胃腸生物有效性體外試驗品管基準與檢測方法之研究：以砷污染土壤為例

全文

(1)中國醫藥大學碩士論文編號：IEH-1801. 胃腸生物有效性體外試驗品管基準與檢測方法之研究：以砷污染土壤為例 Quality control criteria and test method for the gastrointestinal in-vitro bioavailability test using arsenic-contaminated soils. 所別：環境醫學研究所指導教授：江舟峰博士 Chiang Chow-Feng 學生：林家玉 Lin Chia-Yu 學號：9565001. 中華民國. 九十七. 年七月.

(2) 誌謝終於要提筆寫最後的致謝，兩年的研究生生活點滴在心，隨著論文的完成即將告一段落，從大學開始做專題到研究所，一路走來，特別要感謝我的指導老師江舟峰老師耐心的教誨與鼓勵，讓我知道從事研究應有的品質與態度以及待人處事的道理，從中不斷的自我學習與成長，感謝之意，非三言兩語可以表達，學生將銘記在心。感謝中興大學盧至人老師與林耀東老師，在百忙中審閱論文，於口試期間指導與提供諸多寶貴的建議，受益良多，更讓論文得以更加流暢與完整。同時感謝中國醫藥大學環境醫學研究所全體教師與健康風險管理學系凌明沛老師於平時的指導與解惑，此外要感謝公衛系吳錦景老師在儀器分析上的指導與解惑。感謝我的好朋友們，特別感謝佳璘和柏佐，在兩年的研究生活中，給我課業及生活上的支持與鼓勵，因為有你們讓我在研究所兩年留下不少歡樂的回憶。也要感謝研究室的婷婷學妹、佩芳學妹與厚吾學弟以及研究助理佳蓉與偉翔，大家一起分擔研究室的事務、一起歡樂、互相鼓勵與支持，讓我可以專心埋首於論文寫作中，以及大學部活潑好動的學弟妹們，研究室有你們充滿更多的歡樂，在此一併致上我深切的謝意。最後要感謝家人的支持、包容與鼓勵，讓我有勇氣面對碩士兩年所有的挑戰與考驗，得以順利完成學業與論文之寫作。在此獻上衷心之感謝，並將此研究成果分享給支持我的人!. 林家玉謹誌于中國醫藥大學 2008 年 7 月. I.

(3) 摘要為確保土壤及地下水資源的永續利用，世界各國大都訂有土壤重金屬的濃度標準。近年來，我國與歐美先進國家相繼提出污染場址健康風險評估，但在估算具包封度受污土壤健康風險時，其生物有效性 (bioavailability)大都使用保守情境 (100 %被人體胃腸吸收)，導致復育成本增加。美國環保署訂定超級基金場址 (Superfund site)復育標準時，允許考量生物有效性，所謂絕對生物有效係數 (absolute bioavailability factor, ABF)是指污染物進入血液的劑量與暴露劑量的百分比，相對生物有效係數 (relative bioavailability factor, RBF)為待測樣品與標準樣品之 ABF 比值。若使用動物實驗評估，程序複雜且昂貴費時，因此美國於 1992 年開始發展一套模擬人體胃腸環境之體外試驗方法。本研究嘗試研擬我國之標準操作方法，建立系統品管基準，特別著重試驗設備與方法之簡化。本研究參考美國環保署第 VIII 區生物有效性 physiologically based extraction test (PBET)與前期研究體外試驗方法，第一階段模擬胃消化環境(pH 1.8)，第二階段模擬小腸環境 (pH 7.0)。文獻中對於體外試驗操作參數與程序，如樣品前處理、溫度、酵素添加量、胃腸相 pH 值與反應時間等參數已漸趨一致，本研究針對尚未深入探討之重要參數進行試驗，以砷酸鈉 (Na2HAsO4．7H2O)與標準土讓 (NIST 2710 soil)，探討蠕動強度、液固比、小腸相萃取時間以及萃取液前處理方式對生物有效性之影響。本研究建議標準操作程序：首先將樣品經風乾且過篩取粒徑< 250 μm，取樣品量 0.5 gm，使用密閉血清瓶，有效容積 500 mL，且採用較易控制轉速之磁力攪拌，速度梯度 (G 值)為 470 sec-1，同時採用氣控式溫度 37±0.5 oC；第一階段模擬胃消化環境，液固比 1000:1 mL/gm，僅添加 0.15 M NaCl 及 1 % porcine pepsin 製備胃液，以 HCl 溶液調整至 pH 1.8± II.

(4) 0.1，反應 1 小時後，取萃取液經離心去除粒狀物後，以 ICP-MS 分析總砷濃度；第二階段為模擬小腸環境，僅添加 pancreatin 與 bile，以飽合 NaHCO3 溶液將 pH 調整至 7.0±0.1 做為小腸液，反應 1 小時後，取樣經離心去除粒狀物後，以 ICP-MS 分析總砷濃度。研究結果顯示，當液固比 1000:1 mL/gm 時，在 95%信賴水準 (95% CI) 時，三種速度梯度 (G=0, 470, 1000 sec-1)對生物有效性無顯著性差異，胃相與腸相之砷酸鈉 ABF 為 82-96 %，標準土壤 RBF 分別為 26-35 %與 27-29 %。在三種液固比 (200:1, 1000:1, 5000:1 mL/gm)時，除 NIST 2710 soil 之腸相外，其餘均無顯著性差異，胃相與腸相砷酸鈉 ABF 為 85-101 %，標準土壤 RBF 分別為 29-33 %與 25-29 %。在砷酸鈉與 NIST 2710 soil 之腸相萃取方面，以第 1 個小時為基準，第 2-11 小時平均濃度之相對誤差皆小於 10 %，與前期研究相符，表示以 1 小時做為小腸相萃取時間是合宜的。萃取液前處理試驗中，砷酸鈉與 NIST 2710 soil 之胃與小腸相總砷濃度，95 % CI 皆無顯著性差異。綜合上述結果，擬定四種品管基準：(1) 試劑空白砷濃度低於方法偵測極限；(2) 重複樣品管制，相對差異百分比為±10 %；(3) 砷酸鈉 ABFG 與 ABFI 平均值標準差分別為 90±8 %與 90±5 %；(4) 標準土壤 RBFG 與 RBFI 分別為 35±2 %與 30±3 %。爲進一步簡化試驗方法，建議將開放式反應槽改為密閉式；使用可調速磁力攪拌及具載重環磁石，取代昂貴之氬氣攪拌；將水浴溫控改為氣控式，以利試驗觀察與採樣。此外，小腸相萃取不使用吸附劑，萃取液前處理利用高速離心取代壓阻較高之過濾方式。本研究二階段試驗之生物有效性皆低估動物試驗 RBF，建議可將二階段胃腸體外試驗方法改為單相一階段生物有效性萃取 (simplified bioaccessibility extraction, SBET)試驗方法。關鍵字：生物有效性、體外試驗、標準操作方法、系統品管基準 III.

(5) Abstract In order to preserve underground water resource for sustainable use, most countries in the world have promulgated heavy metal standards for soil. Recently Taiwan and many other countries have proposed a variety of risk assessment methods for site remediation. But most of the methods normally assume 100% bioavailability for contaminated soils. The US Environmental Protection Agency (USEPA) allows for a modification of bioavailability in the Superfund Program. The absolute bioavailability factor (ABF) is defined as the dose percentage of contaminant in soil entering the blood circulation system, while relative bioavailability factor (RBF) is defined as the ABF ratio in percentage between soil samples to the standard sample. Various in-vitro bioavailability test methods based on gastrointestinal physiology have been proposed since 1992. The aim of this study is to propose a standard test procedure for bioavailability focusing on establishing quality control (QC) criteria and simplifying test procedure and apparatus. This study refers to the physiologically based extraction test (PBET) developed by USEPA Region VIII and the method developed in the early study by our group. The first phase of this method simulates stomach condition (pH 1.8) and the second phase simulates intestinal condition (pH 7.0). Many test parameters proposed in these methods have widely accepted in the literature for sample pretreatment, temperature, enzyme dose, pH, and reaction time. This study used sodium arsenate (Na2HAsO4‧7H2O) and NIST 2710 soil as the standards to investigate the effect of mixing intensity, liquid to solid (L/S) ratio, extraction time, and extract pretreatment methods for the determination of bioavailability. Testing at a constant L/S ratio of 1000:1 mL/gm, all the ABFs (n = 5) obtained for the 2 phases from the 3 velocity gradients (G) of 0, 470, and 1000 1/sec had no significant difference (95 % CI) for both standards. The ABFs (n = 5) from both phases were 82-96 % for sodium arsenate and were 26-35% for the NIST soil. When the test was conducted at a constant G of 470 1/sec with 3 L/S ratios of 200:1, 1000:1, and 5000:1 mL/gm, only the ABFs obtained from the intestinal phase for the standard soil resulted in significant difference (p =0.02). The ABFs (n= 5) obtained from both phases were 85-101 % for sodium arsenate and were 25-33 % for IV.

(6) the standard soil. The As concentrations extracted for both standards from the intestinal phase were within 10% of difference for 2-11 hours of extraction time based on the first hour of extraction. Thus 1 hour of extraction appears to be appropriate. Sample pretreatment using centrifugation with or without a follow-up filtration yielded no significant difference. In conclusion, we propose 3 types of QC criteria: (1) a concentration less than the method detection limit (MDL) for the reagent blank; (2) a ABFG and ABFI of 90±8 % and 90±5 % for sodium arsenate, respectively, (3) a RBFG and RBFI of 35±2 % and 30±3 % for NIST 7210 soil, respectively. Based on the test results, this study proposes a standard procedure for the two-phase bioavailability test. The soil sample is first dried by air and sieved for the particle size of 250 μm or less. A 0.5 gram of sample is fed into a serum bottle with a liquid volume of 500 mL at a liquid to solid (L/S) ratio of 1000:1 mL/gm in the stomach phase. A velocity gradient (G) of 500 1/sec is provided using magnetic stirring and a temperature of 37±0.5 oC is maintained in a air-circulated incubator. The extraction liquid contains 0.15 M of NaCl and 1% of porcine pepsin and the pH is adjusted to 1.8±0.1 by HCl stock solution. After 1 hour of extraction, a sample of extract is taken and centrifuged to remove particulate matters. The supernatant is determined for total arsenic. In the intestinal phase, pancreatin and bile are added to the extract liquid and is adjusted to pH 7.0±0.1 by NaHCO3 stock solution. After I hour of extraction, a sample extract is taken and centrifuged for the measurement of arsenic. In order to simply the method, we further propose using magnetic stirring with weighted ring in stead of argon sparging; using air-circulated incubator in stead of water bath for better observation and sample collection; using centrifuging in stead of filtration for extract pretreatment; using one phase of simplified bioaccessibility extraction (SBET) method instead of the two-phase method for a better estimate to the in-vivo method. Keywords: bioavailability, in-vitro test methods, quality control criteria, standard test procedure. V.

