本研究剖析文獻並參考前期研究成果 (張，2005)，研究目的為以受 砷污染土壤為例，研擬我國生物有效性體外試驗標準方法。本研究延續 前期進一步探討下列四點問題：
1. 前期研究採用 IVG 體外試驗 (Rodriguze et al., 1999)之小腸相 pH 5.5，本研究採用 PBET 體外試驗 (Ruby et al., 1996)之小腸相 pH 7.0，
較高之pH 值會降低砷之溶解度，故砷 ABF 與 RBF 也會相對降低。
2. 前期研究將胃相與小腸相之萃取液進行離心 (3500 rpm, 15 min)再過 濾 (0.45 μm 飛碟濾頭)之前處理，此過濾方式相當費力且耗時，本研 究則將簡化為僅進行離心處理 (3500 rpm, 15 min)。
3. 前期研究砷之檢測採用 ICP-AES (Inductively Coupled Plasma- Atomic Emission Spectrometry)，方法偵測極限值為 0.04 mg/L，本研究則使用 ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-mass Spectrometry)，方法偵測極 限為0.91 μg/L，其值約為 ICP-AES 之 1/44，較容易檢測試劑空白樣 品是否遭受污染，但因本研究萃取液為高濃度，需提高稀釋倍數，可 能因背景誤差傳遞，高估樣品濃度。
4. 前期研究於樣品管制上進行三重複樣品試驗，本研究使用六重複樣品 試驗，剔除極端值 (outlier)後再進行統計分析。
以下針對本研究之試驗結果，分述其結論與建議如下：
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5-1 蠕動強度試驗
1. 本研究探討樣品 Na2HAsO4．7H2O 與標準土壤樣品 NIST 2710 soil 於 不同速度梯度，G 值分別為 0、470 與 1006 sec-1對生物有效性之影響，
結果如下：
(1) 樣品 Na2HAsO4．7H2O，在胃相中不同 G 值對 ABF 無顯著性差 (ABFG=86 %、82 %與 91 %, p=0.21)；在小腸相中，不同 G 值對 ABF 也無顯著性差異(ABFI=86 %、85 %與 94 %, p=0.10)，因 Na2HAsO4． 7H2O 溶解度 (5.46 gm/100 mL at 0 oC)高於本試驗濃度，溶解度大且 包封度較低，所以不論在pH 較低之胃相或 pH 較高之小腸相，不同 G 值對 ABF 均無顯著性影響。
(2) 標準土壤樣品 NIST 2710 soil，在胃相與小腸相中不同 G 值對 ABF 皆無顯著性差異 (ABFG= 22 %、28 %與 31 %, p=0.54；ABFI=25 %、
24 %與 26 %, p=0.72)。
(3) 在不同蠕動強度試驗中，對有包封度之 NIST 2710 soil 砷 RBFG平均 值分別為26 %、35 %與 34 %，砷 RBFI平均值分別為29 %、28 % 與 27 %。且在胃相與小腸相中不同 G 值對 RBF 皆無顯著性差異 (P=0.054 vs. 0.607)。
2. 在不同蠕動強度試驗中，對有包封度之 NIST 2710 soil，胃相中 ABFG 與RBFG均較小腸相ABFG與RBFI高，且本研究體外試驗結果之胃與 腸相RBF 均低估動物試驗 RBF 文獻值。
3. 綜合上述可知，蠕動強度試驗條件似乎不是一個重要的試驗參數，本 研究建議使用一個中間的G 值為 470 sec-1 (500 rpm)。
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5-2 液固比試驗
1. 本研究探討樣品 Na2HAsO4．7H2O 與標準土壤樣品 NIST 2710 soil 於 不同液固比，分別為200:1、1000:1 與 5000:1 mL/gm 對生物有效性之 影響，結果如下：
(1) 樣品 Na2HAsO4．7H2O，在胃與小腸相中不同液固比對 ABF 均無顯 性差 (ABFG=96 %、87 %與 101 %, p=0.07；ABFI=85 %、86 %與 93
%, p=0.06)，可能原因為 Na2HAsO4．7H2O 溶解度(5.46 gm/100 mL at 0 oC)高於本試驗濃度，溶解度大且包封度較低，使液固比對 ABF 影 響變小。
