第二章、 實驗分法與材料
第九節、 組織免疫染色
組織冷凍切片和丙酮(acetone)反應 10 分鐘固定組織，用二次水(ddH2O)、
1XPBS wash 後，以 3% 過氧化氫(hydrogen peroxide)和組織切片反應 20 分鐘去除 內生性過氧化酵素活性(peroxidase activity)，1X PBS wash 完後用疏水性(hydrphbic pen)筆劃出組織範圍，再以 10% goat serum blocking(Zymed Laboratories,histostain bulk kit) 20 分鐘，避免非特異性抗體和組織的結合，接著加入 1:50 的 mouse anti-human 抗體 anti-MIH1(B7-H1)、anti-MIH4(PD-1)、1:100 anti-Foxp3(eBioscience, San Diego, Calif.)，在 4 度 C 反應 overnight，1X PBS wash 後加入 anti-mouse biotinylated secondary Ab(Zymed Laboratories,histostain bulk kit)室溫作用 20 分 鐘，1X PBS wash 後再加入 strepavidin-peroxidase conjugate(Zymed Laboratories ,histostain bulk kit)室溫作用 20 分鐘，1X PBS wash 後加入 DAB(Dako)呈色，並以 Mayer’s hematoxylin 做複染劑 5 分鐘，running water 之後經 50-75-85-95%酒精 10 次、100%酒精將組織脫水，最後將組織切片浸入 xylene 並以膠封片，最後在顯 微鏡下觀察。雙分子染色則是以1:100 mouse anti-human-Foxp-3 染色 24 小時之 後，以DAB(Dako)呈色，再以 1:50 的 mouse anti-human 抗體 anti-MIH1
(B7-H1)，最後用 AEC(BiogeneX)呈色，再進行複染。
第十節、反應性T細胞及調節性T細胞篩選方法及細胞增生和抑制試驗
20 c.c.靜脈血，置於含有肝素(heparin)的採血管中，首先分離周邊血液的單核 球，進行anti-CD3-PerCP、anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE 染色，利用流式細胞分 選儀(BD FACSAria Cell Sorter)分選出 CD3+CD4+CD25-細胞，即為反應細胞 (responder cells)，CD3-細胞即為 B 細胞和單核球細胞，作為抗原呈現細胞(APC)，
CD4+CD25high 細胞作為抑制細胞，將分選出的反應細胞(CD3+CD4+CD25-)標定 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)，放置 1x105細胞於96-well plate，再加入 RPMI-1640 medium (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY,
USA)，以 plate-bound anti-CD3 (加入 100 μl 的 2.5 μg/ml anti-CD3 於 96 well 盤中，
於37℃作用 2 個小時後，以 PBS 清洗兩次後，即可加入細胞作用)和抗原呈現細 胞(APC)等刺激細胞增生，CD25high 細胞和 B7-H1 Ab preincubate 以及不和 B7-H1 Ab preincubate 兩組細胞，分別和有 CFSE 標定的反應 T 細胞以 1:1 或是 1:2 歷經 84-120 小時後，再利用流式細胞儀分析增生結果，藉此評估調節性 T 細胞，抑制 同源的CD4+CD25-T 細胞增生的能力和 B7-H1 分子是否相關。
第十一節、周邊血液單核球與口腔鱗狀癌細胞株在體外共同培養方法
