本論文中600位口腔癌病人之血液檢體來自中國醫藥大學附設醫院耳鼻喉科
並取得病人同意，病例之確診由耳鼻喉科之醫師蔡銘修醫師、花俊宏醫師及曾憲 彰醫師三位醫師確認，其中包括446位男性與154位女性，平均年齡66.5歲（標準 差10.4），其中有吸煙習慣者有452位，嚼檳榔習慣者377位，飲酒習慣者有423 位。以腫瘤部位之不同又再細分，病變位於舌部的有296位、病變位於頰黏膜的 有170位、病變位於口腔底的有35位、病變位於臼齒後三角區的有26位、病變位 於齒槽脊的有17位、病變位於上顎的有13位、病變位於嘴唇的有13位而病變位於 其他部位則有30位。
對照組 (control)
本論文中 600 位對照組之血液檢體來自前往中國醫藥大學附設醫院進行健
康檢查之健康志願者，成為對照組之志願者，皆已由臨床醫師確認並無癌症或相 關疾病之病史，在取得志願者之同意之後，再依口腔癌病人之性別及年齡分布，
挑選與口腔癌病人接近之志願者進行採樣。其中包括432 位男性與 168 位女性，
平均年齡63.3 歲（標準差 8.6），其中有吸煙習慣者有 428 位，嚼檳榔習慣者 361 位，飲酒習慣者有402 位。將對照組志願者之各項特徵與病人組相比較，其年齡 之P 值為 0.73，性別之 P 值為 0.36，具有吸菸習慣者之 P 值為 0.12，具有嚼檳 榔習慣者之P 值為 0.34，具有飲酒習慣者之 P 值為 0.19。(表一)
檢體收集與問卷 (Questionnaire)
每位口腔癌患者採集 3-5 毫升(ml)之全血於含有乙二胺四醋酸(EDTA) 抗凝
劑之採血管中，並進行有組織性之問卷調查。問卷內容包括患者個人之基本資 料，例如年齡、聯絡方式、居住地等，以及個人病史與已知口腔癌危險因子，例 如抽煙、嚼檳榔及喝酒之習慣，以及家族成員是否帶有口腔癌或其他種類之癌症 等。
實驗藥品
一般無機鹽與有機溶劑均為分析級，除非特別標示，皆購自美商Merck公司
（New Jersey, USA）及Sigma chemical公司（Missouri, USA）。dATP、dCTP、
dGTP、dTTP、限制酶、聚合酶鏈鎖反應（Polymerase chain reaction, PCR）所使
用 之Taq DNA Polymerase 及 其 它 酵 素 皆 購 自 New England Biolabs 公 司
（Massachusetts, USA）及Hoffmann-La-Roche（SR product, U.K）。
DNA萃取 (DNA extraction)
抽取志願者血液檢體約3-5 ml左右，放入含有乙二胺四醋酸(EDTA) 抗凝劑 的管子，上下搖晃均勻，於1500 rpm 下離心15分鐘，之後會發現全血分成三層，
最上面一層是血清，中間一層是包含白血球的buffy coat，最底層則為紅血球。以 吸管吸取介於血漿和紅血球之間的buffy coat，置入含有3 ml RBC lysis buffer的管
中充分混合均勻，並靜置於碎冰上三十分鐘以充分讓紅血球溶解。將紅血球溶解 之後的細胞懸浮液於室溫下以500 rpm離心20分鐘，小心倒掉上層紅色的紅血球 溶解液，留下濃縮白血球部份。將0.8ml之GenoMaker reagent（真興公司）加入 濃縮白血球，用振盪器打散試管底部的白血球，並分裝至1.5 ml微量離心管，靜 置於室溫下5分鐘，將白血球溶解並釋放出DNA。之後加入chloroform至1.5 ml，
混合均勻，於冷凍離心機以12000 rpm 離心10分鐘，吸取上清液至乾淨的1.5 ml 微量離心管，加入和上清液等量的isopropanol（可沉澱DNA），上下輕輕搖晃使 上下兩層液體充分混合，待有白色絲狀物出現，即為DNA，接著以12000 rpm 離 心5分鐘。小心倒掉上清液，加入300 μl的酒精（75% alcohol）以進行鹽類的洗滌
及DNA之沉澱作用，待DNA沉澱之後，以12000rpm離心5分鐘分離DNA；重覆此 步驟二次。把上清液倒掉，離心5分鐘，用微量吸取器吸去水，使其自然乾燥，
附著於管壁上的物質即為DNA pellet。靜置等待DNA到呈透明狀後，視DNA的量
加入滅過菌的二次水（dd water）100 μl（或50 μl）稀釋，將此微量離心管置放
於37℃培養箱溶解30 分鐘，讓DNA均勻混合溶解，並以1％ agarose gel 加入2 μl