(7) 目錄誌謝 ...................................................................................................................I 摘要 ................................................................................................................. II Abstract.............................................................................................................IV 目錄 ................................................................................................................VI 表目錄 ........................................................................................................... VIII 圖目錄 ..............................................................................................................IX 第一章緒論 ...................................................................................................... 1 1-1 研究緣起與目的............................................................................... 1 1-2 研究內容與架構............................................................................... 3 1-3 研究限制........................................................................................... 5 第二章文獻探討 .............................................................................................. 6 2-1 生物有效性與生物可及性之定義................................................... 6 2-2 胃腸生物有效性體外試驗之簡化趨勢......................................... 10 2-3 評析不同生物有效性體外試驗方法............................................. 19 2-3-1 PBET 試驗方法 ..................................................................... 19 2-3-2 IVG 試驗方法........................................................................ 24 2-3-3 SBET 試驗方法 ..................................................................... 29 2-3-4 體外試驗方法簡化說明........................................................ 32 2-3-5 體外試驗之品管基準............................................................ 38 2-4 生物有效性體內與體外試驗之評比............................................. 40 第三章研究方法 ............................................................................................ 43 3-1 體外試驗程序與試驗參數............................................................. 43 3-2 生物有效性體外試驗藥劑與設備................................................. 47 3-3 生物有效性體外試驗之實驗設計................................................. 48 3-3-1 蠕動強度試驗 (Phase I) ....................................................... 48 3-3-2 液固比試驗 (Phase II) .......................................................... 51 VI.

(8) 3-3-3 小腸相萃取時間試驗 (Phase III)......................................... 52 3-3-4 樣品萃取液前處理試驗 (Phase IV) .................................... 52 3-3-5 建立系統品管基準 (PhaseV)............................................... 53 3-4 重金屬砷之感應式偶合電漿質譜儀(ICP-MS)分析方法 ............ 54 3-4-1 ICP-MS 儀器與操作條件 ..................................................... 54 3-4-2 重金屬砷之品質管制............................................................ 56 3-5 數據資料整理與統計分析............................................................. 58 第四章結果與討論 ........................................................................................ 60 4-1 蠕動強度試驗 (Phase I) ................................................................ 60 4-2 液固比試驗 (Phase II) ................................................................... 65 4-3 小腸相萃取時間試驗 (Phase III).................................................. 71 4-4 樣品萃取液前處理試驗 (Phase IV) ............................................. 73 4-5 建立品管基準 (Phase V) ............................................................... 75 4-6 研擬胃腸生物有效性體外試驗方法及標準操作程序 ................ 78 第五章結論與建議 ........................................................................................ 85 5-1 蠕動強度試驗................................................................................. 86 5-2 液固比試驗..................................................................................... 87 5-3 小腸相萃取時間試驗..................................................................... 89 5-4 樣品萃取液前處理試驗................................................................. 89 5-5 建立系統品管基準......................................................................... 90 5-6 研擬胃腸生物有效性體外試驗方法及標準操作程序 ................ 90 5-7 其他建議......................................................................................... 91 參考文獻 .......................................................................................................... 93 附錄一：本研究蠕動強度與液固比試驗之砷濃度原始數據...................... 99 附錄二：美國 NIST 2710 Montana soil 各元素全量濃度認證 ................. 100. VII.

(9) 表目錄 Table 2-1 不同土壤來源之胃相(Gastric phase)和腸相(Intestinal phase)砷 RBF 與 ABF 文獻值 ...................................................................... 11 Table 2-2 一階段胃相生物有效性體外試驗方法(SBET)之沿革表 ............ 13 Table 2-3 文獻中不同土壤來源之胃相 As 之 ABF 比較表 ........................ 18 Table 2-4. PBET 體外試驗方法之參數比較表 ............................................ 20. Table 2-5. IVG 體外試驗方法之參數比較表............................................... 25. Table 2-6. SBET 體外試驗方法之參數比較表 ............................................ 30. Table 2-7 本研究生物有效性體外試驗設備與程序簡化表......................... 36 Table 2-8. NIST 2710 soil 於不同體外試驗參數與砷之生物有效性比較 . 39. Table 2-9 比較文獻中體內與體外試驗生物有效性之迴歸分析................. 42 Table 3-1 本研究生物有效性體外試驗參數比較表..................................... 45 Table 3-2 本研究轉速 (rpm)與 G 值對應表.................................................. 50 Table 3-3 三種不同液固比之備製量表......................................................... 51 Table 3-4. ICP-MS 儀器操作條件................................................................. 55. Table 3-5 本研究 ICP-MS 品質管制基準與實測值比較表 ........................ 57 Table 4-1 不同速度梯度(G)時砷 ABF 統計比較表 ..................................... 62 Table 4-2 不同速度梯度(G)時 NIST 2710 soil 砷 RBF 統計比較表.......... 62 Table 4-3 本研究 Na2HAsO4．7H2O 與文獻參數值及砷 ABF 比較表 ...... 64 Table 4-4 不同液固比(L/S)時砷 ABF 統計比較表....................................... 67 Table 4-5 不同液固比(L/S)時 NIST 2710 soil 砷 RBF 統計比較表 ........... 67 Table 4-6. NIST 2710 soil 於不同體外試驗胃相參數比較表 ..................... 70. Table 4-7 小腸相於不同 pH 值時萃取時間與總砷濃度比較表.................. 72 Table 4-8 不同萃取液前處理時總砷平均濃度統計表................................. 73 Table 4-9 本研究體外試驗建議管制項目與管制基準 ................................ 75 Table 4-10 比較本研究群與文獻中品質管制基準....................................... 76. VIII.

(10) 圖目錄 Figure 1-1 本研究生物有效性體外研究架構流程圖 ........................... ……..4 Figure 2-1 影響砷之生物有效性之物化特性示意圖(Ruby et al., 1999) ….12 Figure 2-2 比較不同土讓中體內(in vivo swine assay)與體外(in vitro SBET assay)試驗相關性(Juhasz et al., 2007a)...................................... 17 Figure 2-3 250 mL 底座為 70 μm 網狀 PE 分液漏斗反應槽示意圖 (Ruby et al., 1996)..................................................................................... 21 Figure 2-4 120 mL 玻璃圓底管反應槽示意圖(Bruce et al.,2007) ............. 22 Figure 2-5 人類胃腸道在不同部位之停留時間與 pH 值(修改 Dean et al., 2007)............................................................................................. 23 Figure 2-6. Canning jar 反應槽示意圖(Rodriguze et al., 1999) .................. 26. Figure 2-7 在 Jersey City 土壤中，不同液固比與砷 ABF 關係(Hamel et al., 1998) ............................................................................................. 27 Figure 2-8 比較礦區土壤於不同體外試驗方法之小腸相砷 ABF .............. 28 Figure 2-9 125 mL wide-mouth high-density polyethylene (HDPE) bottle 反應槽及攪拌設備示意圖(Drexler, 1999; Kelly et al., 2002) ....... 31 Figure 2-10 本研究群前期研究設計之反應槽體與氣體溫度控制室示意圖 (張，2005).................................................................................. 33 Figure 2-11 不同研究中體內與體外試驗砷生物有效性之比較 ................. 41 Figure 2-12 比較體內與體外試驗生物有效性文獻值之相關性圖 ............. 42 Figure 3-1 本研究體外試驗反應槽體設備 ................................................... 44 Figure 3-2 本研究二階段胃腸相生物有效性體外試驗程序 ....................... 46 Figure 3-3 rpm 與 G 值之關係圖 (CES, 2002)........................................... 49 Figure 3-4 樣品萃取液過濾方法結構示意圖 ............................................... 52 Figure 3-5 砷之檢量線圖 ............................................................................... 56 Figure 4-1 速度梯度與 Na2HAsO4．7H2O 及 NIST 2710 soil 砷 ABF 關係圖 .................................................................................................. 60 Figure 4-2 液固比與 Na2HAsO4．7H2O 及 NIST 2710 soil 砷 ABF 關係圖..65 Figure 4-3. NIST 2710 soil 於不同液固比胃相砷 ABF 之比較圖.............. 69. Figure 4-4 小腸相 1-11 小時萃取時間與總砷濃度關係圖.......................... 71. IX.

(11) 第一章緒論 1-1 研究緣起與目的為確保土壤及地下水資源的永續利用，世界各國大都訂有土壤重金屬的濃度標準。根據我國環保署 (2008)土壤及地下水整治網站可知，全國目前共有 738 個污染控制場址，20 個污染整治場址，其中以受重金屬污染場址最多。近年來，我國與歐美先進國家也相繼提出受污染場址的健康風險評估，且於初評辦法第六與第七條中，提及污染行為人及土地關係人得以健康風險評估結果作為列管依據 (黃，2006; 楊等，2006；行政院環保署，2006)，我國已由污染調查邁入風險評估與污染控制整治。但是進行健康風險評估時，並未訂定生物有效性 (bioavailability)評估方法，而以保守情境 (conservative scenario)推估致癌與非致癌風險，即假設經由食入暴露，土壤中所含重金屬 100 %進入血液將導致高估風險而提高復育成本 (環保署，2006; Jahasz et al., 2007; Bruce et al., 2007)。美國環保署(U.S. Environmental Protection Agency, USEPA)在訂定超級基金場址 (Superfund site)整治標準時，允許考量生物有效性，美國環保署第 VIII 區與 Exponent 公司組成 Solubility/Bioavailability Research Consortium (SBRC)，針對 As 及 Pb 受污場址，以生物有效性訂定較寬鬆的整治目標，減少復育成本。所謂生物有效性是毒理學的重要觀念，常應用於生物體內試驗 (in vivo test)，指用來評估具包封度 (如土壤、礦渣等)中各種毒性污染物 (如 As, Pb 等)，經由食入、吸入等不同暴露途徑，於一定時間後，進入血液循環系統之劑量與暴露劑量的比例，此為絕對生物有效性係數 (absolute bioavailability factor, ABF)，另一個名詞為相對生物有效係數 (relative bioavailability factor, RBF)，為待測樣品與標準樣品之 ABF 比值 (Kelly et al., 2002; 張，2006)。若使用動物實驗評估生物有效性，不僅操作程序複 1.

