第一節 研究材料及研究設計
壹、動物實驗設計- 大白鼠創傷出血性休克模式
本實驗所採用出血性休克模型是使用固定血壓之出血性休克模型
（fixed-pressure hemorrhage），在第二組及第三組中，出血性休克 的誘發是以從左股動脈抽 60 分鐘血，在十分鐘內讓平均動脈壓下降至 40＋－5 毫米汞柱，並以抽血及輸血方式維持此血壓 60 分鐘。休克維 持以後，第二組不給予急救；而第三組則給予輸血及輸液急救（原抽 血量均被完全輸回，並加同一體積輸血量之林格氏液予以輸注），急救 應於十分鐘內完成。第一組除了接受剖腹、動靜脈插管及給予基本輸 液外，在實驗期間並不誘發出血休克及復甦急救。急救期後實驗物之 動靜脈插管給予拔除，並將血管結紮，令其甦醒。所有實驗動物至其 規劃實驗終了時間點時，均給予安樂死以進行抽血及取得肝臟組織。
一、實驗動物準備
本實驗研究的大白鼠（Sprague-Dawley rats）來自中華民國國家 科學委員會國家實驗動物繁殖及研究中心，實驗研究的大白鼠全部為 雄性。所有購入的動物先飼養於中國醫藥大學動物中心，室溫維持在 23℃，並保持固定光照週期（光-暗週期：各 12 小時），大白鼠飼養至 年齡 9-11 週大，體重約 300 公克，才進行實驗。大白鼠在實驗前不限
制日常飲食。實驗前三天實驗動物送至實驗室以適應實驗室的環境。
實驗前 15 分鐘穩定實驗動物生理狀況並以溫度控制器維持實驗動物 體溫（37℃＋－0.5℃）直至實驗完成。
二、麻醉方式
以腹膜內注射 Pentosol（25-40mg/kg），直到大白鼠被適當麻醉。
三、導管準備
以 Polyethylene tubes(PE-50）進行動靜脈插管，包括插入右股 靜脈以作為輸液輸注之用。另一 Polyethylene tubes(PE-50）導管插 入右股動脈並以 Cardiomax-Ⅱmodel 85(Columbus Instruments International Co.Ohio,USA)持續監測平均動脈壓。插入左股動脈以 作為抽血要成出血性休克及輸血急救之用。所有實驗動物在實驗中均 給予林格氏液輸注（10 毫升/公斤/小時），以補充體液喪失。
四、動物實驗步驟
步驟（Trauma/Hemorrhagic shock/Resuscitation）:
• 準備期（30分鐘）：包括剖腹手術（從恥骨到劍突沿腹中線切開
大白鼠腹部曝露腸部內臟後，立即將傷口縫合）、儀器準備及動 靜脈插管，完成以上步驟開始實驗計時。
• 穩定期（10分鐘）: 完成準備期後,將大白鼠靜置並監測其血壓 以穩定10分鐘生理徵象。
• 誘發出血性休克：10 分鐘內從大白鼠靜脈導管抽血(2.5 毫升/
公斤體重)，平均動脈壓維持在 40±5 毫米汞柱。
• 休克休克維持期（60分鐘）：藉抽血或將血回輸維持平均動脈壓 在40＋－5毫米汞柱;持續60分鐘。
• 復甦急救 (Resuscitation) 期：將抽出之血(2.5毫升/公斤體重)
加上靜脈輸液( lactated Ringer's solution) ( 5毫升/公斤體 重 ) 輸回實驗動物血管內。
• 恢復期: 移除導管、血管結紮、動物甦醒。
動物甦醒後依其預定時程在第 0, 1.5, 4, 8, 12, 24 小時予以安樂死 方式犧牲各次組大白鼠，並立即從死亡大白鼠以心臟穿刺方式取得血 液檢體並採集肝臟組織。恢復期期間若大白鼠死亡而接近預定時程，
立即以上述方式取得血液及肝臟組織以供研究。
貳 實驗設計 一、實驗動物分組
雄性大白鼠 Sprague-Dawley 鼠(體重 300-350 公克)隨機分為三組:
第一組：控制組（只施行剖腹手術，Sham operation）
第二組：出血性休克組（剖腹手術＋出血性休克）
第三組：復甦組（剖腹手術＋出血性休克＋輸血及輸液急救）
第二組及第三組大白鼠如前面所敘述施以創傷出血性休克。第二 組大白鼠在休克期維持 60 分鐘結束後不施以任何急救措施;定義為 休克組。第三組大白鼠在休克期維持 60 分鐘結束後則施以復甦液(以 出血抽出之全血加上林格氏液( lactated Ringer's solution) )急救;定義為 復甦組。第一組大白鼠則僅施行創傷剖腹手術;而不施以任何出血休克 或復甦液急救;定義為控制組。
所有大白鼠在恢復期拔除導管、甦醒後均將分別在次組預定時間 點(分別在實驗開始第 0， 1.5， 4， 8， 12 及 24 小時; 預定每次組 6 隻大白鼠)被麻醉犧牲;並取得血液、血清及肝臟組織;以進行實驗。
若大白鼠在實驗進行中死亡，則立即取得血液、血清及肝臟組織;以進 行實驗。
二、血清收集與儲存
在老鼠被犧牲後及採用心臟穿刺的方式收集全血。並以含 EDTA 之 試管收集血液並立即離心（速度：3000 轉/分，共 10 分鐘），將上清 液收集於抗凍離心管（1.5cc），在儲存於-70℃冰箱中直至實驗分析之 進行。
細胞激素 IL-6 及 IL-10 的血中活性以 ELISA 方式檢測，其操作方 式如製造廠商所附之使用說明書（R&D Systems,Inc,USA）
三、肝臟組織取得與貯存 1.肝臟組織取得步驟如下：
從恥骨到劍突沿腹中線切開老鼠腹部，切下肝臟中葉一體節（重量﹥1 公克），並在中葉近端以 3-0 絲線結紮血管止血。