DNA 進行電泳確認，最後將DNA分裝後置於-20℃下保存。
單一核苷酸多型性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）位點之選擇
單一核苷酸多型性指的是DNA 序列上發生的單一核苷酸鹼基之間的變異，
在人群中，這種變異的發生頻率必須至少大於1％，否則被認定是點突變。人類 遺傳基因中的各種差異，有 90%都可歸因於 SNP 所引起的基因變異。在人類基 因組中，每隔100 至 300 個鹼基就會存在一處 SNP。每 3 個 SNP 中有兩個會是 胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）的相互轉變。
首先藉助於NCBI等資料庫，從已知的位點當中，精選出我們感興趣的SNP 位點，在本計劃中首先以位於Ku80基因上之位點為重心。我們首先必須尋找出
於台灣人族群中適合進行實驗之位點，因為相同的位點在不同之人種身上具有不 同之分布情形，有時差異相當巨大。例如，許多位點在西方人身上具有相當平均 之分布情形，但是在臺灣人身上卻完全不具有變異性，因此，在進行實驗之前，
先挑選出其分布率適合台灣人族群，且與本基因之功能相關之SNP位點以供實驗 進行，是相當重要的步驟。
單一核苷酸多型性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）位點之分型模式
進行 SNP 研究有許多種方法，其中一種最為人所知的就是 PCR-RFLP，由
於此方法之準確率高，操作過程簡易，不易發生難以判讀之結果，且實驗成本較 低廉，在現存的許多SNP 相關研究中，就有許多是以此 PCR-RFLP 方式所進行 的，證明此實驗方法雖然較為基礎，但是在正確性以及效率方面，其表現皆是令 人滿意的[40-42]。因此本計劃便是以這種方式進行研究，將此方法概述於下。
特異性引子的設計
首先針對我們所選擇的位點，選擇適當的特異性引子，用以增幅內含單一核
苷酸位點的 DNA 片段，在引子設計時，需注意 DNA 片段的長度須適中，應設 計在200 到 1000 bp 之間，以便於進行實驗。且引子設計好之後，須先進行 PCR，
以確定其反應溫度及實驗效果，並觀察其產物大小是否合乎預期。本實驗中針對 位於 ku80 基因上之三個單一核苷酸多型性位點，設計了以下三組，共六股之特 異性引子。
Ku80 G-1401T rs828907:
5’-TAGCTGACAACCTCACAGAT-3’
5’-ATTCAGAGGTGCTCATAGAG-3’
產物大小：252 bp
5’-TCTAACTCCAGAGCTCTGAC-3’
5’-AACTCTGAGCATGCGCAGAT-3’
產物大小：311 bp
Ku80 intron19 rs9288518:
5’-GGTGTGAAGACCTATCAATC-3’
5’-TTACAGAACAAGCCTTGCAC-3’
產物大小：275 bp
限制酵素的選擇
只有具辨識片段涵蓋單一核苷酸位點的限制酵素，才可以用來進行分型的試 驗。因此，當特異性引子設計完成後，下一步便是挑選適合的限制酵素，使PCR
產物經過酵素的作用後，在電泳時的產物能夠辨別不同的基因型，並確認不同基 因型之檢體，經限制酵素切割後之產物大小，方能進行實驗。本實驗中針對位於
ku80基因上之三個單一核苷酸多型性位點，設計了以下三支限制酵素，詳細資料
及產物切割後之大小如下。
Ku80 G-1401T rs828907 BfaⅠ
Ku80 C-319T rs11685387
SpeⅠ
cut from 311 bp C type into 108+203 bp T type
Ku80 intron19 rs9288518
BsrⅠ
cut from 275 bp A type into 110+165 bp G type
聚合酶鏈鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）
聚合酵素連鎖反應（Polymerase Chain Reaction）就是在利用 Taq polymerase
在體外對特定的基因作大量複製和製造，使原本量少的樣本可以因為 PCR 而量 變多，大量放大。
