1-1 蜂毒胜肽基本性質與抗菌胜肽攻擊細胞膜之模型 介紹
當生物受到外物入侵時，會啟動自己的防禦措施。鳥類、爬蟲類等脊椎動物 有先天免疫系統與後天免疫系統把關。植物除了有細胞壁的屏障之外，還會分泌 酵素抑制外物入侵，例如可分解真菌細胞壁的葡聚醣酶 (glucanase)1 與幾丁質酶 (chitinase)2。魚類部份臟器上的肥大細胞 (mast cell)3, 4 內存在具有溶血作用的胜 肽，魚體表面受傷時，細胞組織蛋白會斷裂釋出胜肽片段來抵禦入侵的微生物5。 而許多昆蟲會在體內形成小分子的胜肽來破壞入侵物的細胞膜6。這類小分子胜 肽最早是在 1960 年代被發現，科學家無意間從實驗中發現動植物被細菌入侵 時，會分泌小蛋白質攻擊細菌，使其迅速死亡，因此便將此類蛋白質命名為抗菌 胜肽 (antimicrobial peptide, AMP)。
值得一提的是，這些抗菌蛋白雖小，它對生物體的保護作用卻非常大。 一 般來說，我們利用抗生素來消滅體內的微生物，服用後需要一段反應時間才可將 細菌殺死，而且長期服用容易出現抗藥性。抗菌蛋白依照消滅細胞的方式主要可 以分為，細胞內部殺害 (intracellular killing) 與形成穿膜孔洞 (transmembrane pore-forming) 兩大類7。前者可能會讓細胞內物質凝聚8、抑制細胞膜合成9、抑 制核酸合成10、抑制蛋白質合成11、或是以抑制酵素作用12的方式使細胞失去功 用而死亡；後者會在細胞膜上形成孔洞或讓細胞膜碎裂導致細胞死亡。針對形成 孔洞的抗菌蛋白而言，破壞入侵物的方法，是利用胜肽與微生物細胞膜上相異的 電性而吸附在膜上，接著會在膜上形成聚集，進而使細胞膜產生孔洞或破裂，最 後細胞質外漏導致細菌死亡。抗菌蛋白產生與作用的速度很快，可在幾分鐘之內 殺死細菌。此外，因為抗菌蛋白是物理性的破壞，較不易產生抗藥性，可以廣泛
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作用在病毒、細菌、與真菌上7。一般而言，抗菌蛋白有幾個特性：胺基酸序列 不超過 60 的小分子、帶正電、同時擁有親水端與疏水端的性質。有許多因素會 影響胜肽的抗菌力：胜肽的二極結構 (conformation)、胜肽的電荷 (charge)、疏 水性強弱 (hydrophobicity)、極性角度 (polar angle)13。
抗菌蛋白主要有兩種破壞細胞膜的機制：桶板模型 (barrel-stave model) 與 脂質核心 (lipid core)、親水面朝向內部的穿膜孔洞 (transmembrane pore)。在進 行地毯模型的過程中，抗菌蛋白從頭到尾與脂質頭端 (lipid headgroups) 相接，
當吸附在膜上的抗菌蛋白數量超過一個門檻 (threshold) 時，抗菌蛋白會旋轉 (rotation) 形成穿膜孔洞，也就是環孔。此模型與桶板模型的不同點在脂質分子 的排列方式，地毯模式的抗菌蛋白分子即使垂直穿透細胞膜平面，其周圍的脂單 層 (lipid monolayer) 會彎曲並以頭端與抗菌蛋白相接，形成如微胞 (micelle) 的 排列；穿透膜的抗菌蛋白分子會進一步吸附在脂質內層 (lipid inner leaflet)，或是 小區塊的脂質被抗菌胜肽包圍而脫離，形成小碎片。在所有的抗菌胜肽中，屬於 barrel-stave model 攻擊模式的有 alamethicin；屬於 carpet model 攻擊模式的有 Dermaseptin S、 cecropin、ovispirin7。
在自然界中，有一類毒素，因其作用機制與抗菌胜肽很類似，也會對細胞膜
本實驗要研究的蜂毒胜肽 (melittin)，取自歐洲蜜蜂 Apis mellifera 的毒液，
