本研究主要目的是探討生物有效性體外試驗操作程序，並藉由試驗建 立系統品質管制基準，以作為評估廢棄物資源化之參考。以下分 4 節說 明本研究體外試驗方法、實驗設計、砷之 ICP-AES 測定法及數據統計分 析。
3-1 體外試驗程序與參數
在探討各種體外試驗參數後，生物有效性之胃腸體外試驗程序，如 第二章 2-6 節之圖 2-14 所示，該程序主要係參考 Rodriguze et al.（1999）
的二階段 IVG 及 IVG-AB 體外試驗程序，本試驗為簡化體外試驗程序，
將部份試驗參數與試驗程序修改，表 3-1 為本研究之試驗參數與文獻之比 較表，說明如下：
（1）樣品前處理：
樣品經風乾後，過篩取粒徑＜250 μm，以模擬可為手指沾染而誤食 者，樣品量 0.4~10 gm，液固比 10~5000 mL/gm，本研究建議使用 0.5 gm，液固比 1000：1。
（2）反應槽體：
本試驗之反應槽設計，改用密閉式 500 mL 血清瓶，可避免污染物 的逸散，另使用可調速之磁力攪拌及具載重環磁石，可有效控制攪 拌強度，同時將水浴溫控改採氣控溫控，以利試驗進行時觀察與採 樣，其反應槽體如圖 3-1 所示。
（3）胃相試驗：
本試驗使用胃相 pH 1.8，僅添加 NaCl 及 pepsin，反應 1 小時，但 不添加食物以模擬飢餓狀態。
（4）腸相試驗：
液固比 10-5000 mL/gm 1000 mL/gm 不添加食物模擬飢餓狀態
反應槽 150~600 mL 燒杯 500 mL 血清瓶 可避免污染物的逸散
同意使用 porcine pepsin (activity:800-2500 unit/mg)
1. porcine pancreatin: 4X, U.S.P.
2. bile extract:(CAS NO. 8008-63-7) 3. 簡化試驗程序
萃取時間 1~4 hr 1 hr 乳糜由噴門到迴盲瓣需 3~5 小時
因此，本研究體外試驗程序如圖 3-2 所示，為評估試驗結果之信賴性 平行於待測樣品另進行管制樣品分析，包括空白樣品、SRM 重複樣品與 Matrix SRM 重複樣品。
本研究所有試驗之藥品與試劑如下：
1. Na2HAsO4．7H2O：99.0%，試藥級（Showa）
2. 美國 NIST SRM 2710 Montana soil：粒徑<74μm，各元素全量 濃度認證值如下：
3. porcine pepsin：activity 800-2500 unit/mg（Sigma CAS NO.
9001-75-6）
4. porcine pancreatin：4X, U.S.P.（Sigma CAS NO. 8049-47-6）
5. bile extract porcine：（Sigma CAS NO. 8008-63-7）
6. NaCl：99.5%，試藥級（Showa）
7. HCl：35.0-37.0%，試藥級（Showa）
8. NaHCO3：99.5-100.3%，試藥級（Showa）
9. HNO3：69.5%，試藥級（Scharlau）
10. DI 水：>18Ω（Millipore Milli-Q plus）
11. 砷標準液：1000 ppm（Merck）
12. 砷混合標準溶液：100 ppm（Merck）
圖 3-1：本研究反應槽及氣體溫度控制室示意圖
圖 3-2：本研究二階段生物有效性體外試驗之試驗程序
反應 1 小時後，
以注射針收集 15 mL 胃液 反應槽設計 1. 使用 500 mL 血清瓶 2. 恆溫 37±0.5 ℃
3. 使用磁力攪拌( 350~2000 rpm ) 4. 隨時監測 pH 值、溫度、ORP
Phase II：Intestinal Phase Digestion 再加入豬的膽汁 1.75 gm 及
胰酵素 0.175 gm
備製飽和 NaHCO3溶液並將胃液 pH 值調至 5.5 做為小腸液 Phase I：Gastric Phase
備製 500 mL 胃液
( 0.15 M NaCl & 1 % porcine pepsin )
加入樣品 ( 500~2000 mL/gm )
以濃 HCl 溶液 調整 pH 至 1.8
離心(3500 rpm，15 min) 以0.45μm濾紙過濾
ICP-AES 分析砷 萃取液前處理及分析
反應 1 小時後，
以注射針收集 15 mL 小腸液
3-2 實驗設計
針對文獻中尚未深入探討之重要參數，本研究進行實驗設計進一步之 探討包括 4 個階段：Phase I 氧化還原電位（ORP）、Phase II 胃蠕動強度、
Phase III 液固比、Phase IIII 腸相萃取時間試驗與 Phase V 基質標準樣品之 品管試驗。
3-2-1 Phase I 氧化還原電位試驗
pH 值是影響體外試驗相當重要的因素（Ruby et al., 1993；1996），為 有效模擬人體胃腸環境，過去研究大致同意 pH 分別定為 1.8 與 5.5。但 亦有研究指出，在人體消化系統中，在不同的階段有不同的氧化還原電 位（oxidation reduction potential，ORP），分別為：胃是+150 mv、十二指 腸、空腸是-50 mv、迴腸是-150 mv、盲腸為-200 mv、直腸是-250 mv（光 岡知足，1978）。顯示物質由胃通往小腸傳輸時，ORP 值漸漸由正值轉變 為負值，即由氧化狀態轉變為還原狀態，導致污染物化學物種之變遷，
