本研究目的為針對受砷污染土壤，探討各試驗參數對生物有效性之影 響，並參考試驗結果建立系統品管基準，進而研擬我國生物有效性體外 試驗標準方法。以下分四節說明本研究體外試驗程序與試驗參數、實驗 設計、ICP-MS 儀器分析方法及數據資料整理與統計方法。
3-1 體外試驗程序與試驗參數
本研究生物有效性體外試驗程序，主要參考前期研究 (張，2005)與 Ruby et al. (1996)PBET 體外試驗方法，此方法為簡化美國 EPA Region VIII 建議污染場址復育風險評估之生物有效性體外試驗方法，本研究進而簡 化與修改該體外試驗程序，其說明如Table 3-1 所示。分項說明如下：
(1) 樣品前處理部份：
樣品經風乾後，過篩取粒徑小於 250 μm，以模擬可被手指沾染而誤 食之粒徑大小，樣品量取0.4 - 10 gm，依據液固比 10:1 - 5000:1 mL/gm 比例進行樣品量選取，本研究建議使用樣品量 0.5 gm，液固比 1000:1 mL/gm。
(2) 反應槽體設計部份：
本試驗將開放式反應槽改為密閉式 500 mL 血清瓶，可避免污染物逸 散，並使用可調速磁力攪拌及具載重環磁石，取代昂貴之氬氣攪拌，
可有效控制攪拌強度，同時將水浴溫控改採氣控式溫控方式，以利試 驗過程中觀察與採樣，如 Figure 3-1 所示。
(3) 胃相試驗部分：
本試驗使用胃相 pH 1.8±0.1，以模擬空腹狀態時較低之 pH 值，僅添 加 0.15 M NaCl 及 pepsin。Ruby et al. (1996)研究，提及人體於反應時 間 1 小時可消化 80 - 90 %的食物，因此本研究將胃相反應時間設定 為 1 小時。而且不添加食物以模擬空腹飢餓狀態。
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(4) 小腸相試驗部分：
本試驗參考 PBET 試驗方法且為符合人體小腸相之生理條件下，採用 小腸相 pH 7.0±0.1，僅添加 pancreatin 及 bile，反應時間為 1 小時。
由於近幾年體外試驗研究中，已不再使用吸附劑模擬小腸相吸收作 用，因此本研究不使用吸附劑，以簡化試驗程序。
(5) 萃取液前處理試驗部分：
本試驗使用 3500 rpm 離心，不使用 0.45 μm 進行過濾，由於經離心 後之樣品上澄液已無懸浮微粒，因此僅利用離心取代壓阻較高的傳統 過濾方式。
綜合上述說明，本研究生物有效性體外試驗程序修改如Figure 3-2 所 示，第一階段用以模擬胃的消化 (gastric phase)，添加 0.15 M NaCl 及 1 % porcine pepsin 製備胃液，以濃 HCl 溶液調整至 pH 1.8±0.1，反應 1 小時 後，取胃相之萃取液經離心去除粒狀物後，以ICP-MS 分析總砷濃度。接 著進入第二階段為模擬小腸環境 (intestinal phase)，添加 pancreatin 及 bile，並以飽和 NaHCO3溶液調整至pH 7.0±0.1 作為小腸液，反應 1 小時 後，取小腸相萃取液經相同程序去除粒狀物後，以ICP-MS 分析總砷濃度。
Figure 3-1 本研究體外試驗反應槽體設備
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(activity:800-2500 unit/mg) 液固比 10:1 ~5000:1 mL/gm 1000:1 mL/gm 不添加食物以模擬空腹飢餓狀
態
萃取時間 1 hr 同意使用 可消化80 - 90 %的食物
小腸相
pH 5.5 及 7.0 7.0±0.1 以飽和NaHCO3溶液調整pH
小腸液 pancreatin 及 bile 同意使用 1. porcine pancreatin: 4X,U.S.P.