20 c.c.靜脈血，置於含有肝素(heparin)的採血管中，放置1×106細胞於12-well plate，再放入照放線或不照放射線兩組2×105的口腔鱗狀癌細胞株SAS，一起培養 五天，培養後的細胞加入biotin-B7-H1(MIH1)，且以老鼠之strepavidin-APC當做第 二級抗體(eBioscience, San Diego, Calif.)， IgG1κ isotype control-APC(eBioscience, San Diego, Calif.) 做 為 對 照 ， 並 分 別 加 入 anti-CD4 、 anti-CD25 及 單 株 抗 體 (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, Becton-Dickinson, San Jose, CA)和染 細胞內Foxp3染色(eBioscience,San Diego, Calif.)，以流式细胞儀進行分析，利用 CellQueast software (BD Biosciences)整理分析實驗結果，觀察表現CD4+CD25+ T 細胞以及CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞表現B7-H1所佔的百分比和平均表現強 度。
第三章、結果
第一節、口腔鱗狀細胞癌病患分離出之腫瘤內浸潤CD4+CD25+淋巴 球，其B7-H1共同抑制分子的細胞表現百分比和表現強度
為了探討浸潤於口腔鱗狀上皮細胞癌中之淋巴細胞的特性，採用機械式磨碎
分離方法，將口腔癌組織中的腫瘤浸潤淋巴球(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL) 分離出來，以PBMC當做對照組再藉由螢光免疫染色及流式細胞儀分析，圖一A 以其中一個病例顯示分析的方式，先以細胞的大小（與FSC成正比），顆粒性（與 SSC成正比）圈選出淋巴細胞(為R1)，再與CD3+和CD4+的標定來確定T淋巴球的 分布，分析CD4+CD25+T細胞表現共同抑制分子B7-H1之比例。圖一B顯示兩個不 同病患，其CD4+CD25+細胞表現較高比例和較低比例的B7-H1分子，其中腫瘤浸 潤的B7-H1+CD4+CD25+T細胞，佔所有CD4+CD25+T細胞的比例(百分比%)和表 現量(平均螢光值MFI)都比周邊血液稍高。但是經過圖二的統計，腫瘤浸潤 B7-H1+CD4+CD25+T 細 胞 佔 所 有 CD4+CD25+T 細 胞 比 例 78.25%(MFI=64.08) (n=17)，而病患的周邊血液只有64.76%( MFI=47.14) (n=17) (百分比例% p=0.09 , 平均螢光值MFI p=0.05)，雖然在平均比例和平均表現量上腫瘤和周邊血液仍有 些微的不同，但是並沒有達到統計上的顯著差異(p<0.05)。
第二節、口腔鱗狀細胞癌病患分離出之腫瘤內浸潤
CD4+T 細胞，
B7-H1 和 Foxp3、CD25 之表現有相關性
利用流式細胞儀分析，將腫瘤浸潤並同時表現 CD4 及 CD25 的 T 細胞群，
根據細胞 CD25 的螢光強度，將細胞分為三群，CD25 表現螢光強度較高的細胞
群定義為 CD4+CD25high 細胞，將 CD25 表現螢光強度較低的細胞群定義為 CD4+CD25low 細胞，而另一群表現 CD25 螢光強度介於上述兩者中間，我們定 義為 CD4+CD25intermediate 細胞，上述細胞亞群分群以圖三 A 左圖表示。再將 分出的三群細胞，統計各亞群細胞表現B7-H1 之比例，結果以圖三 A 右圖顯示，
在 口 腔 癌 腫 瘤 組 織 內 ，CD4+CD25high 細 胞 亞 群 有 85.62% 表 現 B7-H1 ， CD4+CD25intermediate 有 77.91%而 CD4+CD25low 有 73.05%(n=17)，顯示 B7-H1 在三細胞亞群的平均表現比例和 CD25 的表現量(螢光值)有些微的相關性，但是 並沒有達到統計上的顯著差異(CD4+CD25high 和 CD4+CD25low p=0.07)。
過去有研究指出 CD25highFoxp3+調節性 T 細胞(Strauss et al., 2007b)具有抑 制T 細胞活化增生的功能，並且 CD25 和 Foxp3 具有正相關，為了分析 CD25、
Foxp3 和 B7-H1 的相關性，利用細胞內 Foxp3 以及細胞外 CD25、B7-H1 的免疫 螢光染色和流式細胞儀，圖三 B 將腫瘤浸潤 CD4+細胞分為 CD4+CD25high 和 CD4+CD25-兩群，發現 CD4+CD25high 表現較高量的 Foxp3 和 B7-H1，而 CD4+CD25-則是不表現 Foxp3 以及表現較低量的和 B7-H1。