而改變其毒性，例如 As+5在還原態時會轉變成毒性較高之 As+3，ORP 似 乎為一項影響生物毒性之重要參數。但過去研究，並未重視此一參數，
本試驗監測整個體外試驗過程中之 ORP，並與文獻比較，以決定是否於 後續試驗中控制 ORP。
本試驗使用 1 L 具有 4 插孔之圓底玻璃反應瓶作為反應瓶組，以利反 應槽維持密閉，如圖 3-3 所示，並依圖 3-2 之生物有效性體外試驗程序進 行試驗，並將胃蠕動強度固定為 500rpm 以模擬胃蠕動強度，液固比比例 固定為 1000：1，於整個試驗過程中，持續量測 Na2HAsO4．7H2O 與 NIST 2710 soil 之 pH 值與 ORP。模擬胃蠕動之儀器採用 Corning 公司製型號 MP9I 之 九 基 座 多 點 磁 力 攪 拌 器 進 行 試 驗 ， 使 用 CES （ Challenge Environmental System）公司製造之具有載重環（SpinRing）磁石，大小 為 40 mm×9 mm，pH 之監測儀器採用 WTW 公司製綜合水質監測器
（Laboratory Mulit-Parameter Instruments），型號為 inoLab○R Level 3。本 款機型具有偵測酸鹼度（pH）、溶氧量（DO, mg/L）、電導度（Conductivity, μs/cm）的功能，本設備酸鹼度（pH）之偵測採用 glass electrode method，
準確度可達小數點下三位，誤差值為±0.003，氧化還原電位（ORP）採用 platinum electrode method，準確度可達小數點以下一位，誤差值為±0.2，
溫度（℃）可達小數點以下一位，誤差值為±0.1℃。
圖 3-3：測定氧化還原電位之反應槽示意圖
ORP 測棒 pH 測棒
磁力攪拌器 圓底反應槽
3-2-2 Phase II 蠕動強度試驗
生物有效性之體外試驗方法，在模擬胃的蠕動上，早期研究是以 wrist-action shaker 的方式模擬胃的蠕動（Davls et al., 1993），爾後改由分 液漏斗下方之孔隙通入氮氣（1 L/min），以模擬胃蠕動並控制厭氧條件
（Ruby et al.,1996）。最近則採用較簡單之機械攪拌（100 rpm），但仍輔 以氮氣曝氣（Rodriguez et al.,1999；Sarkar et al., 2003）。由於人體胃蠕動 方式由噴門下方沿著胃小彎處移動而終止於胃竇（趙有誠，1984），不易 正確模擬，且文獻中並無胃腸蠕動強度之相關數據，因此，本試驗擬探 討模擬胃蠕動強度對生物有效性之影響，使用 3 種不同蠕動強度之轉速 進行試驗，分別為 0、500 及 1000 rpm，液固比為 1000：1 mL/gm，以圖 3-2 體外試驗程序進行試驗，三種不同轉速測定之體外試驗過程如下圖所 示，在每一轉速的試驗過程中除了進行三組重複管制樣品（replicate control）外，還同時進行一組空白管制樣品（blank control）之測定，試 驗結束後分別量測並計算 Na2HAsO4．7H2O 及 NIST 2710 soil 之濃度並計 算其絕對生物有效性係數（ABF）與 CV 值。
圖 3-4：0 rpm 體外試驗測試 圖 3-5：500 rpm 體外試驗測試 (渦流深度約 1/4)
圖 3-6：1000 rpm 體外試驗測試 (渦流深度約 6/7)
此外文獻中也並未明確說明各種攪拌方式是否能夠正確評估胃腸之 蠕動，不僅如此，文獻中（Davls et al.,1992；Ruby et al., 1993；1996；
Hamel et al., 1998；Rodriguez et al., 1999；Sarkar et al.,2003）也僅使用 rpm 來表示反應槽體之蠕動強度，但 rpm 易受反應槽有效容積影響，因此攪 拌原理而言，使用一般評估反應槽攪拌強度之速度梯度（G）較為合理，
因此本研究擬採用通用之速度梯度來評估反應槽之攪拌強度，並嘗試將 過去文獻之攪拌轉速換算為 G，以探討 G 對包封度（encapsulation）高的 物質之生物有效性的影響。而速度梯度之公式如下(Cerra et al.,1979)：
V P dz
G du
(7)
其中，G 值係指於流體中，兩顆粒間單位距離（dz）之速度差（du），單 位為 1/sec， P 為功率，單位 W (N．m/s)；μ為黏度，單位 N．s/m2；V
為 反 應 槽 有 效 容 積 ， 單 位 m3， 又 本 研 究 依 據 CES （ Challenge Environmental System, INC.）公司使用 3 種不同種類之磁石進行瓶杯試驗 顯示，其中以 CES 公司製造，大小為 50 mm×10 mm 具有載重環磁石之 研究結果發現，此款磁石之功率 P 與 RPM 之關係式及 G 值與 RPM 之關 係圖如下（CES, 2002）：
