 的 CD4+CD25+ Foxp3+之調節性Ｔ細胞存在口腔癌腫瘤組織內，且進一步研究發現 CD4+CD25high的調節性Ｔ細胞具有抑制T細胞活化增生的能力。
過去有研究指出，人類口腔癌細胞株和人類口腔鱗狀癌組織有B7-H1的大量 表現(Tsushima et al,2006)，因此本論文中想要探討B7-H1分子在口腔鱗狀細胞癌 腫瘤組織之浸潤淋巴球的分布和表現，而浸潤在腫瘤組織中的調節性T細胞其免 疫抑制功能，是不是有可能和B7-H1的表現有相關性。若能釐清口腔鱗狀細胞癌 腫瘤組織中B7-H1和調節性T細胞免疫抑制的相關機制，未來可能將相關的調控分 子，作為治療時的標的，進而達到作為病患治療預後的目標，對於建立人類口腔 癌免疫療法，將有助於提供重要且必要性之訊息。
第二章、實驗方法及材料
第一節、檢體的收集及來源
本研究將以十七例口腔癌病人之腫瘤組織和周邊血液為研究材料，並蒐集健 康正常人之口腔組織和周邊血液作為對照比較，其中有十五名為男性，女性只有 兩名，病患的年齡從二十九歲至七十三歲。口腔鱗狀細胞癌的病患，在癌症分期 手術後，其口腔鱗狀上皮細胞癌組織收集成實驗組。每個病例的癌症分期(surgical stage)，癌症病理分級(histological stage)，淋巴或血管侵犯都會被紀錄，其中口腔 癌一般較容易轉移的部位除了頸部淋巴結外還包括肺臟、肝臟及骨骼。根據1997 年美國癌症醫學會(AJCC)的口腔癌分期的定義為標準：
零期：即原位癌。腫瘤細胞局限在口腔黏膜上皮內
第一期：腫瘤的最長徑小於或等於2公分且無頸部淋巴結及遠端轉移
第二期：腫瘤的最長徑大於2公分但不超過4公分，且無頸部淋巴結及遠端轉移 第三期：腫瘤的最長徑大於4公分或已轉移到同側頸部一個淋巴結，
此淋巴結之最長徑不超過3公分
第四期：有以下任何一種情形包括： 1.腫瘤侵犯鄰近的組織(如：穿過骨外層，
深入深層肌肉、上頷竇、皮膚等); 2.頸部淋巴結轉移的數目超過1個(不 論是在原發病灶的同側、對側或兩側都有)，或是淋巴結的最大徑已超過 3公分; 3.無論腫瘤大小及淋巴結是否轉移，已發生遠處轉移者。
在開刀前，必須有完整且詳細的記錄記載病人過去病史，並且符合下列基本的要 求，才會納入本實驗之收集樣本中；第一為所有病患在接受手術前，皆有病理切 片的術前口腔臨狀上皮細胞癌之證明；第二為病患沒有明顯且嚴重局部發炎現 象；第三為術前沒有接受特殊非手術性的治療。納入本實驗的病患都必須接受檢 查，且沒有其他伴隨的併發症或疾病，且皆不患有人類後天免疫不全疾病的證 明，同時願意參與本實驗且簽署同意書。手術進行後，手術標本都會接受病理科 醫師的診斷，來排除其他有可能共存的惡性腫瘤。
第二節 、人類口腔鱗狀上皮細胞癌組織內淋巴球的分離與純化
人類口腔癌組織內淋巴球的分離方法，是根據1997年Bor-Ching Sheu等人，
所發表的方法加以改良(Sheu et al., 1997)。台大醫院接受手術治療的病人中，以無 菌方法收集口腔鱗狀細胞癌組織，並利用phosphate-buffered saline (PBS)將其上血 塊 沖 洗 乾 淨 ， 之 後 用 刀 片 切 成 碎 片 ， 加 入RPMI-1640 medium (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)研磨後，再以380 μm及45.7 μm篩孔之濾網分 別過濾，濾液以1200 rpm (RS-720, KUBOTA)離心10分鐘，再以1300 rpm (RS-720, KUBOTA)離心10分鐘，以不同濃度的Percoll solution分層(含20 %, 55 %, 100 %)，
單核細胞球(mononuclear cell)會位於55 %及100 %的Percoll solution之間，而癌細 胞會位於20 %及55 %的Percoll solution之間，以此方法將口腔癌細胞和腫瘤內浸 潤淋巴球分離。將分離出來的腫瘤內浸潤單核細胞球，以anti-CD3、anti-CD4單 株抗體做螢光染色，並進行流式細胞儀(BD FACS Calibur)分析，藉由細胞的大小
（與FSC成正比），顆粒性（與SSC成正比）與CD3、CD4的標定來確定不同亞群 T淋巴球的分布。
第三節、人類周邊血液單核球的分離與純化
從醫院接受手術治療的病人中收集血液標本，於手術進行前抽取20cc 靜脈 血，置於含有肝素(heparin)的採血管中，先以 3000 rpm 離心 20 分鐘(RS-720, KUBOTA)，吸取上層的血漿後，加入等量的 Hank's Buffered Salt Solution
(HBSS)，再用 Ficoll hypaque (1.077 density，Pharmacia Biotech Co.)分離出周邊血 液中的單核細胞球(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，分離出的單核細 胞球懸浮於RPMI-1640 medium (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)，使其濃度為 1×106 cells/ml。將分離出來的腫瘤內浸潤單核細胞球，以 anti-CD3、anti-CD4 單株抗體做螢光染色，並進行流式細胞儀(BD FACS Calibur)