2. bile extract:CAS NO. 8008- 63-7
吸附劑 使用iron hydroxide gel 或strip-coated ferric ox-ide 以模擬小腸吸收作用
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Figure 3-2 本研究二階段胃腸相生物有效性體外試驗程序 PhPhaasese II :: GGaaststrriicc PPhhaasese
反應反應槽槽設設計計 1.1. 使用使用505000 mmLL血清血清瓶瓶 2.2. 恆溫恆溫3737±±00..55 00C C 3
3.. 使用使用磁磁力力攪攪拌拌(( 00~~11000000 rrppmm )) 4.4. 隨時隨時監監測測pHpH值、值、溫溫度度
分
分別別收收集集115 5 mmLL 胃液胃液和和小小腸腸液液
PhPhaasese IIII :: InIntteessttiinnaall PPhhaassee 再加再加入入豬豬膽膽汁汁11.7.75 5 ggmm以以及及
胰酵胰酵素素00.1.17755 ggmm
反應反應 11小時小時
備製備製飽飽和和NaNaHHCOCO33溶液溶液，，將將胃胃液液 調至調至pHpH 77..00±0±0.1.1 作為作為小小腸腸液液
離心離心 ( ( 33550000 rrppmm，1，155 mmiinn ))
ICICPP--MMSS 分析分析總總砷砷濃濃度度 備製備製有有效效容容積積550000 mmLL 胃液胃液
(含有 0.15 M NaCl & 1% porcine pepsin)
加入加入樣樣品品
(依液固比 200:1 ~5000:1 mL/gm) 以濃以濃HHClCl 溶液溶液調調整整ppHH值至值至11.8.8±±0.0.11
反應反應11小時小時
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3-2 生物有效性體外試驗藥劑與設備
本研究進行生物有效性體外試驗所需藥品、試劑與設備分別如下說明：
1. Na2HAsO4．7H2O：99.0 %，試藥級 (Showa)。
2. 美國 NIST SRM 2710 Montana soil：粒徑 < 74 μm，砷元素全量濃度 為 626±38 (mg/kg)，全量濃度認證如附錄二所示。
3. porcine pepsin：activity 800-2500 unit/mg (Sigma CAS NO. 9001-75-6)。
4. porcine pancreatin：4X, U.S.P. (Sigma CAS NO. 8049-47-6)。
5. bile extract porcine：(Sigma CAS NO. 8008-63-7)。
6. NaCl：99.5 %，試藥級 (Showa)。
7. HCl：35.0 - 37.0 %，試藥級 (Showa)。
8. NaHCO3：99.5 - 100.3 %，試藥級 (Showa)。
9. HNO3：69.5 %，試藥級 (Showa)。
10. DI 水：電阻 > 18Ω (Millipore Milli-Q plus)。
11. 砷標準液：1000 ppm (Merck)。
12. 離心機：15 mL × 16 pcs, Speed: 4,500 rpm, RCF:3,350 ×g (HSIANGAI/
CN-5100+RS-50 轉盤)。
13. 多點磁力攪拌器：9 點，轉速範圍為 350 - 2000 rpm (Corning, USA/
MP9I)。
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3-3 生物有效性體外試驗之實驗設計
本研究係參考前期研究 (張，2005)所建立之體外試驗程序，如 Figure 3-2 所示，進一步針對文獻中尚未深入探討之重要參數，探討體外試驗之 各參數對生物有效性之影響。其實驗設部分，包括蠕動強度 (phase I)、
液固比 (phase II)、小腸相萃取時間 (phase III)、萃取液樣品前處理方式 (phase IV)，每一個試驗階段 (phase)，內有三種不同參數試驗，每種參數 試驗除進行六組重複管制樣品 (replication control)外，同時進行一組空白 管制樣品 (blank control)測定，其各試驗階段分述如下：
