在這個章節中，將會開始逐一地介紹本實驗，其介紹的內容依序 為樣本選取、研究架構、研究步驟、研究工具以及資料處理等。
3.1 樣本選取
本實驗所採用的膠原蛋白為 Sigma 公司所生產製造，由於膠原蛋 白的類型有很多種，所以本實驗採用的是 Type I(C-9879, Sigma)型 式，此型式的膠原蛋白是由牛的阿基里斯腱所粹取出來的。而且，此 得真空變溫平台(MicrostatHe, Oxford)可以與顯微鏡做結合。
DPSSL 532 nm (Verdi, Coherent)
objective 10x low-noise
pre-amplifier high-voltage power supply
IR-cut filter P M T A/D
converter
Mode-locked Ti:sapphire (Mira-900,Coherent)
Temperature Control Vacuum Pump
Sample FV300,Olympus
X-Y Galvano Mirror Dichoric
Mirror
圖 3.1 反射式倍頻真空變溫顯微系統架構
在光路部分，以 DPSSL 雷射(Verdi-10, Coherent)激發鎖模鈦藍 寶石(Ti:Sapphire)雷射(Mira-900F, Coherent)之後，產出超短的脈 衝光源，並將此光源導入共焦顯微鏡的掃瞄器內，再經由一面双色鏡 (Dichoric Mirror)將光束經由 10X 物鏡(x10, Olympus)導入樣本之 中，而此樣本必須放置於一個真空變溫系統之內。由樣品產出的訊號
圖 3.2 反射式倍頻真空變溫顯微系統實體架設圖
真空變溫平台
光電倍增管 FV300
光反射出真空變溫平台之後，經由二色鏡入射到光電倍增管(PMT) 內，必須在光電倍增管之前加上一塊濾波片，來濾除原本的雷射光 束，進而保留所需的二倍頻訊號。之後，將光電倍增管所收到的二倍 頻訊號經由前置電流放大器放大，最後此倍頻訊號會呈現在電腦螢幕 上，圖 3.2 為實驗實體架設圖。
3.3 實驗步驟
雖然對此實驗設計了兩種不同的量測方式，不過量測的原則均是 相同的。首先，先前的準備工作是：脈衝雷射的熱機與波長的調整，
我們所使用的波長為 800nm 的近紅外光，架設之後並且調整雷射光 路，使得雷射光得以導入到掃瞄器之中。安裝適當的濾波片與光電倍 增管，完成以上步驟之後，要記得將雷射光束由發光處擋住。
著手進行時，先將有放置樣本的加溫銅片安置於真空變溫的平台 之上，並且在加熱銅片上放置一片玻璃的蓋玻片，目的是為了避免此 銅片上的膠原蛋白因為受熱而產生變型，使得對膠原蛋白加熱不均 勻，並且也可以防止所收集到的影像產生變化，如圖 3.3 示。
圖 3.3 膠原蛋白樣品放置完成圖
在完成樣本銅片的放置之後，蓋上真空變溫平台的封蓋，並對此 平台進行抽真空的動作，在經過粗抽和細抽之後，可由真空計讀出真
Pure Collagen
Vacuum Chamber Temperature
control
Glass cover
空度到達約為4 10 mbar× −5 時，便可開始進行量測。
由於使用變溫平台的緣故，我們採用長工作距離的特殊 10X 物鏡 (NA=0.25, Olympus)，如此可以防止平台玻璃窗因平台移動與物鏡碰 撞而毀損，並且能夠順利的完成量測。此時需要調整三維平移台的高 深淺表示二倍強訊號的強弱，其滿刻度為 4096。利用 Fluoview 程式 中的分析功能，來分析此數據。在此程式中，我們可以設定特定的範
SHGnorm
I 為以 300K 當基準後規一化的強度， 接著對這 些強度做圖，可得到第四章所顯示的結果。
圖 3.4 膠原蛋白之二倍頻影像