(12) 雜且昂貴費時，美國乃於 1992 年開始研發模擬人體胃腸環境體外試驗 (in vitro test)方法，針對 As, Pb 等重金屬進行系統測試 (Ruby et al., 1999)，評估以生物有效性作為風險評估之依據。本研究參考本研究群前期研究 (張，2005)所建立之一套胃腸體外試驗設備與方法，以及美國環保署第 VIII 區生物有效性兩階段 PBET (physiologically based extraction test)體外試驗方法 (Ruby et al.; 1996)，第一階段模擬胃消化環境 (pH 1.8)，第二階段模擬小腸環境 (pH 7.0)。生物有效性體外試驗研究至今已超過 10 年，雖然試驗參數與程序已漸趨一致，但仍有需要釐清之問題如：是否應控制胃腸蠕動情況? 是否應控制液固比? 以及縮短腸相反應時間是否可行? 萃取液前處理僅使用離心是否可行?等問題，此為本研究目的之一。再者，綜觀不同體外試驗研究發現，文獻中普遍未使用標準參考物質 (standard reference material, SRM)建立系統品管基準 (QC criteria)，以致於無法評比不同體外試驗之萃取效率，因此建立系統品管基準為本研究目的之二。最後統整體外試驗結果與系統品管基準，嘗試研擬我國生物有效性體外試驗標準操作方法，特別著重設備與程序之簡化，為本研究目的之三。. 2.

(13) 1-2 研究內容與架構本研究之整體架構與流程如 Figure 1-1 所示，主要分為三部分：文獻收集與評析、參數試驗與體外試驗標準方法之研擬。本研究於參數試驗上，使用砷酸鈉 (Na2HAsO4．7H2O)以及美國 NIST 2710 土壤作為標準參考樣品，詳細如下說明： 1. 在文獻收集與評析方面：收集有關於生物有效性體外試驗之文獻，首先定義生物有效性與生物可即性，評析並初步簡化生物有效性體外試驗參數與程序，且評比文獻中生物有效性體內試驗與體外試驗之相關性。 2. 在參數試驗方面：為探討生物有效性體外試驗各參數對生物有效性以及總砷濃度之影響，本研究進行 Phase I-V 試驗，分項說明如下： (1) Phase I 與 Phase II 為探討試驗參數對生物有效性之影響。Phase I 為不同蠕動強度試驗，G 值分別為 0、470、1006 sec-1，以磁力攪拌方式模擬胃腸蠕動情況。Phase II 為不同液固比試驗，分別為 200:1、 1000:1、5000:1 mL/gm。 (2) Phase III 與 IV 為探討試驗參數對總砷濃度之影響。Phase III 為小腸相萃取時間試驗，將萃取時間延長為 11 小時。Phase IV 為萃取液前處理方式，分成離心再過濾與僅離心二種前處理方式。 (3) Phase V 為利用 Phase I 與 Phase II 之試驗結果，建立系統品管基準，本研究建立試劑空白管制、重複樣品管制、砷酸鈉以及介質標準管制樣品等四種品管基準。 3. 在體外試驗標準操作方法之研擬方面：根據參數試驗結果 (Phase I - Phase IV)與系統品管基準建立 (Phase V)，簡化試驗方法並研擬我國生物有效性體外試驗標準操作方法。 3.

(14) 文獻探討. 文獻收集與評析. 生物有效性與生物可及性定義. -1. (G 值=0、470、1006 sec ). 參數試驗. Phase I :蠕動強度試驗. 評比文獻中體內與體外試驗關係. 探討生物有效性體外試驗參數與程序. Phase II :液固比試驗 (200、1000、5000 mL/gm). Phase V :建立系統品管基準空白管制、SRM 管制與介質管制. Phase III :小腸相萃取時間 ( 11 小時小腸相萃取 ). Phase IV :萃取液前處理方式 (離心再過濾&離心 ). 研擬我國生物有效性體外試驗標準操作方法. Figure 1-1 本研究生物有效性體外研究架構流程圖 4. 結果與方法研擬. 簡化生物有效性體外試驗方法.

(15) 1-3 研究限制綜觀過去使用體外試驗進行生物有效性研究中，大多數文獻皆採集環境中土壤樣品，且 Ruby et al. (1999)與 Wragg et al. (2002)研究中提及，影響生物有效性之因素有土壤中物化特性，因此文獻中不僅針對實際土壤樣品進行體外試驗外，也分析土壤中物化特性，而相較於本研究僅使用標準土壤 NIST 2710 無干擾因素存在，僅用以進行體外試驗探討各參數對生物有效性之影響，未進行實際土壤樣品之試驗，故無法得知土壤中其他重金屬物質與其物化特性是否會干擾待測物質砷之測定結果，此為本研究限制之一。此外，綜觀過去進行生物有效性體外試驗研究，有專家學者針對受污土壤，除了進行體外試驗研究外，且為了驗證能以體外試驗結果預測體內動物試驗，也同時進行體內試驗，分析體內與體外試驗之相關性。而本研究僅進行體外試驗來探討不同參數試驗對生物有效性之影響，此為本研究限制之二。. 5.

(16) 第二章文獻探討 2-1 生物有效性與生物可及性之定義在進行受污土壤之健康風險評估時，生物有效性是量化風險時一個重要參數，傳統上是以孩童手指沾黏而誤食受污土壤，且假設 100%為人體胃腸道所吸收，會高估風險 (Kelly et al., 2002; Bruce et al., 2007)。所謂生物有效性 (bioavailability)為毒理學的重要觀念，是指具有包封度介質 (如土壤、礦渣等)中目標污染物 (如砷)，經特定暴露途徑 (如食入、吸入等) 為生物體分布、吸收、代謝之模式於一定時間後，目標污染物進入血液循環系統的劑量與總暴露量之百分比 (Klasssen, 2001; 張，2005)。生物有效性可分為兩部分說明與計算，分別為絕對生物有效性係數 (absolute bioavailability factor, ABF) 與相對生物有效係數 (relative bioavailability factor, RBF)，所謂絕對生物有效係數是指污染物進入血液的劑量與暴露劑量的百分比，如公式(1)所示 (Klasssen, 2001; Kelly et al., 2002；江等，2006)。. ⎡D ⎤ ABF (%) = ⎢ B ⎥ × 100% ⎣ DT ⎦ P. (1). DB=進入血液循環系統劑量 (mg)，DT=暴露總量 (mg)。P 為暴露途徑 (如食入、吸入等)。在實驗操作上，生物體誤食受污土壤，其污染物會依藥物動力學模式，使進入血液循環系統之濃度隨時間而改變，且在循環過程中，污染物會被分解或排出，要正確推估 DB 並不容易，因此在實務上常使用相對生物有效性係數 (RBF)，以靜脈注射污染物之參考物質的 ABF 為基準，評估待測污染物在不同介質中進入血液系統的相對比例，其優點為減少未能估算污染物在血液中的分解及排出量所引起的誤 6.

(17) 差，如公式(2)所示 (Kelly et al., 2002；江等，2006)。. ⎡ DB ⎤ ⎢ ⎥ ABFP ⎣ DT ⎦ P ×100% = RBF (%) = ×100% ABFI ⎡ DB ⎤ ⎢ ⎥ ⎣ DT ⎦ I. (2). ABFP=某暴露途徑 (如食入、吸入等)之 ABF，ABFI= 由靜脈注射 (intravenous injection)藉由毒理學建議之參考物質 (如醋酸鉛、砷酸鈉)所得之 ABF，一般均假設靜脈注射生物有效性為 100 %。然而，在進行健康風險評估時，若利用體內試驗評估生物有效性，不僅花費成本高且較費時，因此，自 1992 年起專家學者致力於研發生物有效性體外試驗 (in vitro)以取代程序繁瑣之體內試驗，體外試驗則以生物可及性 (bioaccessibility)表示，但一般而言不區別生物有效性與生物可及性這兩名詞，皆以生物有效性表示，意指模擬人體經由食入之暴露途徑，胃腸消化、吸收作用，分別計算胃與小腸階段萃取出污染物的總量與暴露量百分比，公式(3)為體外試驗絕對生物可及性之定義 (Kelly et al., 2002; Caussy, 2003; 張，2005；江等，2006)。. ABF (%) =. MY CY (mg / L) × V ( L) × 100% = × 100% MT CT (mg / kg ) × WS (kg ). (3). MY=胃或小腸階段所萃取出的總量 (mg)，利用環檢所公告 NIEA S321.63B, 王水消化法量測)；MT=污染物在介質中的總量 (mg)。CY=胃或小腸階段所萃取出的濃度 (mg/L)；V=反應槽有效容積 (L)，須分別調整在胃與小腸階段中用以調整 pH 值添加體積，以及進入小腸階段前，胃相萃取液採樣減少之體積；CT =污染物在介質中的全量濃度 (mg/kg)； WS=樣品總量 (kg)。 7.