為蜂毒內的主要成分之ㄧ，佔了毒液除水後百分之五十的重量15，屬於溶血性胜 肽，後來科學家發現它也具有殺菌能力6。蜂毒胜肽由 26 個胺基酸組成，其序 列為 NH2-GIGAV-LKVLT-TGLPA-LISWI-KRKRQ-Q-CONH214，前 20 個胺基酸 的序列為疏水端 (hydrophobic tail)，最後 6 個胺基酸為親水端 (hydrophilic tail)。這兩種同時存在的性質使得蜂毒胜肽可以自然的與細胞膜接觸與反應。在 與人體液相同的生理環境下，蜂毒胜肽會帶 5-6 個正電 (序列中畫底線者)，主 要分布在親水端，此電荷分布與蜂毒胜肽的作用機制有很大的關係。(圖 1-2) 在 低濃度或低鹽度水溶液中，蜂毒胜肽是呈現隨機纏繞 (random coil) 結構的單體 (monomer) ， 當 蜂 毒 胜 肽 吸 附 到 細 胞 膜 上 ， 則 會 轉 變 成 彎 曲 的 螺 旋 狀 (bent α-helix)，並以此形式進行穿膜行為；若是在強鹼、高濃度或是高鹽度的環境下，
蜂毒胜肽會形成四聚體 (tetramers)18。
目前的研究結果顯示蜂毒胜肽是以 barrel-stave model 進行膜穿孔。當隨機 纏繞的蜂毒胜肽因靜電作用吸附在細胞膜上，會轉變成 bent α-helix 結構。在低 濃度的情況下，蜂毒胜肽會以螺旋軸 (helix axis) 平行細胞膜平面的方式存在膜 上。隨著蜂毒胜肽的濃度變高而出現穿透膜 (transmembrane) 的行為，螺旋軸垂 直細胞膜平面的胜肽比例也會漸漸提升，多個蜂毒胜肽聚集後形成孔洞。
因為蜂毒胜肽有分子小、易取得、反應快速的優點，除了其本身的作用機制 被廣泛研究外，也有與其他抗菌胜肽複合物的延伸研究出現，近年來，更常被當 作探討脂質-蛋白質交互作用 (lipid-protein interaction) 的模型。而蜂毒胜肽的溶 血性與抗菌機制，不只作用在細菌與真菌身上，對癌細胞也有破壞的效果19，加 上無抗藥性的特質，以蜂毒胜肽為基底的抗癌藥物開發可謂潛力無窮。
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圖圖
圖圖 1-1 抗菌胜肽抗菌胜肽抗菌胜肽抗菌胜肽的的的的兩種破壞細胞膜的機制兩種破壞細胞膜的機制兩種破壞細胞膜的機制兩種破壞細胞膜的機制14。。。。
地毯模型 (carpet model) 與桶板模型 (barrel-stave model)。在地毯模型中，胜肽 分子利用具疏水性的一側與細胞膜相接 (圖中黑色區域)，親水側則面向水溶液 (紅色區域)。當胜肽濃度到達某個門檻 (threshold) 時，細胞膜會被破壞形成小碎 片。桶板模型中，覆蓋在膜上的胜肽會穿透脂雙層聚集成束，形成疏水面朝向脂 質核心 (lipid core)、親水面朝向內部的穿膜孔洞 (transmembrane pore)。
(A)
(B)
圖圖
圖圖 1-2 蜂毒胜肽蜂毒胜肽蜂毒胜肽蜂毒胜肽的立體結構的立體結構的立體結構。的立體結構。。。
(A) Bent α-helix20。(B) Helical wheel projection22。蜂毒胜肽有 26 個胺基酸，其序 列為 NH2-GIGAV-LKVLT-TGLPA-LISWI-KRKRQ-Q-CONH2，前 20 個胺基酸的 序列為疏水端 (圖中白色的區域)，最後 6 個胺基酸為親水端 (圖中灰黑色區 域)，這兩種同時存在的性質使得蜂毒胜肽可以自然的與細胞膜接觸與反應。在 正常生理環境下，蜂毒胜肽會帶 5-6 個正電。
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1-2 蜂毒胜肽與細胞膜作用之相關文獻
在本章節，將要回顧蜂毒胜肽與細胞膜作用的相關文獻，了解這個領域內其 他團隊使用的不同細胞膜模型、測量方法與發現到的結果。
蜂毒胜肽首先於 1967 年由 Habermann 與 Jentsch 解出 26 個胺基酸序 列14，接著在 1969 年 Jentsch 利用旋光色散法 (optical rotatory dispersion) 測量 出蜂毒胜肽的多肽鏈在水中呈現隨機構形21。
1971 年 Kreil 等人首次在活體內將蜂毒胜肽上，其中一種胺基酸的碳置換 成具有輻射線的同位素，並發現存在一個蜂毒胜肽的前趨物 「promelittin」22。 1981 年 Steiner 等人在免疫學期刊上發表，蜂毒胜肽不只會溶解紅血球細胞，也 會對 E.coli 產生殺菌的作用6。
