2-1 測量系統
2-1-1 共聚焦單點螢光系統
測量單點螢光變化實驗部份使用的是自行架設的測量系統，如圖 2-1。做為 激發光源的半導體雷射 (cyan laser, 488 nm, PC13589, Newport, U.S.A.) 經自組 裝的空間濾波器 (spatial filter) 除去空間中的光雜訊 (光斑)，來得到較好的光束 品質 (beam profile)，與光徑擴大器放大光束，並填滿物鏡的背面孔徑 (back aperture)，使得高 N.A. 值物鏡可發揮最佳的聚光效果。光徑被放大的激發光經 第一片二色鏡 (dichroic mirror, FF 500 / 646, Semrock, U.S.A. ) 反射進入倒立式 光學顯微鏡 ( inverted microscope, IX71, Olympus, Japan)，再經顯微鏡內的第二片 二色鏡 (dichroic mirror, FF735-Di01, Semrock, U.S.A.) 將光導至浸水式物鏡 (water immersion objective, UPLSAPO 60XW, N.A.=1.20, Olympus, Japan) 聚焦激 發樣品。樣品放出的螢光訊號再由同一物鏡收集，沿著原光路通過 FF 500 / 646，並經濾片 (LP02-488RU-25, Semrock, U.S.A.) 除去前面濾片未過濾掉的雷 射光，與波段穿越濾光鏡 (band-pass filter, D545/90m, Chroma, U.S.A.) 收集波長 500 nm 到 590 nm 的螢光。此波段螢光經焦距為 30 公分的透鏡聚焦到作為共 聚焦針孔的光纖上 (孔徑為 50 µm，N.A.=0.22，運作波長在 400-700 nm)，最後 由光電倍增管 (photomultiplier tube, H8249-001, Hamamatsu, Japan) 收取螢光。為 了增加訊號雜訊比 (signal-to-noise ratio)，我們在光路中加上一組光學阻斷器 (optical chopper, SR540, Stanford Research System, U.S.A.) 與鎖相放大器 (lock-in amplifier, SR850, SRS, U.S.A.) 配合，而光電倍增管輸出的電壓訊號經此放大器 轉換後傳至電腦中的訊號擷取卡 (data acquisition board, PCI-6221, National
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Instruments, U.S.A.)，由儀控程式 Labview (National Instruments, U.S.A.) 記錄。
考慮到樣品受雷射功率引起的螢光漂白、光電倍增管的光量負荷、鎖相放大器的 電壓負載、與訊雜比的因素，各儀器的設定參數如下：雷射功率為 13 µW，光 電倍增管的增益輸出 (gain) 為 0.83；鎖相放大器的靈敏度 (sensitivity) 為 0.5 V、時間常數 (time constant) 為 100 ms、過濾器 (filter) 為 24 dB/oct；Labview 程 式紀錄的 pixel time 為 150 ms。此系統中雷射、各濾片與染料的特性光譜如圖 2-2。
我們在顯微鏡上方設置一組鹵素燈 (U-LH-100L3, Olympus, Japan) 做為亮 視野影像的燈源，以避開螢光收取範圍的前提下，於光源出口處放置長波穿越濾 光鏡 (long-pass filter, FGL780S, Thorlabs, U.S.A.)，讓波長 780 nm 以上的光通過 物鏡與 FF735-Di01，到達電荷耦合元件 (charge-coupled device, Wat-902B, Watec, Japan) 而形成亮視野影像，與前述實驗進行同步觀測。
LF
LF BF
Obj ND
DM
Lock-in amplifier DM
CCD
Cyan laser 488 nm
PMT
SP OC
Reference in ML
Condenser
圖 圖 圖
圖 2-1 自行組裝的共聚焦螢光顯微鏡系統架設圖自行組裝的共聚焦螢光顯微鏡系統架設圖自行組裝的共聚焦螢光顯微鏡系統架設圖自行組裝的共聚焦螢光顯微鏡系統架設圖。。。 。
ND: neutral density filter; OC: optical chopper; SP: spatial filter; DM: dichroic mirror;
Obj: water immersion objective; ML: mercury lamp; LF: long-pass filter; BF:
band-pass filter.