第三節、口腔鱗狀細胞癌病患分離出之腫瘤內浸潤
CD4+Foxp3+調節 性 T 細胞表現較高比例且較高量的 B7-H1，且 B7-H1+
Foxp3+細胞和 Foxp3+細胞有相關性
由於研究觀察到 B7-H1 和 Foxp3 表現的相關性，更進一步想研究腫瘤組織和 周邊血液Foxp3+調節性 T 細胞表現 B7-H1 的比例和表現量，以細胞內外染色和 流式細胞儀偵測Foxp3 細胞表現 B7-H1 百分比和表現強度，並以健康成人周邊血 液當做對照，圖四A 可以看到選取 CD4+Foxp3+細胞的方式，圖四 B 為其中一個
病人的B7-H1 表現百分比和表現強度。圖五為經過統計結果顯示，在腫瘤組織浸 潤CD4+Foxp3+調節性 T 細胞所表現 B7-H1 的細胞比例 85.47% ，比病人 PBMC 63.20%(*p=0.005)和正常人 PBMC68.15%(**p=0.004)都來的高(n=12)，而腫瘤組織 浸潤 CD4+Foxp3+調節性 T 細胞之 B7-H1 表現量(MFI=58.21)比正常人 PBMC 27.306(**p=0.001)和病人 PBMC 34.29 (*p=0.006)都高(n=13) 。
研究指出 B7-H1+CD4+Foxp3+調節性 T 細胞在腫瘤組織所佔的百分相對於周 邊比較高，因此認為B7-H1+CD4+Foxp3+調節性 T 細胞也許對於腫瘤生長或逃避 宿主免疫攻擊是非常重要的，利用流式細胞儀分析B7-H1+Foxp3+細胞和 Foxp3+
細胞在TIL 和 CD4+ T 細胞內所佔的百分比，圖六 A 我們可以統計出結果並發現 B7-H1+Foxp3+和 Foxp3+細胞之百分比在 TIL 呈現中度正相關(R=0.61)，而圖六 B 在CD4+T 細胞內則是呈現高度正相關(R=0.75)。
第四節、口腔鱗狀細胞癌病患分離出之腫瘤內浸潤
CD4+CD25+
Foxp3+調節性 T 細胞表現較高比例且較高量的 B7-H1
為了釐清 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細胞在腫瘤組織所扮演的角色，利用 細胞內和外螢光免疫螢光染色，分析 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細胞、
CD4+CD25+Foxp3-活化 T 細胞、CD4+CD25-Foxp3-未活化 T 細胞，三細胞群 B7-H1 的表現百分比和表現量，並以病人和正常周邊血液作為對照，圖七 A 為細 胞選取的方式，圖七 B 為其中一個病人之三群細胞 B7-H1 的表現百分比和表現
量，圖八為經過統計後三群細胞的表現百分比和表現量，圖八 A 腫瘤組織內
CD4+CD25+Foxp3+ 調 節 性 T 細 胞 有 88.08% 表 現 B7-H1 ， 比 起 病 人 PBMC(64.71%)(**p= 0.001) 和 正 常 人 PBMC(73.78%)(*p=0.04) 都 高 許 多 ， 在 CD4+CD25+Foxp3-活化 T 細胞、CD4+CD25-Foxp3-未活化 T 細胞則是沒有看到
顯著差異性。圖八B 腫瘤組織內 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細胞有表現 B7-H1 之MFI=58.24，比起病人 PBMC(35.7)(*p= 0.02)和正常人 PBMC(28.28)(**p=0.002) 都高許多，而CD4+CD25+Foxp3-活化 T 細胞、CD4+CD25-Foxp3-未活化 T 細胞 的B7-H1 表現量也都有類似的情形。
第五節、口腔鱗狀細胞癌腫瘤組織
CD4+CD25+Foxp3-和
CD4+CD25-Foxp3- T 細胞表現較高量的 PD-1，且 CD25+
Foxp3+B7-H1+ T 細胞和 Foxp3-PD-1+ T 細胞有相關性
為了可以更進一步證實 B7-H1+CD4+Foxp3+調節性 T 細胞在腫瘤組織內的重 要性，利用細胞內和外螢光免疫螢光染色，分析CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細 胞、未活化T 細胞，三細胞群 PD-1 的表現量，並以病人和正常周邊血液作為對 照，圖九A 為其中一個病人之三群細胞 PD-1 的表現百分比和表現量，圖九 B 為 經過統計後三群細胞的表現百分比和表現量，腫瘤組織內 CD4+CD25+Foxp3-的 PD-1 平均表現量 MFI=629.25 ，而 CD4+CD25-Foxp3-平均表現量 MFI= 534.37，