(18) 相對生物可及性是以 Standard Reference Material (SRM)的 ABF 為基準，評估污染物在不同介質中 (如土壤或水體等)溶出的程度，如公式(4) 所示 (張，2005；江等，2006)。. RBF (%) =. ABFX ABFSRM. ⎡MY ⎤ ⎢ ⎥ ⎣MT ⎦ X × 100% × 100% = ⎡MY ⎤ ⎥ ⎢ ⎣ M T ⎦ SRM. (4). ABFX=不同介質之樣品 X 之 ABF，ABFSRM=SRM 之 ABF。本研究係參考前期研究 (張，2005)，ABFX 以標準土壤 NIST 2710 做為待測樣品，而 ABFSRM 則參考體內試驗所使用 Na2HAsO4．7H2O 為 SRM，其原因為 Na2HAsO4．7H2O 有溶解度大 (5.46 gm/100 mL at 0 ℃)且易被吸收之特性 (Rodriguez et al., 2003; IRIS, 2008)。在體外試驗中，使用 RBF 之優點為可減少因使用不同體外試驗方法，產生不同萃取效率所引起的差異，但文獻中普遍未報告 SRM 之 ABF，也未建立體外試驗之品管基準，因此不利於本研究後續進行評比不同體外試驗研究之萃取效率差異。最後，在健康風險評估量化估算時，對具有包封度之受污土壤，為正確推估致癌風險，應採用 RBF 做為修正係數而非 ABF，其主要原因為，在 Integrated Risk Information System (IRIS, 2008)資料庫中，對於砷之毒性因子 CSFs (cancer slope factors)，乃採用飲用水之暴露途徑 (假設砷於水中 100%被溶解)，作為劑量反應關係之推估值，但在不同介質 (如土壤) 中，不同污染物(如 As)之生物有效性不同，若直接使用 IRIS 公告之 CSFs 進行風險估算，會高估風險，導致整治成本提高。鑒於此，對於不同包封度之介質，將生物有效性修正至以砷酸鈉之 SRM 為基準是必要的，即相對生物有效性 (RBF)，本研究係參考本研究群前期研究 (張，2005)與環保署之土壤及地下水污染場址健康風險評估評析方法所提及之致癌風 8.

(19) 險公式，建議進行修正估算終身增加之致癌風險 (excess lifetime cancer risk, ELCR)如公式(5)所示(江等，2006；環保署，2006)。. ELCR X ,i =. (LID X )× (RBF X ,i ) × SFi (BW )× ( AT ). (5). SFi=目標污染物 i 之斜率係數 (slope factor, (mg/kg-day)-1) LIDx=樣品 X 之終身平均攝入該物質劑量 (lifetime intake dose, mg) =(CT, mg/kg) × (IR,食入土壤速率, mg/day)× (EF,暴露頻率, day/year) × (ED,暴露期間, year) × (10-6,轉換因子, kg/mg) BW=受評估族群之平均體重 (kg) AT=受評估族群之平均餘命日數 (day). 9.

(20) 2-2 胃腸生物有效性體外試驗之簡化趨勢在受污土壤風險評估中，生物有效性是一個重要的觀念，若利用體內試驗評估生物有效性，由於體內試驗使用動物進行研究，需要花費較多的成本與時間 (Kelly et al., 2002)。鑒於此，美國早於 1992 年開始著重研發二階段胃腸生物有效性體外試驗方法，研究至今體外試驗各參數也趨於一致，在驗證體內與體外試驗方面也有良好的線性相關。近幾年，有專家學者將二階段生物有效性體外試驗簡化為一階段胃相生物有效性試驗稱為 SBET 試驗方法 (Simplified Bioaccessibility Extraction, SBET)，應用於受污土壤之健康風險評估，以下討論 SBET 試驗方法之沿革與研究成果。首先彙整前期研究 (張，2005)與本研究蒐集 1992 至 2007 年有關於二階段胃腸生物有效性體外試驗之重要文獻，有 Davls et al. (1992), Ruby et al. (1993; 1996; 1999), Hamel et al. (1998), Rogriguze et al. (1999), Sarkar et al. (2003), 張(2005), Pouschat et al. (2006), Bruce et al. (2007)，綜合這些文獻主要研究成果如下說明： 1. 文獻中探討受污土讓砷之生物有效性時，根據生物有效性定義，應以 RBF 值表示，但仍有部分文獻以 ABF 值表示 (Hamel et al., 1998; Poushat et al., 2006)，且大部分文獻皆未報告 SRM (砷酸鈉與標準土壤)之 ABF，欠缺系統品管基準，因此難以評比不同試體外驗方法之研究結果。 2. 大多數文獻以探討土壤與受污場址中砷與鉛之生物有效性為主，砷之生物有效性變異範圍大，其範圍為 4-55 %，此結果對於訂定整治目標及花費成本影響甚大，如 Table 2-1 所示。 3. 文獻中探討土壤與受污場址中砷之胃腸生物有效性，其胃相 RBF 均較小腸相 RBF 大，如 Table 2-1 所示。. 10.

(21) Table 2-1 不同土壤來源之胃相(Gastric phase)和腸相(Intestinal phase)砷 RBF 與 ABF 文獻值 RBFG. RBFI. ABFG. ABFI. mining site soil residential soil-I. 53. 16 52. 55. 12 50. Davls et al., 1992 Ruby et al., 1996. residential soil-II. 48. 46. 49. 44. Ruby et al., 1996. House dust-I. 33. 38. 34. 36. Ruby et al., 1996. mining / smelter site -calcine. 3.66. 3.52. -. -. Rodriguez et al., 1999. mining / smeltersite - iron slag. 24.8. 22.7. -. -. NIST2710. 38.6. 28.8. 39. 29. Rodriguez et al., 1999 張，2005. 14. 18. -. -. Bruce et al., 2007. Jersey City soil. -. -. 13. -. Hamel et al., 1998. NIST 2710. -. -. 48. -. Hamel et al., 1998. near CCA-Treated utilitypoles soils. -. -. 36.2. 土壤來源. kidston gold mine site siol. 參考文獻. 40.7 Pouschat et al., 2006. 4. 相較於體內動物試驗，體外試驗與體內試驗生物有效性有良好的線性相關，但大多數研究中皆低估體內試驗 RBF 達 40 %，且 Rogriguze et al. (1999)使用 PBET 試驗方法，研究發現胃相比小腸相階段較能準確推估體內動物試驗砷 RBF (RG=0.83, slope=0.88 vs. RI=0.82, slope= 0.76)，因此本研究將進一步探討僅使用 SBET 試驗方法之可行性。 5. Ruby et al. (1999)與 Wragg et al. (2002)評析其他文獻，說明影響無機金屬生物有效性之因素包含物化特性與體外試驗方面等因素，如污染物之礦物型態 (mineral form)、粒徑大小 (grain size)、包封度 (encapsulation)、胃腸酸鹼值、蠕動速度。就礦物形態而言，當砷與硫化物結合後會形成穩定的礦物型態，與砷之氧化物比較 (如 Fe-As oxides、Mn-As oxides 與 Pb-As oxides)，其溶解度較低使生物有效性亦較低。對同一物質而言，粒徑越大，生物有效性越小。在包封程度上，含砷化合物被石英 (quartz)包封，砷不易溶解使生物有效性較低，但砷化合物若被礦渣 (slag)包封會使生物有效性提高，如 Figure 2-1 所示。 11.

(22) Figure 2-1 影響砷之生物有效性之物化特性示意圖 (Ruby et al., 1999) 6. 胃腸生物有效體外試驗研究發展至今超過 10 年，已詳盡考量人體胃腸消化環境各項參數，試驗參數也漸趨一致，如樣品前處理、溫度控制、胃腸相酵素添加物、胃腸相 pH 值與反應時間等參數，但仍有需要釐清之問題，如：液固比、蠕動強度、小腸相反應時間等，本研究將進一步探討。 7. 體外試驗設備皆為開放式反應槽體，並通入惰性氣體以維持厭氧狀態，不僅花費高昂且試驗程序繁瑣，於第 2-3 節進行討論。 Table 2-2 為本研究彙整近幾年一階段胃相生物有效性體外試驗 (SBET)方法之沿革與研究成果。SBET 試驗方法為參考 Ruby et al. (1996) 所建立之 PBET (physiologically based extraction test)試驗方法之胃相參數，使用開放性系統之反應槽體，胃相萃取液為 glycine，液固比為 100:1 mL/gm，溫度為 37 oC，震盪 1 小時，文獻中各參數於下一節進行討論。. 12.

(23) Table 2-2 一階段胃相生物有效性體外試驗方法(SBET)之沿革表參考文獻. 研究目的. 研究成果. Kim et al. (2002). 針對韓國某一廢棄礦區 (Duckum mine)，調查鄰近 1. 使用 SBET 試驗方法，模擬人體胃相環境 1 小時後，農礦區附近農田與稻田之土壤中含砷與其他毒性重田與稻田之土讓含砷全量濃度，以農田之土壤含砷濃度金屬物質 (Cd, Cu, Pb 和 Zn)之全量濃度與生物有較高，分別為 9.4 mg/kg 與 2.3 mg/kg。效性。 2. 在生物有效性方面，As 之 ABF 以農田較稻田高，分別為 20.1 %與 17.9 %，顯示在長時間暴露條件下，經由食入受污土壤之農夫或當地居民會造成潛在的健康風險危害。. Lee et al. (2006). 1. 針對韓國 5 個廢棄礦區 (Dukeum, Dongil, 1. 利用 SBET 試驗方法分析各毒性物質之萃取濃度，以 Myungbong. Songchun mines)，調查鄰近礦區附 Songchun mine 之 As 萃取濃度較大，農田與稻田之 As 近農田與稻田之土壤中含砷與其他毒性重金萃取濃度分別為 20.6 mg/kg 與 12.4 mg/kg，皆遠低於總屬物質之全量濃度與萃取濃度。 As 濃度 (196 mg/kg)，估算 As 之 ABF 分別為 11%與 6%。 2. 接著利用萃取濃度，估算人體致癌風險值與非 2. 再者利用 As 萃取濃度估算致癌風險值，發現 Songchun 致癌風險。 mine 相較於其他礦區有較高的致癌風險值為 1.16×10-5，但仍在可接受風險範圍內 (10-6-10-4)，在非致癌風險商數為 3.6，已超過可接受範圍 (1.0)，仍會對人體造成潛在性危害。. Wang et al. (2006). 利用 SBET 試驗方法，調查城市中路邊土壤之含砷與其他毒性重金屬物質 (Cu, Pb, Zn, Ni, Co, Cr) 之全量濃度與生物有效性。. 13. 1. 土壤樣品在胃相中反應 1 小時候後，砷與其他重金屬之生物有效性，以 Pb 較高 (71.7 %)，Cr 最低 (5.6 %)。 2. 雖然 As 含量較 Pb, Cu, Zn 低，但仍可在道路邊被檢測岀，As 萃取濃度與 ABF 分別為 7.5 mg/kg 與 27.3%，其主要來源為媒燃燒所產生。.