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400 450 500 550 600 650 700 750 800 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
T ra n s m is s io n
Wavelength / nm
FF500/646-Di01 488 nm laser CF Absorption CF Emission
圖圖
圖圖 2-2 共聚焦螢光共聚焦螢光共聚焦螢光顯微鏡共聚焦螢光顯微鏡顯微鏡顯微鏡系統中雷射系統中雷射系統中雷射、系統中雷射、、各濾片、各濾片各濾片、各濾片、、與染料的特性光譜、與染料的特性光譜與染料的特性光譜。與染料的特性光譜。。 。
羧基螢光素的最大吸收與放射分別為 492 nm 與 517 nm。黃色區塊為偵測器收 取的螢光範圍。
2-1-2 共聚焦螢光影像系統
除 了 自 行 架 設 的 共 聚 焦 系 統 ， 我 們 也 利 用 FV300 共 聚焦 顯微 鏡系 統 (confocal microscope, Olympus, Japan) 來得到螢光影像，使用的光源為氬離子雷 射 (argon ion laser, 488 nm, CVI Melles Griot, U.S.A.)，搭配 60X 浸水式物鏡聚焦 激發樣品。樣品的螢光經過共焦光圈 (confocal aperture) 到達偵測器 (R3896, Hamamatsu, Japan)。掃描時雷射強度為 100 µW，共焦光圈直徑為 60 µm，搭配 二色鏡 (DM570, Olympus, Japan) 與長波穿透濾片 (BA510IF, Olympus, Japan) 收取波長 510 nm 到 570 nm 的螢光，掃描的影像範圍約 23.5 µm×23.5µm (256 pixels×256 pixels)，單張掃描時間為 1.65 s，連續掃瞄的時間間距為 0.5 s。
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2-1-3 螢光相關光譜系統
另外，我們也自行架設了一套螢光相關光譜系統，如圖 2-3，量測蜂毒胜肽 與膜作用後的細胞膜流動性變化。系統的架設與前述的單點螢光測量系統類似，
簡述如下。以波長為 632.8 nm 的氦氖雷射 (1137P, JDS Uniphase, U.S.A.) 做為 激發光源，經一組空間濾波器與光徑擴大器後，激發光由二色鏡 FF 500 / 646 反 射進入倒立式光學顯微鏡，樣品放出的螢光訊號延原光路穿過二色鏡，並經焦距 為 30 公分的透鏡聚焦到共焦針孔上，聚焦前我們利用分光鏡 (50/50 beam splitter, EBS1, Thorlabs, U.S.A.) 將螢光平均分成兩道路徑，並加上波段穿越濾光 鏡 (HQ 680/60m, Chroma, U.S.A.) 蒐集樣品螢光。我們將共焦針孔孔徑設為 50 µm，目的在於製造出測量螢光分子擴散的偵測體積 (focal volume)。最後由雪崩
光電二極管 (avalanched photodiode, SPCM-AQR-15-FC, PerkinElmer, U.S.A.) 收 取螢光。雪崩光電二極管會將收到的光子訊號轉成電子脈衝訊號，並經時間相關 單光子計數器 (Flex02-01D, Correlator, U.S.A.) 計算螢光分子的相關曲線。另 外，我們也利用一組電動移動移動平台 (scanning stage) 做細胞膜位置的相關曲 線掃描。此系統中雷射、各濾片與染料的特性光譜如圖 2-4。
螢光相關光譜進行樣品量測前，需先進行系統優化 (optimization) 與校正，
得知測量時的聚焦體積大小與形狀。
(1) 螢光相關光譜技術的優化 (optimize) 與系統校正
在系統優化的過程中，以光行進的方向為軸向，我們先利用螢光染料對收光 處不同軸向位置作強度的掃描，在強度較大的區域再作細部的系統值掃描，最後 針對玻片厚度微調物鏡上的修正環 (correction ring)，根據參考文獻，理想的螢光 相關光譜系統，聚焦點長短軸比 (r/z) 為 1/6 - 1/3 32。
我們量取已知擴散係數的染料之相關曲線，計算得到染料的擴散時間與聚焦
點長短軸比 (r/z)，進而算出聚焦點短軸半徑 (r) 與偵測體積 (focal volume)。測
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BF Obj
ND
DM
He-Ne laser 633 nmSP
APD
correlator
1E-4 1E-3 0.01 0.1 1
1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
G
Time / sec
圖 圖 圖
圖 2-3 自自自自行組裝的螢光相關光譜系統架設圖行組裝的螢光相關光譜系統架設圖行組裝的螢光相關光譜系統架設圖行組裝的螢光相關光譜系統架設圖。。。 。
ND: neutral density filter; SP: spatial filter; DM: dichroic mirror; Obj: water immersion objective; BF: band-pass filter.