3-3-1 蠕動強度試驗 (Phase I)
在模擬胃腸蠕動方面，體外試驗較不易正確模擬，而文獻中對於胃腸 蠕動方式不盡相同，有機械式攪拌或通氣攪拌等方式如Table 2-4 至 Table 2-6 所示，且文獻中也尚未針對胃腸蠕動強度有進一步研究，鑒於此，本 試驗使用三種不同蠕動強度進行試驗分別為0、500 及 1000 rpm，，以探 討不同蠕動強度對生物有效性之影響，並固定液固比為1000:1 mL/gm，
以Figure 3-2 二階段胃腸相生物有效性體外試驗程序進行試驗。
此外，根據前期研究 (張，2005)對於胃腸之蠕動方式進行深入探討 發現，文獻中 (Davls et al., 1992; Ruby et al., 1993, 1996; Hamel et al., 1998;
Rodriguez et al., 1999; Sarkar et al., 2003)未明確說明胃腸之攪拌方式是否 能正確評估胃腸蠕動情況，僅使用轉速 (rpm)來表示反應槽體之蠕動強 度，本研究也可從近幾年體外試驗文獻中 (Schroder et al., 2004; Pouschat et al., 2006; Lee et al., 2006; Wang et al., 2006; Juhasz et al., 2007b; Smith et al., 2008)發現此結果，但 rpm 易受反應槽有效容積體影響，因此建議就 攪拌原理而言，使用一般評估反應槽體攪拌強度之速度梯度 (G 值，單位 為sec-1)表示較為合理。係參考前期研究將 rpm 經由公式推算 G 值，以探 討包封度高的土壤物質，於不同 G 值中對生物有效性的影響，推算公式
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分述如下說明。
速度梯度公式 (6) (Cerra et al., 1979)：
V P dz
G du
= μ
= (6) 其中，G 值指在流體中，兩顆粒間單位距離 (dz)之速度差 (du)，單 位sec-1，P 為功率，單位 W (N．m/s)；μ 為黏度，單位 N．s/m2；V 為反 應槽有效容積，單位m3。
另前期研究根據 CES (Challenge Environmental System, INC.)公司使 用三種不同種類之磁石進行瓶杯試驗，其中CES 公司製造大小為 50 mm×
10 mm 具有載重環磁石之研究發現，此款磁石之 P 與 rpm 之公式以及 G 值與rpm 之關係圖 (CES, 2002)，如 Figure 3-3 所示。
P =1.03×10-7×rpm2.215803 (7)
Velocity Gradient as a Function of Stirring Rate 10
100 1000
10 100 1000
Stirring Rate, rpm
Velocity Gradient (G), s-1
P&B, 1-L P&B, 2-L CES/JTA, 1-L
Figure 3-3 rpm 與 G 值之關係圖 (CES, 2002)
另本研究使用之磁石為CES 公司所製造大小為 40 mm× 9 mm 具有載 重環磁石，但其大小與CES 公司進行瓶杯試驗所得之 Figure3-3 所使用之 具有載重環之磁石大小不同為50 mm× 10 mm。又根據 Lai et al. (1975)研
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究提及，P 並不受磁石樣式影響，與磁石的投影面積 (A)有關，即 P 與 A 成正比關係，而由公式 (6)可知，G 值與 (P)1/2成正比，因此推導G 值與 (A)1/2成正比，又因本研究所使用之有效容積為 0.5 L 與 CES 進行瓶杯試 驗之有效容積為1L 不同，但可由公式 (6)得知，G 值與 (1/V)1/2成正比，
最後由上述公式可推導不同轉速對應之G 值，如 Table 3-2 所示。
Table 3-2 本研究轉速 (rpm)與 G 值對應表
CES INC. (2002) 本研究 磁石投射面積 (A) 50 mm×10 mm 40 mm×9 mm 有效容積 (V) 1 L 0.5 L 轉速 (rpm) velocity gradient (G), sec-1
