3-1 脂質體與蜂毒胜肽作用後亮視野影像變化
當細胞膜受到蜂毒胜肽攻擊，除了膜的厚度改變外，還會形成孔洞甚至破 裂，為了了解蜂毒胜肽攻擊細胞時細胞膜外觀是否有變化，我們利用亮視野影像 來找出線索。實驗中，我們觀察了不同蜂毒胜肽濃度、不同直徑 (20 µm ~ 30 µm) 的脂質體，也發現到每個體之間的反應情形都不相同。
加入蜂毒胜肽後，部份脂質體會維持直徑大小與位置，如圖 3-1 (A)，但部 份脂質體會有從原聚焦平面失焦的現象，影像上直接觀察到微脂體的輪廓變得模 糊。針對失焦的現象，有三種可能：
1. 脂質體的形變現象：沉降在底部的脂質體原本是球形，因為蜂毒胜肽吸 附或嵌入細胞膜時，會造成原本脂質分子 (lipid) 的排列情形改變，進而影響膜 的堅固性，讓脂質體變扁呈現橢圓形，在原聚焦平面的影像因此變模糊。
2. 脂質體的大小改變：與上述的形變不同，脂質體可能會有部份脂質分子 脫離細胞膜情況發生，為了填補減少的脂質分子的空位，其它脂質分子會再度融 合 (fusion) 而形成直徑較小的脂質體，所以原聚焦平面的影像因此變模糊，如 圖 3-1 (D)。
3. 顯微鏡本身的軸向位移：此原因與樣品本身無關，而是觀測儀器的缺陷，
當我們進行調整物鏡在軸向位置的動作時，同時涵蓋數個機械齒輪的運轉，在我 們調整到適當高度，並移除加在齒輪的外力後，理論上會停止移動並固定，但實 際上，有可能產生些微的鬆動，使得軸向位置偏移，所以原聚焦平面的影像因此 變模糊。
除了軸向的位移，脂質體也會出現橫向的位移，還有抖動後伴隨橫向位移的 現象，如圖 3-1 (B)，推測是當蜂毒胜肽吸附並穿透細胞膜時，蜂毒胜肽的結構
與脂雙層結構無法緊密排列，在穿透的地方會形成缺陷，膜上的缺陷瞬間受到內 外液體交換的擾流推擠 (抖動)，順著擾流推力開始出現橫向位移的情形。若膜 上同時有多個 蜂毒胜肽吸附，或擾流很劇烈的情況下，脂質體也會在瞬間破裂，
如圖 3-1 (C)。我們觀測到的結果與 Mally 等人在 2007 所觀測到的現象相當接 近類似31。
30
(B)
(C) (A)
(D)
20 µm
圖圖
圖圖 3-1 脂質體與脂質體與脂質體與脂質體與蜂毒胜肽蜂毒胜肽蜂毒胜肽蜂毒胜肽作用後亮視野影像變化作用後亮視野影像變化作用後亮視野影像變化作用後亮視野影像變化。。。 。
(A) 靜止不動，脂質體半徑為 20 µm。(B) 平面上位移，脂質體半徑為 24 µm。
(C) 破裂，脂質體半徑為 24 µm。(D) 半徑變小，脂質體半徑變化前為 20 µm，
變化後為 15 µm。
3-2 脂質體與蜂毒胜肽作用後內部共聚焦螢光隨時間 的變化
誠如我們在前文所提到，蜂毒胜肽吸附在細胞膜上之後，產生穿膜孔洞的過 程目前並不清楚。所以我們在脂質體外放置染料，並即時觀察單一脂質體與峰毒 胜肽反應之後，內部的螢光變化情形，希望可以得到孔洞形成過程的資訊。因此，
我們自行架設一套共聚焦螢光顯微系統觀察脂質體內的螢光變化，並對不同濃度 的蜂毒胜肽做測試。
實驗得到的螢光強度隨時間變化，如圖 3-2 所示，列舉各蜂毒胜肽濃度的脂 質體內螢光訊號：(A) 圖為未加蜂毒胜肽的時間軌跡圖。圖 3-2 (B)-(F) 為 0.02
µM-0.5 µM 蜂毒胜肽下的時間軌跡圖。我們可以看到，在低濃度下，即使混合
時間長達一小時，也不會發現脂質體內有大量螢光增強的情形。另外，從結果中 我們可以發現，加入蜂毒胜肽之後，我們在脂質體中央量測到的螢光強度有呈現 間歇上升的情況，且每此上升的高度都很接近，根據這些觀察，我們初步猜測蜂 毒胜肽與細胞膜的作用關係有可能是單分子 (蜂毒胜肽) 的攻擊行為。若突峰的 出現與蜂毒胜肽攻擊細胞膜的過程有關的話，藉由了解突峰之間的關聯，我們有 機會了解細胞膜變化的資訊。
此部分實驗中，我們觀察單一脂質體內部的螢光變化，會得到許多突峰；同 樣蜂毒胜肽濃度下，我們偵測多個脂質體內部的螢光變化情形。針對每個突峰，
我們分析三個參數：上升高度、上升時間、與峰值間距 (圖 3-3 (A)中的 (a)、(b)、
(c))。分析步驟如圖 3-3 所示:
1. 上升高度 (rise height)：定義為突峰上升過程的最低點到峰頂的電壓差。
2. 上升時間 (rise time)：定義為達到上升高度所耗費的時間。
3. 峰值間距 (rise interval)：定義為相鄰兩突峰峰頂的時間差。
我們把一個突峰視為一個事件 (event)，個別進行以上三個參數的統計處理。針