(24) Table 2-2 一階段胃相生物有效性體外試驗方法(SBET)之沿革表(續) 參考文獻 Juhasz et al. (2007b). 研究目的. 研究成果. 使用 SBET 試驗方法評估 railway corridor , dip site 1. 提出使用 SBET 試驗方法之理由為，在 pH 值較低之胃與 mine site 三個場址中受 As 污染土壤之生物有效相，其溶解度較大，生物有效性相對較高，從 Rogriguze 性，並探討影響 As 生物有效性之因素。 et al.1999 研究中亦提及，胃相比小腸相較能準確推估動物實驗 RBF (Rogriguze et al., 1999; Kelly et al., 2002)。 2. 研究發現，railway corridor soils 平均 As 之 ABF 為 34 %, dip site soils 平均 As ABF 為 28 %; mine site soils 平均 As ABF 為 24 %，皆小於 50 %，由此表示經由食入受污土壤之暴露途徑，Asu 毒性物質並不會 100 %被人體腸胃道所吸收。 3. 藉由土壤物化特性預測體外 As 之生物有效性，利用迴歸模式發現，在 railway 和 mine site 的土壤與總 As 濃度與總 Fe 含量有良好的線性相關 (r2=0.90 and 0.98)。. Juhasz et al . (2007a) 探討體內豬試驗與 SBET 體外試驗之相關性。. 14. 1. 利用 Juhasz et al. (2007b)所分析之 As ABF 值，從中選取不同土壤之生物有效性範圍為 7 - 75 %，大多小於 50%。 2. 利用體內豬試驗進行相關性比較發現，體外試驗與體內試驗有良好的線性相關，表示體外試驗可以準確預測體內 As RBF (r2=0.92)， 3. 利用上述結果，建議可使用便宜且快速之體外試驗方法取代體內試驗方法。.

(25) 再者，SBET 試驗方法，對於生物有效性表示方法皆以 ABF 值表示，而非以 RBF 值表示，且未建立品管基準，不易與其他試驗方法評比。在 2002 年開始專家學者使用 SBET 試驗方法評估受污土壤中生物有效性，並以生物有效性作為健康風險評估之依據，Kim et al. (2002)與 Lee et al. (2006)為同一研究團隊，針對韓國廢棄礦區，使用 SBET 試驗方法評估受污土壤中含砷與其他毒性重金屬物質 (Cd, Cu, Pb 和 Zn)之全量濃度以及生物有效性。Kim et al. (2002)僅針對韓國某一廢棄礦區 (Duckum mine)，調查鄰近礦區附近農田與稻田之土壤中含砷與其他毒性重金屬物質 (Cd, Cu, Pb 和 Zn)之全量濃度與生物有效性，研究結果發現，農田與稻田之土壤含砷平均全量濃度以農田含量較多，分別為 9.4 mg/kg 與 2.3 mg/kg；平均 As ABF 亦以農田較大，分別為 20.1 %與 17.9 %，表示農夫或當地居民，在長時間暴露情況下，經由食入受污土壤之會造成潛在的健康風險危害。進一步，Lee et al.學者於 2006 年針對韓國 5 個廢棄礦區 (Dukeum, Dongil, Myungbong. Songchun mines)，調查鄰近礦區附近農田與稻田之土壤中含砷與其他毒性重金屬物質之全量濃度與生物有效性，研究結果發現，利用 SBET 試驗方法之 As 萃取濃度以 Songchun mine 較大，農田與稻田之 As 萃取濃度分別為 20.6 mg/kg 與 12.4 mg/kg，皆遠低於總 As 濃度 (196 mg/kg)，本研究估算 As ABF 分別為 11 %與 6 %。再者利用 As 萃取濃度估算致癌風險值，發現 Songchun mine 相較於其他礦區有較高的致癌風險值，但仍在可接受風險範圍內 (10-6-10-4)。綜合上述 Kim et al. (2002)與 Lee et al. (2006)研究團隊之結果發現，As ABF 皆小於 50 % 並且遠小於一般假設 100 %被人體胃腸道所吸收之值，表示在量化風險時，若使用 100 %保守情境則會高估風險。 Wang et al. (2006)研究，利用 SBET 試驗方法，調查城市中路邊土壤 15.

(26) 之含砷與其他毒性重金屬物質 (Cu, Pb, Zn, Ni, Co, Cr)之全量濃度與生物有效性，研究結果發現，雖 As 含量較 Pb, Cu, Zn 低，但仍可在道路邊檢測岀 As 含量，其主要來源為媒燃燒所產生，As 萃取濃度與 ABF 分別為 7.5 mg/kg 與 27.3 %，由此可知 As 來源不僅來自於礦區，媒燃燒也會產生。 Juhasz et al. (2007b), Juhasz et al. (2007a)為同一研究團隊，使用 SBET 試驗方法評估 railway corridor , dip site 與 mine site 三個場址中受 As 污染土壤之生物有效性，並探討影響 As 之生物有效性因素，且進一步驗證體內與體外試驗之可行性。此研究團隊提出使用 SBET 試驗方法之理由，在 pH 值較低之胃相，其溶解度較大，生物有效性相對較高 (Rogriguze et al., 1999; Kelly et al., 2002)，從 Rogriguze et al. (1999)研究中亦提及，胃相比小腸相較能準確推估動物實驗 RBF，因此僅使用 SBET 試驗方法進行評估 As 之生物有效性。 Juhasz et al. (2007a; 2007b )研究發現，railway corridor soils As ABF 為 6 - 89 %,平均 As ABF 為 34 %; dip site soils As ABF 為 9 - 89 %,平均 As 之 ABF 為 28 %; mine site soils As ABF 為 5 - 36 %，由結果可知，不同場址中，As ABF 均小於 50 %，表示經由食入途徑暴露到受污土壤，並不會 100%被人體腸胃道所吸收，若進行風險評估量化時，使用保守情境選用 100 %，則會高估風險，產生不確定性且會增加整治成本。此研究亦提及，可藉由土壤物化特性預測體外 As 之生物有效性，利用迴歸模式發現，在 railway 和 mine site 的土壤與總 As 濃度以及總 Fe 含量有良好的線性相關 (r2=0.90 and 0.98)。再者進一步選取 20 個不同土壤之生物有效性其範圍為 7 - 75 %，利用體內豬試驗進行相關性比較發現，體外試驗與體內試驗有良好的線性相關，表示體外試驗可以準確預測體內 As 之生物有效性 (r2=0.919)，如 Figure 2-2 所示，因此可以利用便宜且快速之體外試驗方法. 16.

(27) 取代體內試驗應是可行的，並應用於人體健康風險評估上。. Figure 2-2 比較不同土讓中體內 (in vivo swine assay)與體外 (in vitro SBET assay)試驗相關性 (Juhasz et al., 2007a) Figure 2-1 與 Table 2-3 為本研究進一步彙整二階段胃腸相與一階段胃相 (SBET)生物有效性體外試驗結果，並比較於不同土壤中砷 RBF 與 ABF，在 Table 2-3 中，由於 SBET 試驗方法皆以 ABF 表示，為能與 SBET 進行比較，本研究將二階段胃腸體外試驗皆以 ABF 值表示，僅 Rodriguez et al. (1999)與 Bruce et a.l (2007)此研究以 RBF 值表示除外。Table 2-1 結果顯示，受污場址中砷污染土讓 As 之 RBF 範圍為 3 - 55 %; Table 2-3 結果顯示不同體外試驗與受污場址中不同土壤來源之胃相砷 As ABF 範圍為 4 - 55 %，由此可知，受污土壤中，不同土壤之生物有效性變異範圍很大，可能受到上述礦物型態與土壤特性等因素所影響。而且大多數研究中，As 之 ABF 與 RBF 均小於 50 %，且生物有效性顯著小於 100 %，表示當人們經由食入土壤之暴露途徑，土壤中所含砷之總濃度並不會全部被人體胃腸道所吸收，因此當量化健康風險時，As 生物有效性若假設 100 %被人體胃腸道所吸收，則會高估風險，增加整治成本。 17.

(28) Table 2-3 文獻中不同土壤來源之胃相 As 之 ABF 比較表土壤來源. 胃相 As ABF (%). 參考文獻. SBET 試驗方法 mining site soils. 13 %-42 %. paddy soils. 6 %-18 %. farmland soils. 11 %-20 %. urban roadside soils railway corridor soils cattle tick dip site. 27 % 34 % 28 %. Casteel et al., 2001; 2003 Juhasz et al., 2007 Kim et al., 2002 Lee et al., 2006 Kim et al., 2002 Lee et al., 2006 Wang et al., 2006 Juhasz et al., 2007b Juhasz et al., 2007b. 二階段胃腸生物有效性體外試驗方法 mining site soils. 4 %-48 %. copper smelter near CCA-Treated Utility Poles. 34 %-55 % 36 %. Hamel et al., 1998 Rodriguez et al., 1999 張，2005 Bruce et al., 2007 Ruby et al., 1996 Pouschat et al., 2006. 綜合上述所言，美國從 1992 年開始研究生物有效性體外試驗至今已超過 10 年，由於體內試驗需要花費較多的成本與時間，因此各專家學者著重於體外試驗的研發，並進一步驗證體外與體內試驗之相關性，以期能利用體外試驗正確評估體內試驗，並且更嘗試將二階段胃腸生物有效性簡化為一階段胃相生物有效性體外試驗，以作為風險評估的依據，期能降低受污場址之整治成本。. 18.