0 0 0
500 326 470
1000 698 1006
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3-3-2 液固比試驗 (Phase II)
文獻中提及，於不同介質中目標污染物的溶解度是影響生物有效性之 重要參數，而溶解度與液固比有關 (Ruby et al., 1999)。理論上，當未達 到飽和溶解度前，於相同的有效體積下，液固比越高溶解度越高。正常 人每天胃液分泌量大約為 1500 mL，而人體產生飢餓空腹 (fasting)狀態 時，迷走神經會促使胃液分泌 (李，1991)，可能會產生較高的液固比。
本試驗為簡化體外試驗程序，以不添加食物的飢餓狀態來模擬，液固 比選取則參考Hamel et al. (1998)學者設定之液固比範圍，擬使用三種不 同液固比進行試驗，分別為200:1、1000:1 及 5000:1 mL/gm，反應槽有 效體積為500 mL，依液固比比例計算所需之樣品量，如 Table 3-3 所示，
於Phase II 試驗中，固定蠕動強度 G 值為 470 sec-1 (500 rpm)，以模擬胃 相蠕動情況，探討不同液固比對生物有效性之影響。
Table 3-3 三種不同液固比之備製劑量表
Liquid to solid ratio (mL/gm) 200 :1 1000 :1 5000 :1
有效體積 (mL) 500 500 500
Na2HAsO4．7H2O (mg) 2.5 0.5 0.1 NIST 2710 soil (mg) 2.5 0.5 0.1
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3-3-3 小腸相萃取時間試驗 (Phase III)
本研究彙整 1992 年至今生物有效性體外試驗參數發現，各研究學者 對於小腸相萃取時間並不一致，範圍介於1-4 小時，如 Table 3-1 所示，
因此本試驗探討小腸相萃取時間對 Na2HAsO4．7H2O 與 NIST 2710 soil 總砷濃度之影響，依Figure 3-2 試驗程序進行，蠕動強度 G 值為 470 sec-1 (500 rpm)，液固比為 1000:1 mL/gm，小腸相反應時間由 1 小時延長至 11 小時，每隔1 小時採樣一次，共 11 點，並繪製濃度與時間之趨勢變化圖。
3-3-4 樣品萃取液前處理試驗 (Phase IV)
本研究依據環檢所公告之 ICP-MS 分析方法 (NIEA W313.50C)，樣品 於採樣後須經 0.45 μm 孔徑濾膜過濾，以去除懸浮粒，再以硝酸溶液酸 化水樣至pH 值≦ 2，方能保存六個月，Figure 3-3 為本研究進行萃取液 過濾方法示意圖，A 為 20 mL 針筒、B 為內裝置胃相或小腸相之萃取液、
C 為 0.45 μm 飛碟濾頭、D 為 15 mL 離心管。本研究不進行酸化前處理 步驟，以避免破壞胃相與小腸相本身酸鹼值。再者，使用0.45 μm 孔徑濾 膜過濾，再擠壓過程會產生較高的壓阻而不利擠壓，需耗費較大力氣方 能過濾完畢，因此，本研究探討離心再過濾與僅離心兩種不同前處理方 式對總砷濃度的關係，以簡化萃取液前處理之步驟，依Figure 3-4 試驗程 序進行，蠕動強度G 值為 470 sec-1 (500 rpm)，液固比為 1000:1 mL/gm。
Figure 3-4 樣品萃取液過濾方法結構示意圖
A B C D
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3-3-5 建立系統品管基準 (PhaseV)
本研究為了解各體外試驗之信賴度，建議試驗過程中應進行標準管制 樣品 (control sample)之平行測定。綜觀過去學者進行體外試驗方法，由 於各試驗程序與參數條件不盡相同，且多數試驗並未進行各種管制樣品 平行的測定，導致無法評比不同試驗結果之萃取效率，鑒於此，本研究
本研究為了解各體外試驗之信賴度，建議試驗過程中應進行標準管制 樣品 (control sample)之平行測定。綜觀過去學者進行體外試驗方法，由 於各試驗程序與參數條件不盡相同，且多數試驗並未進行各種管制樣品 平行的測定，導致無法評比不同試驗結果之萃取效率，鑒於此，本研究