分析，藉由細胞的大小（與FSC 成正比），顆粒性（與SSC 成正比）與 CD3、CD4 的標定來確定不同亞群T 淋巴球的分布。
第四節 細胞表面染色
將分離出的周邊血液和腫瘤組織內浸潤淋巴球，分別以螢光標定如下：
anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE、anti- CD3-PerCP，以及標定 biotin-B7-H1(MIH1)、
biotin-B7-PD-1(MIH4)並以老鼠之 strepavidin-APC 當做第二級抗體(eBioscience, San Diego, Calif.)， IgG1κ isotype control-APC(eBioscience, San Diego, Calif.)做為 對照，並以CellQuest software (Beckton-Dickinson Inc.)進行資料分析。
第五節 細胞內染色
為了偵測調節性T 細胞的轉錄因子 Foxp3，將分離出來的周邊血液單核細 胞，先分別加入anti-CD4-PerCP、anti-CD25-PE，以及標定 biotin-B7-H1(MIH1)、
biotin-B7-PD-1(MIH4)並以老鼠之 strepavidin-APC 當做第二級抗體(eBioscience, San Diego, Calif.)， IgG1κ isotype control-APC(eBioscience, San Diego, Calif.)做為 對照，混合均勻後，於4°C 避光作用30 分鐘，利用 Cytofix/Cytoperm buffer (eBioscience, San Diego, Calif.)在冰上作用一小時，再利用一倍的 permeabilization buffer (eBioscience, San Diego, Calif.)連續三次沖洗細胞，使細胞固定及破壞細胞 膜讓通透性增加，在染胞內分子前，先使用2%胎牛血清(fetal calf serum)結合非特 異性抗原，再藉由anti-Foxp3單株抗體(eBioscience, San Diego, Calif.)偵測調節性 T 細胞，以流式细胞儀進行分析。以FSC、SSC、CD4定義出 CD4+淋巴球细胞，觀 察不同T 細胞亞群表現 B7-H1和 PD-1的百分比和表現強度。
第六節 腫瘤組織和正常組織之 RNA 萃取
將約 0.5mm3大小之腫瘤組織或口腔內非腫瘤組織磨碎後，加入Solution D (4 M Guanidinium iso-thiocyanate、25 mM Sodium citrate pH 7.0、0.5% Sarcosyl、0.1 M b-Mercaptoethanol)，搖晃均勻後加入 2 M Sodium Acetate pH 4.0、Acid phenol (Water saturated)、Chloroform:isoamyl (49:1)，搖晃均勻後冰上作用 20 分鐘，9000 rpm 4 度 C 20 分鐘，取上清液加入 1 倍體積 Ispropanol-20 度 C 沉澱一小時，9000 rpm 4 度 C 20 分鐘，Pellet 加 Solution D 0.5 ml，並加入 0.5 ml Ispropanol-20 度 C。
經由光譜分析儀(Ultrospec 3300 pro, Amersham Bioscience )定量 total RNA 後取 2 μg RNA 以 RQ1 DNase (Promega)於 65℃中作用 30 分鐘，進行 DNA 清除，進一 步利用M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)以及 oligo(dT)於 37℃中作用 1 小 時以進行反轉錄的動作。
第七節 即時定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)
本實驗中所使用之 primers 是由 Primer express v3.0所設計，包括 B7-H1、
PD-1、IL-10、IFN-γ、Foxp3、CD4、B7-H4、B7-DC。cDNA 利用 POWER SYBR GREEN PCR Master Mix(Applied Biosystem)於 Applied Biosystem 7500 system 中 進行同步定量聚合酶連鎖反應。結果之不同基因Ct 值將以 GAPDH Ct 值作為基 準，使用公式如下：Relative expression = (2-dCt)。
第八節 口腔癌組織及正常組織的組織包埋和冷凍切片
口腔鱗狀上皮細胞癌腫瘤組織和正常組織經收集後，以Optimal Cutting
Temperature(O.C.T.) Tissue-Tek (Sakura, Tokyo, Japan)包埋組織，並存放於-80 度 C 之環境中，待組織冷凍後將組織切成厚度5μm 之組織切片，並將組織切片存放於 -80 度 C。
第九節 組織免疫染色(Immunohistochemistry)
組織冷凍切片和丙酮(acetone)反應 10 分鐘固定組織，用二次水(ddH2O)、