(29) 2-3 評析不同生物有效性體外試驗方法生物有效性體外試驗方法，從 1992 年研究至今已超過十年，最終目的為能更精確研擬岀一套模擬人體胃腸環境的體外試驗方法，各體外試驗方法已詳細考量人體胃腸生理參數且趨於一致 (Davls et al., 1992; Hamel et al., 1998; Ruby et al., 1996; Rodriguez et al., 2003; Pouschat et al., 2006; Juhasz et al., 2007 et al.)。然而，近幾年有專家學者將二階段胃腸生物有效性體外試驗簡化至一階段胃相生物有效性體外試驗，以期能簡化試驗程序 (Kim et al., 2002; Lee et al., 2006; Wang et al., 2006; Jahasz et al., 2007; Simth et al., 2008)。本研究統整並評析文獻中各體外試驗方法，大致上可歸類為 PBET、IVG、SBET 等三種體外試驗方法，Table 2-4 至 Table 2-6 分別說明各試驗方法中參數異同處，本研究特別著重於萃取液前處理方法，並統整前期研究 (張，2005)體外試驗方法進行簡化說明，如 Table 2-7 所示。再者，進一步評析各體外試驗方法之品管基準，如 Table 2-8 所示。根據以上描述，分項說明如下： 2-3-1 PBET 試驗方法 PBET 體外試驗方法其全名為 physiologically based extraction test，指以生理學為基礎的萃取方法，為兩階段連續萃取以測定人體胃腸環境之生物有效性，特別選用孩童 (<7 歲)此敏感性族群作為研究對象，且容易因手指沾染而誤食土壤為暴露途徑 (Ruby et al., 1993)。 Table 2-4 為近幾年文獻中採用 PBET 體外試驗方法之參數比較表，本研究將試驗參數分為四部分說明，第一部分為樣品前處理、反應槽體型式、樣品重量及食物添加，反應槽體型式包括有效容積、溫度、厭氧及攪拌方式。在樣品前處理部份，樣品粒徑的大小會直接影響生物有效性的試驗結果 Ruby et al. (1999)，Ruby et al. (1993, 1996)與 Bruce et al. (2007) 均選用土壤樣品粒徑小於 250 μm，其原因為體外試驗是模擬人類經由食. 19.

(30) Table 2-4. PBET 體外試驗方法之參數比較表 Ruby et al. (1993). Ruby et al. (1996). Bruce et al. (2007). 樣品前處理. 50℃烘乾過篩<250 μm. 50℃烘乾過篩<250 μm. 50℃烘乾過篩<250 μm. 反應槽型式. 250 mL 燒杯. 有效容積. 40 mL. 40 mL. 40 mL. 水浴 37℃. 水浴 37℃. 水浴 37℃. 厭養方式. 無使用. 1.0 L/ min 氬氣. 0.7 L/ min 氬氣. 攪拌方式. wrist-action shaker. 底座 70 μm 網狀曝氣. 不鏽鋼閥曝氣. 4 gm. 0.4 gm. 0.4 gm. 無使用. 無使用. 無使用. pH. 1.3. 空腹 1.3; 平均 2.5; 進食 4.0. 空腹 1.3; 平均 2.5; 進食 4.0. 液固比(mL/gm). 10:1. 100:1. 100:1. 相關文獻試驗參數. 溫度. 樣品重量食物. 250 mL PE 分液漏斗 120 mL 玻璃圓底管. 胃相萃取. 胃液成分. 排空率. 1.25 g pepsin, 12.5 g sodium citrate, 12.5 g malic acid , 10.5 mL lactic acid 12.5 mLacetic acid 2 hr. 1.25 g pepsin, 0.5 g sodium citrate, 0.5 g malic acid , 420 μL lactic acid 500μL acetic acid 1 hr. 1.25 g pepsin, 0.5 g sodium citrate, 0.5 g malic acid , 420 μL lactic acid, 500μL acetic acid 1 hr. 小腸相萃取 pH. 7.0. 7.0. 7.0. 1.75 gm/L bile, 0.5 gm/L pancreatin. 1.75 gm/L bile, 0.5 gm/L pancreatin. 1.75 gm/L bile, 0.5 gm/L pancreatin. 吸附劑. 無使用. 無使用. 無使用. 輸送率. 2 hr. 4 hr. 1hr and 3hr. 離心. 2100×g, 25 min. 2100 ×g, 25 min. 10000×g, 15 min. 過濾. 無使用. 無使用. 0.22μm. AAS. ICP-AES. ICP-MS. 小腸液成分. 萃取液前處理. 分析方法. 20.

(31) 入暴露途徑進入體內，而粒徑< 250 μm 較容易沾黏於手指而有誤食現象。在反應槽體型式上，均使用不同槽體進行體外試驗，分別有 250 mL 燒杯、250 mL 底座為 70 μm 網狀的 PE 分液漏斗 (Ruby et al., 1993; 1996) 如 Figure 2-3 所示，以及 120 mL 玻璃圓底管 (Bruce et al., 2007)如 Figure 2-4 所示。在溫度控制上，為模擬人體溫度，則利用水浴方式溫度為 37 ℃ 無疑義。為模擬胃腸環境以維持厭氧狀態，Ruby et al. (1996)與 Bruce et al. (2007)皆利用氬氣曝氣方式。在攪拌方式上，為模擬胃腸蠕動情況，Ruby et al. (1993; 1996)與 Bruce et al. (2007)均使用不同的攪拌方式將胃腸相液體與樣品混合攪拌，在 1996 年 Ruby et al.修正 1993 年的攪拌方式，採用 PE 分液漏斗下方孔隙通入氬氣進行曝氣將其內容物混合攪拌，2007 年 Bruce et al.則將氬氣曝氣方式改由上方通入氣體，操作方式較為簡單。. Figure 2-3 250 mL 底座為 70 μm 網狀 PE 分液漏斗反應槽示意圖 (Ruby et al., 1996). 21.

(32) Figure 2-4 120 mL 玻璃圓底管反應槽示意圖 (Bruce et al.,2007) 第二部分為探討胃相萃取環境，包括胃液 pH 值、胃液成分、液固比及胃排空時間，第三部份為探討小腸環境，包括小腸液 pH 值、小腸液成分、吸附劑的使用及小腸輸送時間。此兩部份生理參數皆趨於一致，如胃腸相 pH 值與酵素成分、液固比以及在小腸相中不使用吸附劑等。然而，在生理學理論上，胃液 pH 值範圍為 1.0 - 5.0，在空腹時胃液 pH 值較低 pH 1.7 - 2.0，進食後 pH 值則提高至 pH 4.0 - 5.0；小腸相由十二指腸、空腸與迴腸所組成，pH 值由一開始弱酸至反應完畢則趨於中性，其所需的時間與 pH 值分別為十二指腸：30 - 45 分鐘，pH 4.0-5.5; 空腸：1.5 - 2 小時，pH 5.5-7.0；迴腸：5 - 7 小時，pH 7.0-7.5，如 Figure 2-5 所示 (李， 1991; Oomen et al., 2002; Intawongse et al., 2006)。然而，比較文獻中胃相於空腹 pH 1.3 與進食 pH 4.0 與平均 pH 2.5 之 ABF 其結果發現，當 pH 越低 ABF 亦越低，顯示 pH 會影響生物有效性 (Ruby et al. 1996；Bruce et al., 2007)。另外，在胃相排空率與小腸相輸送率上，Ruby et al. (1996)提及 1 小時的胃排空時間上便可消化約 80-90 %的食物，因此可在後期 Bruce et 22.

(33) al. (2007)研究中得知，胃相排空率則採用 1 小時為反應時間；在小腸相輸送時間上較不一致，文獻中範圍為 1 - 4 小時，可能以消化液流經小腸至大腸所需的時間做為小腸輸送時間。第四部份為萃取液前處理方式與分析方法，僅 Bruce et al. (2007)使用高速離心再過濾 (孔徑 0.45μm)兩步驟前處理方式，以去除萃取液中懸浮物使分析樣品較澄清，避免上機時懸浮物阻塞孔徑影響分析結果，儀器分析上分別以 ICP-MS、ICP-AES 與 AAS 進行分析，而 ICP-AES 較適合分析高濃度物質，反之 ICP-MS 適合分析低濃度物質且感度較好，偵測極限低。. Figure 2-5 人類胃腸道在不同部位之停留時間與 pH 值 (修改 Dean et al., 2007). 23.

(34) 2-3-2 IVG 試驗方法 IVG 體外試驗方法其全名為 In-vitro gastrointestinal method 為模擬人體胃腸環境，此體外試驗方法文獻中大多探討土壤中砷或者含砷之礦渣、農藥等物質殘留於土壤中之生物有效性，且文獻中亦提及 IVG 試驗方法較 PBET 試驗方法與動物試驗有良好的線性關係 (胃相：R=0.83 vs. 0.51；小腸相：R=0.82 vs.0.75 )，並且進一步探討胃相中加入食物 (如麵糰)與小腸相中加入吸收劑模擬吸收作用對砷之生物有效性影響。 (Podriguez et al., 1999; Wragg et al., 2002; Sarkar et al., 2003; Pouschat et al., 2006)。 Table 2-5 為近幾年文獻中採用 IVG 體外試驗方法之參數比較表，本研究將試驗參數分為四部分說明，第一部分為樣品前處理、反應槽體型式、樣品重量及食物添加。在樣品前處理部份，均選用土壤樣品粒徑小於 250 μm。在反應槽體型式及溫度上，Rodriguze et al. (1999)與 Schroder et al. (2004)均使用玻璃材質容積為 1L 的反應槽體如 Figure 2-6 所示，以及 250 mL 燒杯 (Pouschat et al., 2006)與 500 mL 血清瓶 (張，2005)。在溫度控制上，則利用水浴方式溫度為 37 oC。再者，除前期研究 (張，2005) 外，皆利用惰性氣體氮氣或氬氣曝氣方式以及機械式攪拌方式為模擬胃腸之厭氧環境並使胃腸相液體與樣品混合攪拌，在前期研究 (張，2005) 為使用密閉式反應槽體，因此不進行厭氧方式，並使用磁力攪拌方式較機械式攪拌更有效控制攪拌強度。第二部分為探討胃相萃取環境，包括胃液 pH 值、胃液成分、液固比及胃排空時間，第三部份為探討小腸環境，包括小腸液 pH 值、小腸液成分、吸附劑的使用及小腸輸送時間。由 Table 2-5 可知，此兩部份生理參數，除液固比與小腸相吸附劑外，其餘參數皆一致。在液固比部分，僅前期研究 (張，2005)使用高液固比 1000:1 mL/gm，其餘皆使用較低液固. 24.