(2) 標準土壤樣品 NIST 2710 soil，在胃相中不同液固比對 ABF 無顯著 性差異 (ABFG= 28 %、29 %與 30 %, p=0.06)，在小腸相中不同液固 比對ABF 有顯著性差異 (ABFG= 21 %、24 %與 27 %, p=0.02)，且液 固比越高砷 ABF 越高呈中度相關 (R=0.59)，此結果與張 (2005)及 Hamel et al. (1998)研究相符，其可能原因為，對有包封度之土壤受 pH 值影響較大，由於小腸相 pH 值較胃相高 (pH 7.0 vs. pH 1.8)，使 包封度變大，溶解度變小，因此液固比在小腸相中對ABF 影響較大。
然而，在不同液固比中，胃相ABF 均大於小腸相 ABF，若僅進行一 階段胃相體外試驗，液固比於胃相中似乎不是一個重要的試驗參數。
2. 在不同液固比試驗中，NIST 2710 soil 砷之 RBFG平均值分別為 29 %、
33 %與 30 %，砷 RBFI平均值分別為25 %、28 %與 29 %，且在胃相 與小腸相中不同液固比對RBF 皆無顯著性差異 (P=0.053 vs. 0.203)。
對有包封度之NIST 2710 soil，胃相 RBFG皆較小腸相RBFI大 (29 % vs.25 %; 33 % vs.28 %; 30 % vs.29 % )，且本研究體外試驗結果之胃與 腸相RBF 均低估動物試驗 RBF 文獻值。
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3. 綜合上述可知，液固比試驗，在胃相中對生物有效性影響不大，本研 究建議若進行一階段胃相體外試驗，可使用液固比中間值 1000:1 mL/gm。若以二階段生物有效性體外試驗作為健康風險評估依據時，
仍建議暫定使用在胃相中較大之RBF 值，液固比為 1000:1 mL/gm。
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5-3 小腸相萃取時間試驗
1. 小腸相萃取時間第 1 小時與第 2-11 小時之總砷平均濃度，在樣品 Na2HAsO4．7H2O 分為 196 mg/L 與 191 mg/L，其第 2-11 小時之總砷 平均濃度相較於第1 小時之相對誤差為 2.7 %。在標準土壤樣品 NIST 2710 soil 第 1 小時與第 2-11 小時之總砷平均濃度分別為 0.15 mg/L 與 0.14 mg/L，其平均相對誤差為 8.6 %，兩種樣品之相對誤差皆小於 10
%，此結果與張 (2005)研究相符，且近幾年體外試驗研究中於小腸相 萃取時間多採用1 小時為主，因此本研究建議以 1 小時做為小腸相萃 取時間應是可行，以縮短試驗時間。
2. 在文獻中不同體外試驗方法，小腸相 pH 值採用分別有 pH 5.5 與 7.0，
根據前期研究與本研究結果發現，小腸相在 pH 值 5.5 弱酸環境下，
Na2HAsO4．7H2O 與 NIST 2710 soil 之總砷濃度與胃腸相 ABF 皆較 pH 7.0 高，從生理學理可知，小腸相由十二指腸、空腸與迴腸組成，
當小腸相反應完畢，pH 值趨於中性，因此本研究建議小腸相以 pH 7.0 較符合生理參數條件。
5-4 樣品萃取液前處理試驗
1. 本研究進行離心再過濾之前處理方式，樣品 Na2HAsO4．7H2O 之胃相 與小腸相之總砷平均濃度分別為189.6 mg/L 與 127.4 mg/L；NIST 2710 soil 之胃相與小腸相之總砷平均濃度分別為 0.14 mg/L 與 0.07 mg/L，
胃相之總砷平均濃度皆高於小腸相。
2. 當僅進行離心前處理方式時，樣品 Na2HAsO4．7H2O 之胃相與小腸相 之總砷平均濃度分別為190.2 mg/L 與 132.5 mg/L，NIST 2710 soil 之 胃與小腸相之總砷平均濃度分別為0.2 mg/L 與 0.08 mg/L，其胃相之 總砷平均濃度皆高於小腸相。
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3. 在統計分析上，不同萃取液前處理方式於胃與小腸相總砷平均濃度對 Na2HAsO4．7H2O 與 NIST 2710 soil 皆無顯著性差異 (p=0.22 vs. 0.06 與p= 0.15 vs. 0.06)，因此本研究建議萃取液前處理步驟僅進行離心前 處理步驟即可，以簡化試驗程序。
5-5 建立系統品管基準
本研究依據試驗結果，進一步建立四種管制樣品：空白管制、重複樣 品管制、砷酸鈉標準管制以及介質標準管制，其建議品管基準如下所示：
1. 試劑空白管制濃度應低於兩倍方法偵測極限值，本研究 MDL 為 0.91 μg/L。