550 600 650 700 750
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
T ra n s mi s s io n
Wavelength / nm
FF500/646-Di01 HQ680/60m DiD Absorption DiD Emission 633 nm laser
圖圖
圖圖 2-4 螢光相關光譜系統之螢光相關光譜系統之螢光相關光譜系統之螢光相關光譜系統之雷射光源雷射光源雷射光源雷射光源、、、、各濾片各濾片各濾片各濾片與染料與染料與染料與染料的的的的特性光特性光特性光特性光譜譜譜譜。。。。
類脂質染料 DiD 的最大吸收與放射分別為 648 nm 與 670 nm。綠色區塊為偵 測器收取的螢光範圍。
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R e s id u a l G ( τ )
Delay time / s
Data point Fitting curve
圖圖
圖圖 2-5 Alexa633 的自相關函數與擬合結果的自相關函數與擬合結果的自相關函數與擬合結果。的自相關函數與擬合結果。。。
利用 1 nM Alexa633 的 PBS 水溶液作系統校正，其擴散係數為 1.35×10-10 m2s-1
33，經過自相關函數 (autocorrelation function)
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2-2 樣品製備
我們利用電生成法 (electroformation) 製作實驗所需的脂質體。這種方法有 材料簡單、製作過程容易、空間限制小的優點，自 1986 年 Angelova 提出之後
34，對於製作粒徑較大的脂質體 (giant unilamellar vesicles, GUVs)，是廣為使用 的方法。實驗中，產物的粒徑主要分佈在 10-30 µm 的範圍。製作過程簡述如下 並以 圖 2-6 表示：
將儲存於 -20o.C 的 5 mM POPC 脂質溶液回溫備用 (溶劑體積 氯仿:甲醇 = 9:1 )
↓
將 ITO (Indium Tin Oxide) 玻璃用甲醇擦拭乾淨，靜待風乾後，在導電面用銅漆 膠帶貼上電線
↓
分別在 ITO 玻璃導電面上滴 20 µL 的脂質溶液，使之均勻分布在玻片上
↓
(◎)用氮氣將玻璃上的溶劑吹乾，接著抽真空靜置 1 小時，讓殘餘的溶劑完全 揮發
↓
取一個中空直徑為 20 mm 的墊片 (chamber, 664113, Grace Bio-Labs, U.S.A.) 貼 在玻片導電面上，讓乾燥的脂質置於墊片中間，形成製備微脂體時所需的空間
↓
在墊片內注入 300 µL 的 0.2 M 葡萄糖溶液，接著另一片玻璃以導電面向下的 方式蓋上
↓
將波形產生器 (function generator, SFG-2104, Instek, U.S.A.) 的輸出電線分別接
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到上下兩玻片的電線上
↓
開啟波形產生器，以 10 Hz、3V(peak-to-peak)、sin wave、2 h 的條件通電
↓
關閉波形產生器，移除上玻片，收集墊片內的微脂體溶液至褐色微量離心管內備 用。
