第三章、 材料與方法
二、 研究方法
每名研究對象抽取 6ml 全血，其中 3ml 置於 EDTA 試管中作為抽 取 DNA 及分析基因型用，另外 3ml置於 Heparin 試管中作為分析 DPC 用。DPC 值測定均於採樣三天內完成細胞計數。
（1） DNA 萃取
將含 EDTA 之試管內的末稍血液離心 1,300rpm 10 分鐘，取出白血 球 0.5ml 。 加入 1.5ml 1X RBC lysis buffer，置於冰上 15 分鐘。離心 2,000rpm 10min，去除上清液後，加入 1 ml GenoMaker reagent。在室 溫下靜置 5 分鐘。之後加入 0.5ml chloroform，離心 12,000rpm，4℃，
5 分鐘。取出上清液放入新的 1.5ml 微量離心管內，加入 0.5ml isopropanol，在 4℃下以 6,000rpm，離心 2 分鐘，移除上清液，加入 1ml 70% ethanol，以 6,000rpm，離心 2 分鐘，除去上清液，此步驟再 重複一次。再移除上清液，DNA 溶於 100ul TE buffer。置於－20℃冰 存。
（2） 基因型檢定
以 聚 合 鏈 鎖 反 應 （ PCR ） 及 限 制 片 段 長 度 多 型 性 分 析
（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism ）
（PCR-RFLP）。分析 GSTM1 、 GSTT1 、 CYP1A1 與 NAT2 四種 基因型。四種基因型所用的引子序列顯示於表 1。
表1 各基因型之引子(primer)序列
基因型 引子序列
CYP1A1（1）（56） 5'- TCACTCGTCTAAATACTCACCCTG -3' 5'- TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT -3' CYP1A1（2）（56） 5'- CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT -3'
5'- GAGGCAGGTGGATCACTTGAGCTC -3' GSTM1（27） 5'- CTGCCCTACTTGATTGATGGG -3'
5'- CTGGATTGTAGCAGATCATGC -3' GSTT1（27） 5'- TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC -3'
5'- TCTCCGGATCATGGCCAGCA -3' β-globin（27） 5'- ACACAACTGTGTTCACTAGC -3' 5'- CAACTTCATCCACGTTCACC -3' NAT2（50） 5'- TCTAGCATGAATCACTCTGC -3'
5'- GGAACAAATTGGACTTGG -3'
CYP1A1 使用 nested-PCR 法，CYP1A1（1） 為第一次 PCR 所使用之引子序列，
CYP1A1（2）為第二次 PCR 所使用之引子序列，NAT2 則使用三種酵素判別基 因型。β-globin 作為內標（internal control）
使用 PCR-RFLP 法分析 CYP1A1 基因型。取出從白血球中萃取 的 DNA 1ìg，加入增幅所需的引子【表 1】、Tag 聚合 （Tag polymerase）、去氧核甘三磷酸（dNTP）、聚合 緩衝溶液與蒸餾水共 50ìl。反應條件為 95℃、4 分鐘使雙股 DNA 變性，其次以 94℃、 25 秒；60℃、 25 秒；72℃、 25 秒的條件循環反應 35 次，最後設定 72℃、6 分鐘使產物反應更完全。
第二次 PCR 反應條件為 95℃、4 分鐘作為預變性（prenatural）；
94℃、25 秒；66℃、 25 秒；72℃、 25 秒的條件循環反應 35 次，
制 切割點，故電泳結果只有一個 DNA 片段，其長度為 295bp。若
M：Marker；1：第一次 PCR 產物，413bp；2：CYP1A1MspI 野生/野生型，
295bp；3：CYP1A1MspI 變異/野生型，295bp、160bp、135bp；4、5：CYP1A1MspI 變異/變異型，160bp、135bp
GSTM1 及 GSTT1 基因型是以聚合 鏈鎖反應分析。由白血球中 萃取的 DNA 1ìg，加入增幅所須之引子【表 1】、Tag 聚合 （Tag polymerase）、去氧核甘三磷酸（dNTP）、聚合 緩衝溶液與蒸餾水共 50ìl。反應條件為 95℃、4 分鐘使雙股 DNA 變性，其次以 94℃、1 分鐘；63℃、1 分鐘；72℃、1 分鐘的條件循環反應 30 次，最後設定 72℃、6 分鐘使產物反應完全。GSTM1 與 GSTT1 可同時進行反應，
並以β-globin 作為內標（internal control）幫助判斷聚合 鏈鎖反應
bp
是否良好，不論樣本是否帶有完整之 GSTM1 或 GSTT1 基因，均會
M：Marker；1：GSTM1、GSTT1 均為無效型；2：GSTM1 為非無效型（273bp）， GSTT1 為無效型；3：GSTM1 為無效型，GSTT1 為非無效型（480bp）；4、5：
GSTM1 為非無效型（273bp）、GSTT1 為非無效型（480bp）。每個樣本都應產生 β-globin（100bp）。