(35) Table 2-5 IVG 體外試驗方法之參數比較表 Rodriguze et al. (1999). Schroder et al. (2004). 張等 (2005). Pouschat et al. (2006). 樣品前處理. 風乾過篩 <250 μm. 風乾過篩 <250 μm. 風乾過篩 <250 μm. 風乾過篩 <300 μm. 反應槽型式. 1 L canning jar. 1 L glass jar. 500 mL 血清瓶. 250 mL 燒杯. 600 mL. 600 mL. 500 L. 150 mL. 水浴 37℃. 水浴 37℃. 氣控式 37℃. 水浴 37℃. 厭養方式. 1.0 L/min 氮氣. 氬氣. 無使用. 氬氣. 攪拌方式. 100 rpm 機械攪拌. 100 rpm 機械攪拌. 磁力攪拌. 100 rpm 機械攪拌. 4 gm. 4g. 0.5 gm. 1 gm. 200 gm dough. 200 gm dough and no dough. 無使用. 無使用. 1.8. 1.8. 1.8. 1.8. 150：1. 150:1. 1000:1. 150:1. 0.15 M NaCl , 1% pepsin 1 hr. 0.15 M NaCl , 1% pepsin 1 hr. 0.15 M NaCl , 1% pepsin 1 hr. 0.15 M NaCl , 1% pepsin 1 hr. 5.5. 5.5. 5.5. 5.5. 吸附劑. 0.35 gm/L bile, 3.5 gm/L pancreatin iron hydroxide gel. 2.10 gm/L bile, 0.21gm/L pancreatin 無使用. 1.75 gm/L bile, 0.175 gm/L pancreatin 無使用. 3.3 gm/L bile, 0.33 gm/L pancreatin 無使用. 輸送率. 1 hr. 1 hr. 1 hr. 1 hr. 離心. 10000 rpm, 15 min. 5211×g, 15 min. 3500 rpm, 15 min. 無使用. 過濾. 0.45 μm. 0.45μm. 0.45μm. 0.45μm. 分析方法. ICP-HG. ICP-AES. ICP-AES. ICP-MS. 相關文獻試驗參數. 有效容積溫度. 樣品重量食物胃相萃取 pH 液固比 (mL/gm) 胃液成分排空率小腸相萃取 pH 小腸液成分. 萃取液前處理. 25.

(36) Figure 2-6 Canning jar 反應槽示意圖 (Rodriguze et al., 1999) 比 150:1 mL/gm，然而，文獻中提及不同介質中污染物之溶解度為影響生物有效性之重要參數之一，其溶解度與液固比有關，當人體在飢餓空腹狀態時較傾向於高液固比 (Ruby et al., 1999)。Hamel et al. (1998)研究以美國 NIST 2710 標準土讓與 Jersey City 土壤進行胃腸體外試驗比較不同液固比 (100:1 至 5000: 1 mL/gm)對生物有效性之影響，研究結果發現， NIST 2710 土壤樣品於不同液固比時，砷對生物有效性影響較小，但在 Jersey City 土壤中，砷 ABF 會隨液固比升高而增加 (R=0.76)，因此選擇液固比間 (100:1 至 5000: 1 mL/gm)As ABF 差異較小，介於+12 %與-9 % 之 1000:1 mL/gm 當作建議值，如 Figure 2-7 所示。本研究將於後續研究確認 1000:1 mL/gm 液固比當作建議值是否可行。在小腸相吸收劑部分，吸收劑以模擬小腸之吸收作用，Rodriguze et al. (1999)比較污染物砷於 IVG 與 IVG-AB 試驗方法中，體外試驗與體內豬試驗之相關性，IVG-AB 是指使用吸收劑對以類似茶包 (tea bag)做為吸附袋將其懸掛在反應瓶中，內含有 iron hydroxide gel (由 0.65 M FeCl3 溶液以 2.7 M NH4OH 中和至 pH 6.0 製備而成)，研究結果發現，IVG 與 IVG-AB 體外試驗方法中，小腸相砷 ABF 與體內豬試驗砷 RBF 呈線性關係 R 值分別為 0.82 (IVG) 26.

(37) 與 0.79 (IVG-AB)，表示使用吸附劑以改善吸附效果，對生物有效性影響不大，因此可從 Table 2-4 可發現，往後研究中皆不使用吸收劑進行體外試驗。第四部份為萃取液前處理方式與分析方法，IVG 試驗方法中，大多皆採用高速離心再過濾 (孔徑 0.45 μm)此兩步驟前處理方式，最後則選擇 ICP-HG、ICP-AES 與 ICP-MS 等儀器進行分析。. Figure 2-7 在 Jersey City 土壤中，不同液故比與砷 ABF 關係 (Hamel et al., 1998). 27.

(38) 再者，比較 IVG 體外試驗方法與 PBET 試驗方法，在胃液成分與胃腸相 pH 值上，IVG 體外試驗方法僅使用 0.15 M NaCl 與 1 % pepsin 備製較 PBET 試驗方法簡單，於小腸相中使用較低之 pH 值為 5.5，相對砷之生物有效性也較 PBET 試驗方法高，但是儘管 pH 5.5 較 PBET 方法 pH 7.0 之萃取效率較高如 Figure 2-8 所示 (Rodriguze et al., 1999)，但 IVG 試驗方法大多研究僅探討砷之有毒物質，若應用到其他重金屬物質仍有疑慮。在胃相排空率與小腸相輸送率上，反應時間 IVG 試驗方法較 PBET 試驗方法一致皆採用 1 小時反應時間，因此本研究將進一步探討使用 1 小時作為反應時間是否可行。. (pH 5.5 ). 16. As ABF (%). 12. 14.8. 15.3. (pH 7.0). 8.3 8. 4. 0 PBET. IVG. IVG-AB. 小腸相中不同體外試驗方法. Figure 2-8 比較礦區土壤於不同體外試驗方法之小腸相砷 ABF. 28.

(39) 2-3-3. SBET 試驗方法. SBET 體外試驗方法其全名為 Simplified Bioaccessibility Extraction，此方法為一單相萃取程序僅模擬人體胃相環境，為簡化 PBET 體外試驗方法，近幾年研究學者利用此方法針對礦區場址中受鉛 (Pb)與砷 (As)污染之土壤進行風險評估 (Ruby et al., 1996; Oomen et al., 2002; Kelly et al., 2002; Juhasz et al., 2007a; Smith et al., 2008)。過去 Ruby et al. (1993; 1996; 1999)研究團隊利用 PBET 試驗針對在礦區中受鉛污染之土壤進行體外與體內試驗，研究發現鉛 RBF 與動物實驗呈線性相關 (R=0.96)，藉由此研究結果，Drexler (1999)學者進一步將 PBET 試驗方法簡化為 SBET 試驗方法並建立標準操作程序。接著，近幾年 Jahasz et al. (2007a)研究團隊，則利用 SBET 試驗方法比較礦區中受 As 污染之土壤體外與體內試驗，研究結果亦發現 As ABF 與動物實驗呈線性相關 (R=0.96)。 Table 2-6 為近幾年文獻中採用 SBET 體外試驗方法之參數比較表，本研究將試驗參數分為三部分說明，第一部分為樣品前處理、反應槽體型式、樣品重量及食物添加。在樣品前處理部份，均選用土壤樣品粒徑小於 250 μm。在反應槽體型式及溫度上，分別有兩種反應槽體為廣口 HDPE 瓶 (Kim et al., 2002; Lee et al., 2006; Wang et al., 2006)以及 125 mL 聚乙烯螺釘帽燒瓶 (Juhasz et al., 2007; Simth et al., 2008)，後者反應槽體係參考 Drexler (1999)與 Kelly et al. (2002)學者所使用之反應槽體如 Figure 2-9 所示，皆為開放式反應槽體。在溫度控制上，利用水浴方式溫度為 37 ℃。在體外試驗過程中不進行厭氧方式並使用 30 rpm 或 40 rpm 的連續攪拌方式使胃液與樣品混合攪拌。第二部分為探討胃相萃取環境，包括胃液 pH 值、胃液成分、液固比及胃排空時間，此部分生理參數皆一致，胃相 pH 為 1.5，使用低液固比 100:1 mL/gm，胃液成分僅使用氨基乙酸 (glycine)，反應 1 小時。最後在萃取液前處理與分析方法上，僅將萃取液進行過濾 29.

(40) Table 2-6. SBET 體外試驗方法之參數比較表. 相關文獻試驗參數. Lee et al. (2006) 風乾過篩 <180 μm. Wang et al. (2006) 風乾過篩 <200 μm. Juhasz et al. (2007b) 風乾過篩 <250 μm. Simth et al. (2008) 風乾過篩 <250 μm. 水浴 37℃. 水浴 37℃. 水浴 37℃. 水浴 37℃. 水浴 37℃. 厭養方式. 無使用. 無使用. 無使用. 無使用. 無使用. 攪拌方式. 30 rpm end-over-end rotation 1 gm. 30 rpm end-over-end rotation 1 gm. 30 rpm end-over-end rotation 1 gm. 40 rpm 連續攪拌器. 40 rpm 連續攪拌器. 1 gm. 1 gm. 無使用. 無使用. 無使用. 無使用. 無使用. 1.5. 1.5. 1.5. 1.5. 1.5. 100:1. 100:1. 100:1. 100:1. 100:1. 30.02 gm/L glycine 1 hr. 30.02 gm/L glycine 1 hr. 30.02 gm/L glycine 1 hr. 30.02 gm/L glycine 1 hr. 30.02 gm/L glycine 1 hr. 離心. 無使用. 無使用. 無使用. 無使用. 無使用. 過濾. 0.45 μm. 0.45 μm. 0.45 μm. 0.2 μm. 0.22 μm. ICP. HG-AAS. ICP-MS. ICP-MS. ICP-MS. 樣品前處理反應槽型式有效容積溫度. 樣品重量食物. Kim et al. (2002). 風乾過篩 <180 μm wide-mouthed wide-mouthed wide-mouthed 125 mL 聚乙 125 mL 聚乙 HDPE bottle HDPE bottle HDPE bottle 烯螺釘帽燒瓶烯螺釘帽燒瓶 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL. 胃相萃取 pH 液固比(mL/gm) 胃液成分排空率萃取液前處理. 分析方法. 30.

(41) (孔徑 0.2 μm 與 0.45 μm)前處理步驟。綜觀以上三種不同體外試驗方法之萃取液前處理步驟發現並沒有一致，SBET 體外試驗方法相較於 PBET 與 IVG 試驗方法上省略離心此步驟。鑒於此，本研究將進一步探討萃取液前處理方式是否會影響分析結果以簡化萃取液前處理方式。在儀器分析上 SBET 試驗方法大多使用 ICP-MS 進行分析。. Figure 2-9 125 mL wide-mouth high-density polyethylene (HDPE) bottle 反應槽及攪拌設備示意圖 (Drexler, 1999; Kelly et al., 2002). 31.