螢光相關顯微技術使用的樣品，須在膜上嵌入類脂質染料 DiD，製作方法 與前述過程類似：5 mM POPC 與 10 nM DiD 回溫後，分別取體積 40 µL 與 80 µL 混合均勻，然後塗佈在 ITO 玻片上，接著從記號(◎)開始的步驟皆相同。
在玻璃導電面上滴脂質 溶液，讓溶劑完全揮發
貼上墊片並注入 0.2 M 葡萄糖水溶液
以導電面向內的方式蓋 上另一片玻璃
將玻片接上訊號產生器，
以10 Hz、3V(peak-to-peak)、sin wave、2 h 的 條件通電
通電完移除上玻片，收 集微脂體溶液至微量離 心管內備用
圖圖
圖圖 2-6 脂質體製備流程脂質體製備流程脂質體製備流程脂質體製備流程。
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2-3 混合脂質體與不同濃度蜂毒胜肽的樣品製備與量 測
填裝樣品前，先用甲醇將製備樣品用的玻 (cover glass, 22×50 mm, thickness
#1.5, 72204-04, Electron Microscopy Science, U.S.A.) 擦拭乾淨，貼上中空直徑為 9 mm 的墊片 (chamber, 664112, Grace Bio-Labs, U.S.A.)，墊片內可填裝體積為
60 µL，因為要即時觀察加入蜂毒胜肽的螢光變化，所以在配置樣品時需預留蜂
毒胜肽的體積，待樣品置於顯微鏡上再加入進行觀察。除了脂質體在製作過程中 使用 0.2 M 葡萄糖水溶液外，稀釋蜂毒胜肽、稀釋染料皆是使用 0.1 M NaCl 水 溶液，這種情況下，脂質體內外的密度與折射率不同，它會自然沉降在底部，我 們也容易觀察到脂質體的輪廓。
2-3-1 共聚焦單點螢光系統與共聚焦螢光影像系統
在此部份實驗中，蜂毒胜肽加入的濃度分別為 0 µM (控制組)、0.02 µM、0.05 µM、0.1 µM、0.2 µM、0.5 µM。樣品混合步驟如下：取 10 µL 脂質體溶液到墊 片內，加入計算好濃度的羧基螢光素水溶液，使得最後濃度為 8 µM，將樣品移 至顯微鏡上，並靜置 5 分鐘待脂質體受重力沉降，以移液管吸取要加入的蜂毒 胜肽溶液，輕壓移液管使溶液在吸尖管前端形成水滴狀，緩緩靠近樣品，讓水滴 底部碰觸樣品溶液，使得水滴自然溶於樣品溶液並開始計時，此步驟需小心不可 讓管尖端浸入樣品，會產生液體的擾動進而讓脂質體產生漂動。最後輕輕蓋上蓋 玻片，確定脂質體沒有漂動，即可開始觀測脂質體的共聚焦顯微鏡影像與內部螢 光變化。量測時的系統參數設定已於前面章節敘述，見 2-1-1。共聚焦顯微鏡影 像使用的參數已於 2-1-2 中詳述。
2-3-2 螢光相關光譜系統
觀測脂質體流動性的實驗中，樣品配置與上述步驟類似，但脂質體是置於無 螢光的 0.1 M NaCl 水溶液中等待沉降，再加入蜂毒胜肽，然後進行螢光相關光 譜量測。測量細胞膜流動性使用的雷射功率為 13 µW。
在溶液中沉降的脂質體，底部與玻片相接，下層膜的訊號會受玻片影響，所 以我們在此部分的實驗皆選擇脂質體的上層膜作測量。從亮視野影像中，先將脂 體中心點移至雷射聚焦處，然後切換亮視野，導入雷射光，將雷射聚焦點移至上 層膜，此時會出現微弱的反射亮點，接著進行細胞膜螢光相關曲線的縱向掃描。
當雷射準確聚焦在細胞膜上，會有以下幾個特徵：(1) 光子數最高，(2) 螢光粒 子數最少，對應到相關曲線的振幅 (相關性) 會最大，(3) 擴散時間最短35。
當雷射準確聚焦在細胞膜上，會有以下幾個特徵：(1) 光子數最高，(2) 螢光粒 子數最少，對應到相關曲線的振幅 (相關性) 會最大，(3) 擴散時間最短35。