2.將肝臟組織置入標本瓶並迅速置入液態氮鋼瓶中，再送至-70℃的冷 凍庫中冷藏直到實驗分析。
四、血中葡萄糖-六-磷酸去氫酶活性之分析
葡萄糖-六-磷酸去氫酶活性之分析如文獻所述30:以分光光度計在 波長340 nm 之下偵測Glucose-6-phosphate 被NADP+還原之程度來定 量其活性。 簡述如下: 全血檢體在攝氏4°C 下先經500x 3 g 離心10 分鐘。之後再將其置入1公撮萃取緩衝液中(20 mM Tris.HCl (pH 7.5)/
3 mM MgCl2/ 1 mM EDTA/ 0.02%(w/v)-mercaptoethanol/ 1 mM-ACA) 。 立即將之放入冰浴中並以聲裂法將之碎解。之後再以12,000x 3 g在攝 氏4°C 下離心10分鐘。經由上述程序處理之檢體(含50毫克蛋白質)與1 毫升之反應緩衝液(50 mM Tris.HCl (pH 8), 50 mM MgCl2, 4 mM NADP+, 4 mM glucose-6-phosphate ) 混合作用。再以分光光度計在波長340 nm 之下偵測其還原程度定量其活性。
五、細胞激素之分析
IL-6及IL-10的測量是採用商業用的成套試劑ELISA ( R＆D system )， 取100μl 血清和100μl 的分析稀釋液加入每個well 內 (R＆D system ELISA)，室溫培育兩個小時。以wash Buffer 洗去未結 合的物質，再加入抗欲測之細胞激素的多株抗體200μl( conjugated with Horseradish peroxidase )，於室溫培育兩個小時，以wash Buffer 洗去未結合的物質，再加入200μl substrate solution
[H2O2+tetramethylbenzidine mixture(1:1)]到每一個well 內，室溫 避光培育20 分鐘，最後加入50μl Stop solution ( 2N sulfuric acid ) 終止呈色反應。以光學比色計測定吸光值 ( OD450nm )，求得已知濃 度樣品之標準曲線，再定量待測物濃度。每個檢體測量兩次而分析時 的變異性小於10%。
六:利用高效能液相層析(High Performance Liquid Chromatography ) 技術測量還原型( GSH )與氧化型麩胱甘肽( GSSG )含量
HPLC 是一種利用物質在移動相(mobile phase)與固定相
(stationary phase)分佈性質不同之原理來分離物質的方法; 可以直 接利用 HPLC 來快速分析且具有高靈敏度偵測全血及組織中氧化型與 還原型麩胱甘肽的含量.
高效能液相層析-電化學偵測技術(High Performance Liquid
Chromatography-electrochemical detection)利用物質帶有
functional group,提供物質能量使其發生氧化還原反應而產生電子 流,可以偵測電子流並加以定量而得到物質之含量.
本實驗使用 ESA CoulArray HPLC-ECD sytem 來偵測全血中氧化 型(GSH)與還原型麩胱甘肽(GSSG)的含量.
六.一
A.高效能液相層析試劑(HPLC Reagent)
a. L-glutathione reduced form: Sigma G6529 b. Glutathione oxidized form: Sigma G4376 c. S-methylglutathione: Sigma 4139
B. 高效能液相層析(HPLC) a.HPLC-ECD:
Model 5600A CoulArray system/Model 542 Autosampler/Model 582 Pump
b.HPLC-UV detector
HPLC machine ( Water 2695 )/ UV detector ( Water 2487 ).
六.二
高效能液相層析(HPLC)試劑配製
a. 移動相溶液(mobile phase buffer)
取 1M Sodium phosphate (12g NaH2PO4 加水至 100ml) 10ml 加入 3mM octane sulfonic acid (0.070287g octane ulfonic acid 加 水至 100ml) 混合均勻,Sodium phosphate pH 值調整至 2.7 後再加 入 acetonitrile ( CAN ), 最後以 0.2um membrane filter 過濾, 抽真空去除其中之氣體,完成含 10mM phosphate、0.3mM octane sulfonic acid 、10% ACN、pH 2.7 之移動相溶液.
b. 5% meta-phosphoric acid
5g meta-phosphoric acid 溶於 100ml distilled water 後再次以 0.2um membrance filter 過濾.
c. GSH 及 GSSG 標準品 ( GSH 100mM; GSSG 100mM)
分別將 GSH 30.733mg/ml 及 GSSG 61.26mg/mlone32.125mg 標準品 加入 5% meta-phosphoric acid 中.