1XPBS wash 後，以 3% 過氧化氫(hydrogen peroxide)和組織切片反應 20 分鐘去除 內生性過氧化酵素活性(peroxidase activity)，1X PBS wash 完後用疏水性(hydrphbic pen)筆劃出組織範圍，再以 10% goat serum blocking(Zymed Laboratories,histostain bulk kit) 20 分鐘，避免非特異性抗體和組織的結合，接著加入 1:50 的 mouse anti-human 抗體 anti-MIH1(B7-H1)、anti-MIH4(PD-1)、1:100 anti-Foxp3(eBioscience, San Diego, Calif.)，在 4 度 C 反應 overnight，1X PBS wash 後加入 anti-mouse biotinylated secondary Ab(Zymed Laboratories,histostain bulk kit)室溫作用 20 分 鐘，1X PBS wash 後再加入 strepavidin-peroxidase conjugate(Zymed Laboratories ,histostain bulk kit)室溫作用 20 分鐘，1X PBS wash 後加入 DAB(Dako)呈色，並以 Mayer’s hematoxylin 做複染劑 5 分鐘，running water 之後經 50-75-85-95%酒精 10 次、100%酒精將組織脫水，最後將組織切片浸入 xylene 並以膠封片，最後在顯 微鏡下觀察。雙分子染色則是以1:100 mouse anti-human-Foxp-3 染色 24 小時之 後，以DAB(Dako)呈色，再以 1:50 的 mouse anti-human 抗體 anti-MIH1
(B7-H1)，最後用 AEC(BiogeneX)呈色，再進行複染。
第十節、反應性T細胞及調節性T細胞篩選方法及細胞增生和抑制試驗
20 c.c.靜脈血，置於含有肝素(heparin)的採血管中，首先分離周邊血液的單核 球，進行anti-CD3-PerCP、anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE 染色，利用流式細胞分 選儀(BD FACSAria Cell Sorter)分選出 CD3+CD4+CD25-細胞，即為反應細胞 (responder cells)，CD3-細胞即為 B 細胞和單核球細胞，作為抗原呈現細胞(APC)，
CD4+CD25high 細胞作為抑制細胞，將分選出的反應細胞(CD3+CD4+CD25-)標定 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)，放置 1x105細胞於96-well plate，再加入 RPMI-1640 medium (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY,
USA)，以 plate-bound anti-CD3 (加入 100 μl 的 2.5 μg/ml anti-CD3 於 96 well 盤中，
於37℃作用 2 個小時後，以 PBS 清洗兩次後，即可加入細胞作用)和抗原呈現細 胞(APC)等刺激細胞增生，CD25high 細胞和 B7-H1 Ab preincubate 以及不和 B7-H1 Ab preincubate 兩組細胞，分別和有 CFSE 標定的反應 T 細胞以 1:1 或是 1:2 歷經 84-120 小時後，再利用流式細胞儀分析增生結果，藉此評估調節性 T 細胞，抑制 同源的CD4+CD25-T 細胞增生的能力和 B7-H1 分子是否相關。
第十一節、周邊血液單核球與口腔鱗狀癌細胞株在體外共同培養方法
20 c.c.靜脈血，置於含有肝素(heparin)的採血管中，放置1×106細胞於12-well plate，再放入照放線或不照放射線兩組2×105的口腔鱗狀癌細胞株SAS，一起培養 五天，培養後的細胞加入biotin-B7-H1(MIH1)，且以老鼠之strepavidin-APC當做第 二級抗體(eBioscience, San Diego, Calif.)， IgG1κ isotype control-APC(eBioscience, San Diego, Calif.) 做 為 對 照 ， 並 分 別 加 入 anti-CD4 、 anti-CD25 及 單 株 抗 體 (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, Becton-Dickinson, San Jose, CA)和染 細胞內Foxp3染色(eBioscience,San Diego, Calif.)，以流式细胞儀進行分析，利用 CellQueast software (BD Biosciences)整理分析實驗結果，觀察表現CD4+CD25+ T 細胞以及CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞表現B7-H1所佔的百分比和平均表現強 度。
第三章、結果
第一節、口腔鱗狀細胞癌病患分離出之腫瘤內浸潤CD4+CD25+淋巴 球，其B7-H1共同抑制分子的細胞表現百分比和表現強度