由耐高溫的古細菌（hyperthermophilic archaea）如 Thermus aquaticus 分離出
的Taq DNA polymerase，因為對熱穩定，故可以在高溫條件的 PCR 反應中作用，
而不須在每一個循環後再添加一次DNA polymerase。
利用雙股DNA重複地分開和複製，而達到增幅所需片段的目的，每一次的 循環步驟如下：
（1）Denaturation：將目標DNA加熱至約94℃，打斷鹼基對間的氫鍵，雙
股DNA分開。
（2）Priming：
X 加入含有primers、DNA polymerase和足夠dNTP的混合液到目標 DNA中，將溫度降至約55℃使primers能夠黏上單股DNA。
Y Primers 的 作 用 是 提 供 3’OH 端 讓 DNA polymerase 能 合 成 DNA
（DNA polymerase一定要有3’OH端才能合成DNA）
Z 55℃能讓單股DNA再形成雙股，但因為有過多的primers，使得當 溫度降到55℃時，DNA不是和原本的另一股配對形成雙股，而是和 primers配對。
（3）Extension：將溫度升到72℃，使DNA polymerase以DNA為模板，進 行聚合反應，合成DNA的速率會增加。
於本研究中，我們以事先已抽取好的 genomic DNA 2.5~10 pmole 體積為 5 μl
當做模板，並以PCR 反應放大 Ku80 G-1401T rs828907，Ku80 C-319T rs11685387 及 Ku80 intron19 rs9288518 位置之基因片段。在總反應體積為 25 μl 的反應溶液
中加入0.5 μl 的 10 mM dNTP、各 0.5 μl 的 5’端和 3’端的兩股引子、滅菌後的二 次水15.5 μl、0.5 μl 的 Taq polymerase、配合 Taq polymerase 之 10 倍緩衝液（10 mM Tris-HCL, pH 8.3, 50 mM KCl, 2.0 mM MgCl2）2.5 μl 進行聚合酶鏈鎖反應。
將上述溶液置於1.5 ml 的 PCR 專用試管充分混合均勻後，放入聚合酶鏈鎖
反應循環儀（Bio-Rad mycycler）於 94℃加熱 5 分鐘後便進入 PCR 反應。PCR
的反應條件為94℃、30 秒，55℃、30 秒，72℃、30 秒進 35 個循環後再於 72℃
下反應10 分鐘。反應後的產物再以膠體凝膠電泳加以確認並比較產物大小，以 確認該次實驗有確實增幅出我們所想要增幅的片段。
凝膠電泳法（Gel electrophoresis）
核酸電泳主要利用核酸帶負電荷的特性，於電場中會穿過膠體，如：agarose
或polyacrylamide 膠體，而朝向正極移動。因為不同分子量的核酸，在膠體孔徑 中移動的速度會有差異，藉此將不同大小的核酸分開。Agarose 膠體為較普遍用
為電泳的材料，主要因為其製備方便及簡單，常使用在200 bp~50 kb 核酸片段間 的分析，且通常以水平式電泳槽來進行電泳。
核酸電泳後，膠體中的核酸可經ethidium bromide（EtBr）染色，EtBr會嵌入 核酸鹼基中，以紫外線照射，則核酸吸收紫外線波長的光線，再經EtBr放出可見
波長的光線，藉以觀察核酸之位置。EtBr染色之濃度為0.5 μg/ml。除了在電泳後，
再將膠體浸染於EtBr溶液外，亦可在製備膠體時，直接將EtBr加入膠體內，使核 酸在電泳進行中被染色，以節省電泳後，需要染色的時間，但經EtBr嵌合的核酸，
其電泳速率會降低，如：直線型核酸，約降低15%的移動速率。在本實驗中，我 們是採用膠體電泳之後再加以染色的方式進行實驗。
我們將混合均勻的PCR反應產物4 μl和1 μl的loading dye混合均勻，在電泳槽
中以0.5X TBE buffer作為電泳的介質，以100伏特進行約30分鐘的電泳，電泳完 成後將膠片置於EtBr中染色20分鐘，最後放在UV燈光下觀察結果。在經過確認 之後，我們可以清楚發現，PCR的產物大小符合我們的預期，Ku80 G-1401T
中以0.5X TBE buffer作為電泳的介質，以100伏特進行約30分鐘的電泳，電泳完 成後將膠片置於EtBr中染色20分鐘，最後放在UV燈光下觀察結果。在經過確認 之後，我們可以清楚發現，PCR的產物大小符合我們的預期，Ku80 G-1401T