NAT2 基因型是使用限制片段長度多型性 （PCR-RFLP）檢測。
將 DNA 1ìg，加入增幅所須之引子【表 1】、Tag 聚合 （Tag polymerase）、去氧核甘三磷酸（dNTP）、聚合 緩衝溶液與蒸餾水共
bp
50ìl。反應條件為 95℃、4 分鐘使雙股 DNA 變性，其次以 94℃、1 分鐘；52℃、1 分鐘；72℃、1 分鐘的條件循環反應 30 次，最後設定 72℃、6 分鐘。使產物反應更完全。
在 PCR 產物內分別加入 Kpn I、Taq I與 BamHI 限制 、限制 反應液及蒸餾水總共 20ìl。各以 37℃、65℃、30℃置於水浴槽內 3 小時，使反應更完全。再以 3 % agarose gel 進行電泳分析。NAT2 野 生型為 NAT2*4，同質合子之野生型（wild-type）兩條對偶基因都可 被三種限制 作用。
Kpn I 型為 NAT2*5 （M1 allele），在 C481T 產生取代，若樣本 為帶有一個變異型（variant）的異質合子 ，則只有一個對偶基因含 Kpn I 限制 切割點，因此應同時出現 1093bp、659bp 與 443bp 三個 DNA 片段，若樣本屬於同質合子之變異型（variant），兩個對偶基因 均無 Kpn I 限制 切割點，故只有一段較長的 1093 bp DNA 片段。
Taq I 型為 NAT2*6 （M2 allele），在 G590A 產生取代，若樣本 為帶有一個變異型（variant）的異質合子，會同時出現 395bp、381bp、
326bp、226bp 與 169bp 五個 DNA 片段，若樣本屬於變異型（ variant）
的同質合子，則會出現 395bp、381bp 與 326bp 三個 DNA 片段。
BamHI 型為 NAT2*7 （M3 allele），在 G857A 產生取代，若樣本 為帶有一個變異型（variant）的異質合子 ，則只有一個對偶基因有 BamHI 限制 切割點，因此應同時出現 1092bp、819bp 與 283 bp 三 個 DNA 片段，若樣本屬於變異型（variant）的同質合子因兩個對偶
基因無 BamHI 限制 切割點，只有一段較長的 1092bp DNA 片段。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
M：Marker；1：Taq I 野生/野生型，381 bp、326 bp、226 bp、169 bp；2：
Taq I 野生/變異型，395 bp、381 bp、326 bp、226 bp、169 bp；3：Taq I 變異/變 異型，395 bp、381 bp、326 bp、4：Kpn I 野生/野生型，659 bp、443 bp；5：Kpn I 野生/變異型，1093 bp、659 bp、443 bp；6、10：Kpn I 變異/變異型，1093 bp；
7：BamHI 野生/野生型，819 bp、283 bp；8：BamHI 野生/變異型，1092 bp、819bp、
283 bp；9、11：BamHI 變異/變異型，1092 bp
如果 NAT2 兩條對偶基因均為野生型或只有一條對偶基因為變異 型，則歸類為 NAT2 快型，若兩條對偶基因均為變異型，歸類為慢型。
乳癌患者與健康對照組的 NAT2 基因型分佈顯示於表二。
bp 2000 1500 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
（3） DNA-Protein Crosslinks
以細胞分離液（Histopaque）分離單核球細胞，使用磷酸緩衝液 清洗細胞後，每個樣本計數 2x106 個細胞加入 0.5ml【0.5% sodium dodecyl sulfate （SDS）及 20mM Tris-HCI（PH=7.5）】溶液，冰存於
－70℃，直到分析為止。
使用前需解凍，用 22 號針頭抽吸 4 次，以機械性方式使 DNA 成 為片斷，再加入 0.5ml【100mM KCl，20mM Tris （PH=7.5）】溶液，
放入乾浴器（Dry Bath） 65°C，10 分鐘、取出置於冰上 5 分鐘，之 後離心 6,000rpm， 4°C ，5 分鐘。捨去上清液後，，加入 1ml【100mM KCl，20mM Tris （PH=7.5）】溶液，再次加熱 65°C，10 分鐘，置於 冰上 5 分鐘，離心 6,000rpm， 4°C，重複兩次。以化學性方法促進 K-SDS 形成，並利用離心分離出有結合蛋白質的 DNA 及游離的 DNA。加入 0.2 mg/ml proteinase K 於 0.5ml【100mM KCL，20mM Tris-HCI (PH=7.5) 及 10mM EDTA】溶液，放入 50℃水浴槽加熱，反 應 3 小時。再加入 0.5 ml 4mg/ml bovine serum albumin （BSA），在 4°C 以 12,000rpm 離心 10 分鐘。
使用核酸濃度測定儀（DyNA Quant 200 Fluorometer）進行分析。
以 Hoechst 33258 螢光劑配置溶液，先加入 1ìg/ml Calf Thymus DNA 作為 DNA 標準品進行校正。再放入定量樣本以測得正確的數值。將 測得結果除以 2x106個細胞的 DNA 總量，即為 DPC 值 （%）。
公式：
DPC % =DNA-Protein crosslinks /DNA 總量 （%）