2. 重複樣品管制建議值為±10 %相對誤差百分比。
3. 砷酸鈉標準管制：ABFG平均值±標準差為 90±8 %，ABFI為 90±5 %。
4. 介質標準管制：NIST 標準土壤 RBFG平均值±標準差為 35±2 %，RBFI 為30±3 %。
5-6 研擬胃腸生物有效性體外試驗方法及標準操作程序
本研究參考美國環保署第 VIII 區生物有效性 PBET 體外試驗方法與 前期研究 (張，2005)，第一階段模擬胃消化環境 (pH 1.8±0.1)，第二階段 模擬小腸環境 (pH 7.0±0.1)。在試驗方法簡化上，設備方面，將開放式反 應槽改為密閉式，可避免污染物逸散；使用可調速磁力攪拌及具載重環 磁石，取代昂貴之氬氣攪拌，並可有效控制攪拌強度；將水浴溫控改採 氣控式，以利試驗觀察與採樣。在試驗參數與程序方面，小腸相萃取不 使用吸附劑且萃取液前處理可利用高速離心取代壓阻較高的傳統過濾方 式。
本研究建議標準操作程序：首先將樣品經風乾且過篩取粒徑< 250 μm，使用有效容積 500 mL 密閉血清瓶並且採用較易控制轉速之磁力攪 拌G 值為 470±150 sec-1 (500±100 rpm)，同時採用氣控式溫度 37±0.5 oC；
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第一階段模擬胃消化環境，使用液固比1000:1 mL/gm，取樣品量 0.5 gm，
僅添加0.15 M NaCl 及 1 % porcine pepsin 製備胃液，以 HCl 溶液調整至 pH 1.8±0.1 做為胃液，反應 1 小時後，取萃取液進行離心前處理 (3500 rpm、15 分鐘)去除粒狀物後，以 ICP 分析總砷濃度；接著進行第二階段 為模擬小腸環境，再添加酵素pancreatin 與 bile，並以飽和 NaHCO3溶液 將 pH 調整至 7.0±0.1 做為小腸液，再反應 1 小時後，取萃取液進行離心 前處理 (3500 rpm、15 分鐘)，以 ICP 分析總砷濃度。最後利用分析之總 砷濃度值計算絕對生物有效性 (ABF)與相對生物有效性 (RBF)。
5-7 其他建議
1. 在 Ruby et al. (1999)文獻中提及，粒徑大小為影響生物有效性因素之 一，粒徑越小，較容易溶解於液體中，則生物有效性越大，如 Figure 2-1 所示。且在不同體外試驗研究中，對於土壤粒徑大多使用小於250 μm 進行試驗，以模擬人體容易因手指沾黏而誤食，但仍有少數文獻使用 不同土壤粒徑，分別為小於 180、200 與 300 μm，進行體外試驗，然 而土壤粒徑大小是否會影響生物有效性，本研究建議後續可進一步探 討進行體外試驗時，不同土壤粒徑大小對生物有效性之影響。
2. 在人體胃腸環境中影響毒性物質砷之價數改變，氧化還原電位 (oxi-dation reduction potential, ORP)為影響因素，光岡知足 (1978)研究中指 出 ORP 於人體消化系統，各消化器官皆不同，當胃通往小腸相時，
ORP 逐漸由正值 (+150 mv)之氧化狀態轉為負值 (-50 mv)之還原狀 態，因此當砷進入人體後，胃相為氧化狀態以五價砷型態存在，進入 小腸相中為還原狀態以三價砷存在，其砷原子有三價砷與五價砷，尤 以三價砷最毒，若經由腸相吸收會危害人體健康。另根據前期研究 (張，2005)結果發現，由胃相至小腸相 ORP 降低，其主要受 pH 所影 響，pH 值與 ORP 成反比關係，而 ORP 對生物有效性之影響尚待研究。
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3. 綜觀過去進行生物有效性體外試驗時，並未提及胃腸相之氧化還原電 位，此外，當土壤樣品由地底下採集至環境中暴露到空氣時，砷的價 數會因遇到空氣而產生價數改變，如地底下土壤中砷毒性物質若以三 價存在時，採集至環境中產生氧化反應變成五價砷，則不易測得原始 之砷價數，因此在進行體外試驗時，容易產生誤差情形而有不確定性 存 在 。 因 此 本 研 究 建 議 後 續 研 究 ， 可 利 用 化 學 物 種 平 衡 模 式 (MINEQL+)探討重金屬砷於環境中或人體胃腸相中三價砷與五價砷 之分配機理以及對生物有效性之影響。
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參考文獻 外文部分：
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