兩群細胞比 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細胞 MFI=250.19 高出許多(*p=0.02)，
其中 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細胞、CD4+CD25+Foxp3-活化 T 細胞、
CD4+CD25-Foxp3-未活化 T 細胞在腫瘤組織的 PD-1 表現量比病人和正常人 PBMC 都高許多，腫瘤組織內 CD4+CD25+Foxp3- 活化 T 細胞在 TIL 之 B7-H1 接受體PD-1 平均表現量大約是 PBMC 的六倍，CD4+CD25-Foxp3- T 細胞在 TIL 之PD-1 平均表現量大約是 PBMC 的五倍，然而 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 在 TIL 之 PD-1 平均表現量大約只有 PBMC 的二倍。
由於觀察到腫瘤組織調節性 T 細胞表現 B7-H1 和非調節性 T 細胞表現 PD-1 的相對關係，藉由螢光免疫染色和流式細胞儀分析後發現，圖十A B7-H1+Foxp3+
和PD-1 在 TIL(r=0.74)和 CD4+T 細胞(r=0.70)都具有高度正相關，圖十 B 並且發 現B7-H1+Foxp3+表現百分比和 Foxp3-細胞 PD-1 表現強度在腫瘤組織 CD4+T 細 胞(r=0.6)具有中度相關性。
此外我們利用口腔鱗狀細胞癌病人取下的腫瘤組織，進行組織免疫染色，圖 十一可以看到在口腔鱗狀細胞癌的腫瘤組織有B7-H1+CD4+Foxp3+調節性 T 細胞 的存在，並且也有表現B7-H1 的接受體 PD-1 的浸潤細胞。
第六節、口腔鱗狀細胞癌細胞株
SAS 誘導 CD4+CD25+表現 B7-H1
為了證實在口腔鱗狀細胞癌的腫瘤微環境會誘導CD4+CD25+ Foxp3+調節性 T 細胞表現 B7-H1，利用體外細胞共同培養的系統，放置 PBMC 1×106 細胞於 12-well plate，再放入不同細胞比例的口腔鱗狀細胞癌細胞株 SAS，或是照射過放 射線的SAS 細胞共同培養於 RPMI medium 中，一起培養五天，觀察 CD4+CD25+
T 細胞以及 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細胞表現 B7-H1 之比例有無增加。 圖 十二顯示流式細胞儀資料分析後的結果以及細胞選取的方式，圖十二可以看到當 PBMC 單獨培養時，CD4+CD25+表現 B7-H1 的比例大約是 20.7%，而加入 1/5 細 胞數的口腔鱗狀細胞癌細胞株SAS 共同培養時，CD4+CD25+表現 B7-H1 的比例 上升到 56.25%，若是加入 1/5 細胞數的放射線照射口腔鱗狀細胞癌細胞株 SAS 共同培養時，CD4+CD25+表現 B7-H1 的比例上升到 50.27%。
第七節、口腔鱗狀細胞癌病患分離出之腫瘤內浸潤
B7-H1+CD4+
CD25+ Foxp3+細胞表現較高比例且較高量的 ICOS
為 了 進 一 步 了 解 B7-H1+CD4+CD25+ Foxp3+ 的 細 胞 特 性 ， 我 們 想 B7-H1+CD4+CD25+ Foxp3+的表現型，有研究指出 ICOS+FOXP3+ Treg 可藉由表 現 IL-10 抑制樹突細胞的功能 (Ito et al., 2008)，圖十三是 B7-H1+和 ICOS 在 CD4+Foxp3+細胞群的表現關聯性和細胞選取的方式，可以發現 ICOS+FOXP3+
Treg 表現較高比例且較高量的 B7-H1，在 n=3 統計雖然百分比只有 10%的差異 性，而表現量有兩倍的差異性，由於個體數目和範圍的限制，並沒有達到統計上 的意義。
第八節、腫瘤組織表現較高量B7-H1、Foxp3、IL-10、IFN-γ、CD4、
PD-1、B7-DC和B7-H4之RNA，且Foxp3和B7-H1有相關性
為了更證實B7-H1和Foxp3表現的相關性，我們萃取出腫瘤組織中的RNA，以
為了更證實B7-H1和Foxp3表現的相關性，我們萃取出腫瘤組織中的RNA，以