(42) 2-3-4 體外試驗方法簡化說明綜觀國外文獻，對於生物有效性體外試驗程序過於複雜且試驗過程中所需的成本高且操作上較費時，因此較不被我國研究學者與業界所重視，鑒於此，本研究綜合上述各節中探討不同體外試驗方法之參數，其生物有效性體外試驗方法主要參考前期研究 (張，2005)的二階段體外試驗程序，特別著重於設備與程序上簡化，設備簡化上包含反應槽設計、溫度控制、攪拌方式與厭氧方式；程序簡化上包含小腸相吸附劑使用、小腸相萃取時間與萃取液前處理步驟，簡化說明如 Table 2-7 所示，本研究將分述如下： (1) 設備簡化部份： A. 反應槽體設計：在不同體外試驗方法研究中，反應瓶組之設計大多採用開放性的試驗設備，分別有 250 mL 燒杯、PE 分液漏斗、玻璃圓底管、廣口 HDPE 瓶等反應瓶，如 Figure 2-3、2-4、2-6 與 2-9 所示，然而前期研究 (張， 2005)則使用密閉系統之反應瓶組 (500 mL 血清瓶)作為體外試驗之反應槽體設備如 Figure 2-10 所示，不僅操作上較為簡易且不易使得待測樣品中有毒物質 (如 Pb、As 等)逸散至空氣中。本研究為安全起見，將文獻中開放性系統之反應槽體設備簡化為使用密閉性系統之反應槽 (500 mL 血清瓶)設備。 B. 溫度控制：在不同體外試驗方法研究中，對於溫度控制上為模擬人體溫度 37 o. C，皆使用水浴方式維持人體溫度，但缺點為在實驗過程中不利於觀. 察與採樣，因此本研究將水浴溫控簡化為氣控式溫控方式，以維持人體溫度。. 32.

(43) Figure 2-10 本研究群前期研究設計之反應槽體與氣體溫度控制室示意圖 (張，2005). 33.

(44) C. 攪拌方式：攪拌方式為模擬人體胃腸蠕動情況，文獻中多以機械式或通入氣體之攪拌方式，將胃腸液與待測樣品進行攪拌混合，但是不適用於密閉式系統之反應槽體。再者，文獻中使用機械式攪拌方式較容易使得待測污染物質在攪拌過程中液散出來，而前期研究 (張，2005)中使用磁力攪拌方式相較於文獻中攪拌方式，不僅操作簡單、成本低且可以有效的控制攪拌強度，因此本研究將文獻中大多使用機械式攪拌方式簡化為磁力攪拌方式進行攪拌混合，文獻中也未說明各種攪拌方式效能是否能正確的評估胃腸蠕動情況。 D. 厭氧方式：在厭氧方式上，文獻中使用厭氧條件其目的為模擬人體胃腸環境，大多使用惰性氣體氮氣或氬氣曝氣方式維持厭氧狀態，但於整個試驗過程中必須不斷供應氣體，隨反應時間拉長所消耗的氣體量相對增加，成本也會相對提高，在 SBET 試驗方法中可發現，已不使用厭氧方式進行體外試驗且在不進行厭氧方式下，As ABF 與動物實驗也呈線性相關 (R=0.96) (Jahasz et al., 2007a)。再者維持厭氧條件是否能有效提昇試驗之準確性，仍待進一步研究，因此，本研究不使用惰性氣體方式維持厭氧方以簡化試驗方法。 (2) 程序簡化部份： A. 小腸相吸附劑：小腸相吸附劑使用開始於 Rodriguze et al. (1999)，於 IVG 試驗方法中，使用吸附劑以模擬小腸相吸收作用，但不易評估是否能正確模擬小腸吸收，且一般而言，體外試驗均低估動物試驗，再者近幾年使用 IVG 方法皆不使用吸附劑即假設吸收率為 100 %，因此，本研究亦不使用吸附劑以簡化試驗程序。 34.

(45) B. 小腸相萃取時間：在不同體外試驗方法研究中，僅 PBET 試驗方法對於小腸相萃取時間上較不一致介於 1-4 小時，而 IVG 試驗方法則以 1 小時為反應時間，在前期研究 (張，2005)中，進行小腸相 11 小時萃取時間每隔 1 小時取樣，研究結果隨小腸相反應時間增加，總砷濃度沒有太大差異，因此以 1 小時做為小腸相萃取時間應達完全反應。根據此結果，本研究將小腸相萃取時間簡化為 1 小時，但由於前期研究之小腸相 pH 值與本研究不同，因此將再進一步探討小腸相 pH 7.0 之萃取時間簡化為 1 小時之可行性。 C. 萃取液前處理：在體外試驗研究中，萃取液前處理部份，大多使用高速離心再過濾方式，以去除萃取液中懸浮物，使其較為澄清以避免樣品於上機時阻塞孔徑或產生干擾，影響分析結果，但從前期研究 (張，2005)中觀察到，進行過濾時萃取液在擠壓過程中，壓阻會逐漸上升而導致不易擠壓，需耗費較大的人力使能完成過濾步驟，鑒於此，本研究將萃取液前處理方法簡化為僅使用高速離心方式取代壓阻過高之過濾方式，並且針對此問題，進一步探討離心再過濾與僅離心之前處理方式對總砷濃度之影響。. 35.

(46) Table 2-7 本研究生物有效性體外試驗設備與程序簡化表簡化參數. 文獻參數. 本研究參數. 簡化說明. 設備反應槽設計. 分液漏斗、燒杯密閉式 500 mL 1. 文獻中於反應槽體設計或廣口 HDPE 血清瓶較本研究操作複雜。 2. 較文獻中開放式反應槽瓶可以減少污染物逸散。. 溫度控制. 水浴 (37 oC). 氣控式(37 oC). 1. 文獻中使用水浴溫控方式模擬人體溫度較本研究利用密閉式氣控溫控方式利於實驗進行中觀察與採樣。. 攪拌方式. 機械式攪拌或通入氣體. 磁力攪拌. 1. 以模擬胃蠕動情況，文獻中多使用機械攪拌方式，操作複雜且成本高，也未必能確實模擬胃腸蠕動情況。 2. 本研究使用磁力攪拌可有效控制攪拌強度，不僅操作簡單且成本低。. 厭氧方式. 利用氮氣或氬氣. 不使用. 1. 文獻中使用惰性氣體維持厭氧狀態，反應時間拉長，所需氣體量相對增加，成本也會提高。 2. 在 SBET 試驗中，已不使用厭氧方式進行體外試驗時。. 以類似茶包做吸附袋內含有 iron hydroxide gel. 不使用. 1. 吸附劑為模擬小腸相吸收作用，文獻中提及使用吸附劑不易評估是否能正確模擬小腸相吸收。 2. 近幾年研究學者也未使用吸附劑，因此本研究不使用吸附劑以簡化試驗程序。. 程序小腸相吸附劑. 36.

(47) 小腸相萃取時間. 萃取液前處理. 1-4 小時. 1 小時. 1. 乳糜由賁門到迴腸需 1~7 小時，文獻中近幾年研究皆縮短至 1 小時。 2. 張(2005)進行小腸相 11 小時萃取時間發現，隨小腸相反應時間增加，總砷濃度無太大差異，則以 1 小時做為小腸相萃取時間應達完全反應。. 離心 3500 rpm 離心 3500 rpm， 1. 文獻中大多進行離心再過濾之前處理步驟，過濾與 10000 rpm， 15 min 方式，於擠壓過程中，壓 15 min，再以阻會逐漸變大不易擠 0.2 或 0.45 μm 壓，需耗費較大的人力。進行過濾 2. 利用高速離心方式，應可有效將萃取液之懸浮物沉澱至底部。. 37.

(48) 2-3-5 體外試驗之品管基準在不同體外試驗方法研究中，大部分的文獻普遍未使用標準參考物質 (SRM)，如砷酸鈉或標準土壤，以建立系統品管基準，以致於無法評比不同體外試驗之萃取效率。僅有部分文獻 (Hamel et al., 1998; Eillckson et al., 2001; Pouschat et al., 2006; 張，2005)使用 SRM 進行品管基準，文獻中常用的標準參考土壤有兩種分別為 NIST 2710 與 NIST 2711 (Natinal Institute of Standard and Technology, NIST)，NIST 標準土壤含有相同的土壤基質與物化特性，其粒徑< 74 μm，土壤中含有多種的重金屬物質其全量濃度已被公認，並且被各研究室所使用。以砷 (As)為例，NIST 2710 與 NIST 2711 全量濃度分別為 626±38 mg/kg 與 105±8 mg/kg，NIST 2710 之濃度認證如附錄二所示。本研究探討文獻中使用 NIST 2710 之標準土讓進行體外試驗之萃取效率，如 Table 2-8 所示。從表中可知，不同體外試驗方法其胃相 ABF 範圍為 28 - 69 %，小腸相 ABF 範圍為 25 - 66 %，皆以 Eillckson et al. (2001) 使用之體外試驗方法萃取效率最高，Pouschat et al. (2006)使用之體外試驗萃取效率最低，進一步探討文獻中體外試驗之參數，其可能原因為受胃相 pH 值與液固比所影響。在 Eillckson et al. (2001)研究中發現，不僅胃相 pH 值較低 (pH 1.4)且液固比最高 (2000:1)，在 pH 值較低之胃相，土讓中有毒物質較容易被溶解於胃液中，ABF 相對較高且此研究為三相 (唾液-胃相-小腸相)萃取方法可能會增加萃取效率。從 Hamel et al. (1998) 研究可知當液固比越高砷 ABF 也越高，且從 Pouschat et al. (2006)研究中發現，胃相 pH 值較高 (pH 1.8)與液固比較低 (150:1)的現象，因此萃取效率較其他研究低。再者，比較液固比相同 (1000:1)之 Hamel et al. (1998) 與張 (2005)研究中發現，胃相中砷 ABF 分別為 48 %與 39 %，但前者研究雖然萃取效率高但並未告知胃相 pH 值，導致無法與後者研究做評比。. 38.