32
對一個參數而言，在同樣蜂毒胜肽濃度下，將多個脂質體螢光變化圖中得到的所 有突峰事件的參數值一一求出，並做參數值的統計圖 (histogram)，以上升高度 的分析為例，如圖 3-3 (B)，再將統計結果進一步做高斯分布多峰擬合 (Gaussian multipeak fitting)，(圖 3-3 (C))，可得到該統計圖分布的峰值與半高寬 (full-width half-maximum)。我們測試不同蜂毒胜肽濃度，進行相同分析，並得到各濃度下
現：在脂質體破裂之前，會有許多小幅度的突峰密集出現。且在較高濃度的蜂毒 胜肽下，較容易出現螢光緩慢上升的情況。
所有的參數統計圖的擬合結果與事件總和數詳細列於表 3-1、表 3-2、表 3-3。
34
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0.0
Intensity / V
Time / s
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0.0
Intensity / V
Time / s
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0.0
Intensity / V
Time / s
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0.0
Intensity / V
Time / s
Intensity / V
Time / s
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0.0
Intensity / V
Time / s
N
Fitting peak 1 Fitting peak 2 Peak sum
(C)
Intensity / V
Time / s
36
0.000 0.04 0.08 0.12 5
10 15
Number of occurance
Rise height / V 0
5 10 15
Number of occurance
0 5 10 15 20
Number of occurance
0
Number of occurance
0 2 4 6 8
Number of occurance
(A)
(E)
(A)
Number of occurance
Rise time / s
Number of occurance
0 10 20 30 40
Number of occurance
0
Number of occurance
0
Number of occurance
圖圖
圖圖 3-5 不同蜂毒胜肽濃度的突峰上升時間不同蜂毒胜肽濃度的突峰上升時間不同蜂毒胜肽濃度的突峰上升時間不同蜂毒胜肽濃度的突峰上升時間 (rise time) 統計圖統計圖統計圖統計圖。。。。
(A) 0.02 µM, n=65，(B) 0.05 µM, n=198，(C) 0.1 µM, n=196，(D) 0.2 µM, n=179，
(E) 0.5 µM, n=192。
38
Number of occurance
Rise interval / s 0
Number of occurance
0
Number of occurance
0
Number of occurance
0 1 2 3 4
Number of occurance
圖
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.00
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
R is e h e ig h t / V
Melittin concentration / uM
圖圖
圖圖 3-7 不同蜂毒胜肽濃度的突峰不同蜂毒胜肽濃度的突峰不同蜂毒胜肽濃度的突峰不同蜂毒胜肽濃度的突峰上升高度之高斯多峰分布上升高度之高斯多峰分布上升高度之高斯多峰分布擬合上升高度之高斯多峰分布擬合擬合結果擬合結果結果。結果。。 。
上升高度的分布結果呈現近似倍數關係 (圖中粉色帶區域)，這有可能代表著單 一個、兩個、或是三個峰毒胜肽分子的攻擊行為，即也呼應我們之前提到蜂毒胜 肽為單分子攻擊行為的猜測。
40