2000 年 Lin 等人利用分子模擬單一蜂毒胜肽吸附在細胞膜上的情形，除了 發現蜂毒胜肽與細胞膜間保持一定距離，也發現此胜肽有髮夾狀 (hairpin-like) 的結構，且夾頂在 proline 上23。同年，Natio 等人利用 NMR 觀察到胜肽分子 在膜上會以平均螺旋軸轉動或是結構重組，而且他們也發現蜂毒胜肽的彎曲角度 為 140o 或 160o，當胜肽持續進行穿膜與形成孔洞的動作時，脂雙層會被推開，
進而導致膜的碎裂。2001 年 Yang 等人利用中子繞射 (neutron diffraction) 與指 向性雙圓極化光吸收光譜技術 (oriented circular dichroism) 求得，蜂毒胜肽在 POPC 脂質膜上形成的孔洞外徑與內徑分別為 7.6 nm 與 4.4 nm，且孔洞大小與 胜肽的濃度無關，且從孔徑的大小判斷，較有可能屬於 toroidal model，而蜂毒 胜肽的 helical axis 垂直於膜的量會與胜肽濃度有關24。同時，2003 年 Papo 等 人利用表面電漿共振技術 (surface plasmon resonance) 觀測蜂毒胜肽嵌入不同電 性的脂質過程的結合與解離常數，並用兩種模型模擬穿膜行為25。
2004 年 Huang 等人想探討孔洞形成的動力與膜變薄的關連性，並提出孔 洞上存在兩種張力互相抗衡的假設：膜表面張力促使孔洞開啟，而孔緣的線性張
力導致孔洞關閉。另外，他們同時發現蜂毒胜肽與脂質分子到達一定比例後，細 胞膜厚度會趨於一穩定值 26。同一個團隊於 2008 年在 PNAS 期刊中，利用微 管吸引法 (micropipette aspiration method)27固定單一脂質體，並配合相差影像技 術，發現蜂毒胜肽存在一個閾值，在此閾值兩方的反應不相同：濃度低於 10-7 µM，細胞膜到蜂毒胜肽攻擊時，脂質體的體積維持不變，且膜表面積會有一定 比例的延展現象；濃度高於 10-7 µM，脂質體除了出現表面積有更高比例的延展 並維持外，還會出現膜延展後快速恢復為原大小的現象29。同一年，由 Bogaart 帶 領的另一個團隊利用測試不同批次的小顆單層脂質體，與溶液中蜂毒胜肽作用後 的螢光洩漏情形，提出蜂毒胜肽在細胞膜上吸附-穿膜的競爭模型，他們認為，
因蜂毒胜肽之間的排斥力，細胞膜可吸附的胜肽有一定的量，且經計算後可知胜 肽之間的平均距離為 2.5 nm，而吸附在膜上的胜肽影響穿膜行為 28。這個團隊 稍早也測試蜂毒胜肽在不同脂質分子上的行為，他們發現，蜂毒胜肽會對中性電 荷的脂質分子進行穿孔的行為，且孔洞大小與胜肽濃度有關，而對於帶負電的脂 質分子，會先產生直徑約 5 nm 的孔洞，接著進行膜融合 (fusion) 而結束螢光 洩 漏 29。 2008 年 Yu 等人利用螢光相關光譜技術 (fluorescence correlation spectroscopy) 觀察單層小微脂粒的螢光洩漏與擴散情形，他們發現峰毒胜肽會在 膜上產生孔洞外，同時會有脂質體聚集 (aggregation) 的現象；他們也對不同脂 質長鏈的飽和度做比較，發現蜂毒胜肽的作用不受碳鏈飽和度影響 30。2007 年 Mally 等人利用相位對比顯微技術 (phase-contrast microscopy) 探討單一巨大單 層脂質體與蜂毒胜肽之間的作用，並測試不同胜肽濃度的影響，她們依照作用結 果將濃度分為四個範圍，低濃度下，胜肽會吸附在膜上並有雙體 (dimer) 形成，
雙體進行穿膜動作後會將胜肽分配到脂雙層的內層，進而引起單體持續吸附在膜 上，且可觀察到膜外有少數突起物形成；增加胜肽濃度，孔洞數量增加，脂質體 內的物質流失現象明顯，且脂質體粒徑有縮小的趨勢；再提高胜肽濃度，脂質體
雙體進行穿膜動作後會將胜肽分配到脂雙層的內層，進而引起單體持續吸附在膜 上，且可觀察到膜外有少數突起物形成；增加胜肽濃度，孔洞數量增加，脂質體 內的物質流失現象明顯，且脂質體粒徑有縮小的趨勢；再提高胜肽濃度，脂質體