六.三
高效能液相層析實驗條件(HPLC experimental condition) a. Column: Intersil ODS-3, 5uM, 4.6*250mm.
b. Mobile phase:A:10mM NaH2PO4
0.3mM actane fulfonic acid pH2.7
B:10mM NaH2PO4
0.3mM octane sulfonic acid 10% ACN pH2.7
A:B 49%:51%
c. Column oven: 350C
d. Injection volumn: 20λ
e. Running time: std. 20min. sample 30min.
f. Flow rate:1.0 mL/min.
g. UV detection: 200nm.
六.四
高效能液相層析(HPLC)檢體處理 a. 全血檢體:
將全血檢體 100ul 於褐色管中加入 5% meta-phosphoric acid 300ul 並混合均勻,置入冰浴中 15-30 分鐘;之後將其取出離心
(13000rpm,40C,10min.); 離心後取其上清液;利用 filter ( 0.2um ) 過濾雜質後上機(HPLC-ECD).
b. 肝臟組織
將肝臟組織 0.2g 加入 9 倍體積的 Tris buffer 後進行組織均質 研磨,取均質後之 liver suspension 200ul 加入 5%
meta-phosphoric acid 200ul 並混合均勻,置入冰浴中 15-30 分鐘;
之後將其取出離心(13000rpm,40C, 10min.); 離心後取其上清液;
利用 filter ( 0.2um )過濾雜質後上機(HPLC-UV detector).
七:利用西方點墨法 (Western blot) 定量肝臟葡萄糖-六-磷酸去氫酶 七.一:西方點墨法 (Western blot)
1. 電泳分離與轉漬
將 待 分 析 之 肝 臟 組 織 樣 品 以 12% SDS-PAGE 進 行 電 泳 分 離 (Amersham Bioscience SE 250 Mini-format Vertical Gel Electrophoresis Units) 。 在 電 泳 結 束 前 20 分 鐘 ， 需 先 準 備 Hybond-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (Amersham Bioscience) 及 4 張 3 MM 濾紙 (Whatman)，而 PVDF membrane 需 先以 100% 甲醇浸泡約 10 秒鐘後，再以去離子水洗去膜上的甲醇，
由於 PVDF membrane 具有很強的蛋白質結合力，因此操作時必須戴手 套，以防止非專一性蛋白質的污染，之後將其浸泡於 Transfer buffer (25 mM Tris-HCl，0.2 M Glycine，20% methanol) 中，而 3 MM 濾 紙也同樣浸泡於 Transfer buffer。將電泳分離後之膠體與 PVDF membrane 一同放入轉漬的卡夾中，上下各夾兩張 3 MM 濾紙及海綿，
以三明治方式夾起，置於轉漬裝置 (Amersham Bioscience TE 22 Mighty SmallTM Tank Transfer Unit) 中 ， 於 300 mA 電 流 下 (Amersham Bioscience Electrophoresis Power Supply EPS601) 進
行轉漬 1 小時。
2. 偵測
將轉漬後之 PVDF membrane 浸於含 5% blocking reagent 之 TBST (20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，0.1% Tween-20，pH 7.6) buffer 中，室溫下低速振盪 1 小時，之後用 TBST 清洗 PVDF membrane，於 室 溫 下 低 速 振 盪 清 洗 2 次 ， 每 次 5 分 鐘 。 清 洗 完 畢 後 將 PVDF membrane 浸泡於 3000 倍稀釋的一級抗體 G6PD Antibody 中，室溫 下低速振盪 1 小時，再以 TBST 清洗 PVDF membrane，於室溫下低速 振盪清洗二次，每次 5 分鐘。清洗完畢後將 PVDF membrane 浸泡於 2000 倍稀釋的二級抗體 (Anti-Mouse IgG HRP Conjugate) 中，室溫 下低速振盪 1 小時，之後再以 TBST 清洗 PVDF membrane，於室溫下 低速振盪清洗一次 15 分鐘後，再清洗三次，每次 5 分鐘。最後再將 PVDF membrane 放 置 於 ECL plus detection reagents (Amersham Bioscience) 中 1 分鐘，取出 PVDF membrane 置於塑膠袋中，將氣 泡趕走後壓片，1 ~ 30 分鐘後沖片。
第二節 統計方法
各組之間的比較是使用 one-way analysis of variance (ANOVA) 統計方式分析。所有的數據均以平均值＋－標準差(Means+SD)表示。P 值＜0.05 即表示有統計學上的意義。以上統計均使用市售軟體 SPSS 第十版在電腦上執行。