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
R is e ti m e / s
Melittin concentration / uM
圖 圖 圖
圖 3-8 不同蜂毒胜肽濃度的突峰不同蜂毒胜肽濃度的突峰不同蜂毒胜肽濃度的突峰不同蜂毒胜肽濃度的突峰上升時間之高斯多峰分布上升時間之高斯多峰分布上升時間之高斯多峰分布擬合上升時間之高斯多峰分布擬合擬合結果擬合結果結果。結果。。 。 比較不同濃度的擬合曲線結果，上升時間可視為相同。
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 -10
-5 0 5 10 15 20 25 30
R is e i n te rv a l / s
Melittin concentration / uM
圖 圖 圖
圖 3-9 不同蜂毒胜肽濃度的突峰不同蜂毒胜肽濃度的突峰不同蜂毒胜肽濃度的突峰不同蜂毒胜肽濃度的突峰峰值間距之高斯多峰分布峰值間距之高斯多峰分布峰值間距之高斯多峰分布擬合峰值間距之高斯多峰分布擬合擬合結果擬合結果結果。結果。。 。
當蜂毒胜肽濃度上升，峰值間距有下降的趨勢。當溶液中的蜂毒胜肽越來越多，
脂質體被碰撞的機會也越多，進而會增加蜂毒胜肽吸附在脂質體上的頻率，我們 就會觀測到蜂值間距越來越短的現象。
42
[Melittin] n / µµµµM
Rise interval / s
3-3 利用共聚焦顯微鏡觀察脂質體與蜂毒胜肽作用後 的螢光影像變化
共聚焦顯微鏡自 1971 年問世之後36，經過不斷的改良，現在已經廣泛應用 在許多領域，特別是生物影像的觀察。
在一片配製好的樣品中會有許多不同大小的脂質體，為了模擬真實細胞受到 胜肽攻擊的環境 (細胞膜表面積)，我們傾向選用粒徑在 20-30 µm 的脂質體作測 量，並紀錄二維-時間系列掃描 (XYT series scan) 的影像。
圖 3-10 (A) 是在不含蜂毒胜肽環境下取得的脂質體 (粒徑為 16 µm) 二維 螢光影像，脂質體內部無明顯螢光，形貌完整；圖 3-10 (B) 為相對應的穿透光 亮視野影像，沒有發現明顯失焦的現象。我們將隨時間紀錄的每張影像中脂質體 內螢光訊號加總後，再除上脂質體的面積，得到脂質體的單位面積螢光強度隨時 間變化圖，如圖 3-10 (C)。結果顯示，脂質體內部的平均強度很低且相當穩定，
也表示未加入蜂毒胜肽時，細胞膜通透性很低，沒有螢光洩漏進去的情形發生。
當加入 2 µM 蜂毒胜肽後，出現了幾種不同結果：原本單一巨大單層脂質 體 (粒徑為 20 µm) 內部無螢光，經過一段時間後螢光強度忽然增加，接著慢慢 下降，如圖 3-11 (A)。若螢光是從膜上一個缺陷而引起螢光洩露，在空間中應會 從缺陷處向內形成一道高濃度的染料流，所以從我們擷取的二維影像上，應有機 會在脂質體內部看到螢光較強的區塊。針對螢光增強過程的影像結果來看，並沒 有觀察到明顯的螢光亮區，如圖 (A) 中的 240 s-300 s 的影像，所以無法判斷染 料是經由何種管道與方向進入膜內。螢光下降的現象有可能是膜上的缺陷消失 後，稍早進入的染料流在脂質體內慢慢擴散造成。從圖 3-11 (C) 的單位面積螢 光強度隨時間變化圖中，可以發現螢光有間歇性的上升情形，與單點螢光測量的 實驗有相同的結果。比較 230 s 之前與 350 s 之後的平均螢光強度，後來螢光 有略為升高的情形，且隨著時間增加，螢光有慢慢上升的趨勢。所以，在觀測過
44
成一道高濃度的染料流，所以在脂質體內部會看到螢光較強的區塊，我們也會觀 察到螢光不均勻的現象。
單一蜂毒胜肽也有可能進行如圖 3-14 (A) 的攻擊流程。溶液中的蜂毒胜肽 因靜電力吸附到細胞膜上後，擾亂整個細胞膜上脂質分子的排列，整體結構鬆 散，進而導致整體性的細胞膜通透性增加，外部的螢光分子此時會進入脂質體內 部，我們預期會看到如圖 3-14 (B) 的螢光變化圖，螢光會持續上升直到蜂毒胜 肽分子脫離細胞膜，脂質分子的排列恢復為止。二維的螢光影像上應會看到均勻 的螢光增強情形。
我們也假設脂質體會受到多重蜂毒胜肽的攻擊，流程如圖 3-15 (A)。多個峰 毒胜肽因靜電吸附到細胞膜上，並在細胞膜上流動，接著多個峰毒胜肽在膜上形
我們也假設脂質體會受到多重蜂毒胜肽的攻擊，流程如圖 3-15 (A)。多個峰 毒胜肽因靜電吸附到細胞膜上，並在細胞膜上流動，接著多個峰毒胜肽在膜上形