P=1.03×10-7×RPM2.215803 (8)
Velocity Gradient as a Function of Stirring Rate 10
100 1000
10 100 1000
Stirring Rate, rpm
VelocityGradient(G),s-1
P&B, 1-L P&B, 2-L CES/JTA, 1-L
圖 3-7：RPM 與 G 值之轉係圖（CES. INC, 2002）
此關係圖係使用 CES 公司製大小為 50 mm×10 mm 具有載重環之磁石，
而本研究所使用之磁石規格為 CES 公司製大小為 40mm×9mm 具有載重 環之磁石，雖並非同一款磁石，但根據 Lai et al.（1975）研究顯示，功率 P 並不受磁石樣式影響，僅與磁石的投影面積 (A)有關，亦即功率 P 與磁 石的投影面積 (A)成正比，而 G 值與 (P)1/2成正比，因此可推估出 G 值 與(A)1/2成正比之關係，又本研究之反應槽有效容積為 0.5 L 與 CES 測試 之 1 L 不同，因此根據公式(7)可知 G 值與(1/V)1/2成正比關係。根據上述
探討可推算出本研究不同轉速對應之 G 值，如下表所示，於 500 rpm 對 應之 G 值為 470 sec-1，1000 rpm 對應之 G 值為 1006 sec-1。
表 3-2：本研究轉速與 G 值對照表
CES INC.,（2002） 本研究 磁石投射面積 50 mm×10 mm 40 mm×9 mm
有效容積 1 L 0.5 L
RPM (rpm) velocity gradient (G), sec-1
0 0 0
500 326 470
1000 698 1006
3-2-3 Phase III 液固比試驗
不同介質中目標污染物的溶解度為影響生物有效性之重要參數（Ruby et al., 1999），而溶解度與液固比有相關。理論上，未達飽和溶解度前，
液固比愈高溶解度愈高，而人體飢餓狀況會有較高液固比。但過去研究 較少探討即選用低液固比（10~150 mL/gm）（Davls et al., 1992；Ruby et al., 1993；1996；Rodriguez et al., 1999；Sarkar et al., 2003）。Hamel et al.（1998）
以美國 NIST 標準土壤（Montana SRM 2710）與 Jersey City 土壤探討液固 比影響，結果顯示液固比在 100：1~5000：1 mL/gm 時，鉻、鎘、鎳、鉛 之 ABF 影響不大，但對砷而言，Jersey City 土壤於高液固比似乎有較高 之 ABF。而 Rodriguez et al., 1999 探討麵糰（dough）的添加對砷的生物 有效性影響，以 slag 及 calcine 進行胃腸體外試驗。結果顯示在 slag 中，
食物的添加與否對砷 RBF 並無顯著差異；但在 calcine 中，添加麵糰（200 gm）提升砷 RBF 約 33~66%，但原因與機制仍不明確。
本試驗以不添加食物的飢餓狀態以便簡化體外試驗，為了探討液固比 對生物有效性之影響，本試驗使用 200:1、1000:1、5000:1 mL/gm 之液固
比進行試驗，不同液固比之備製量，分別如下表所示：
表 3-3：不同液固比之備製表
Liquid to solid ratio (mL/gm) 200:1 1000:1 5000:1
Volume (mL) 500 500 500
Na2HAsO4．7H2O (mg) 2.5 0.5 0.1 NIST 2710 soil (mg) 2.5 0.5 0.1
有效容積為 500 mL，添加 2.5 gm、0.5 gm 與 0.1 gm 的 Na2HAsO4． 7H2O 與 NIST 2710 soil 以分別備製不同液固比，依圖 3-3 之體外試驗程 序進行，蠕動強度為 470 sec-1(500 rpm)，進行三組重複管制樣品（replicate control）與一組空白管制樣品（blank control）之測定，試驗結束後分別 量測 Na2HAsO4．7H2O 與 NIST 2710 soil 之濃度並計算絕對生物有效性 係數與 CV 值。
3-2-4 Phase IIII 腸相萃取時間試驗
本研究彙整過去生物有效性體外試驗參數顯示，小腸相萃取時間較不 一致，如表 2-2 及第二章 2-6 小節中小腸相萃取時間之探討，因此本試驗 將探討小腸相萃取時間對 Na2HAsO4．7H2O 與 NIST 2710 soil 之總砷濃度 影響，依圖 3-3 之試驗程序進行，蠕動強度為 500 rpm，液固比為 1000:1 mL/gm，最大不同為小腸相之反應時間由 1 小時延長至 11 小時，並每隔 1 小時萃取樣品，以探討小腸相萃取時間對砷濃度之變化。
3-2-5 Phase V 基質標準樣品試驗
為了解體外試驗之可靠性，一般而言，試驗時應進行標準管制樣品
為了解體外試驗之可靠性，一般而言，試驗時應進行標準管制樣品