2-1 骨骼肌細胞株 (C2C12) 之培養流程
本實驗使用的骨骼肌細胞自食品工業發展研究所生資中心 (bioresource collection and research center, BCRC) 為老鼠的肌母細胞 (myoblast) 株 C2C12 (BCRC number: 60083, ATCC number: CRL-1772)，在培養的過程中變更培養液就 可以使肌母細胞分化成肌小管細胞 (myotube)，是一個常用來研究骨骼肌表現的 細胞株。培養的步驟如下：
步驟1：培養液的配製。C2C12 培養液分為分化前與分化後兩種，分化前的培養 液是由 500 ml 的 DMEM (11965, Invitrogen, U.S.A.) 加入 10% 胎牛血 清 (FBS, 26140, Invitrogen, U.S.A.) 及 1% 青黴素-鏈黴素溶液 (PS, 10378, Invitrogen, U.S.A.)混合均勻。分化後的培養液是將 10% 胎牛血 清改成 10% 馬血清 (Horse serum, HS, 16050, Invitrogen, U.S.A.)即可。
步驟 2：將細胞解凍後加入分化前培養液至 5 ml，並移至 25T 長頸瓶 (flask, 353108, BD Falcon, U.S.A.) ， 最 後 移 到 37oC ， 5% CO2 的 培 養 箱 (Incubator, NU-5500, Nuaire, U.S.A.)。
步驟 3：持續培養細胞 2~3 個繼代，讓細胞生理活性與機能回覆到正常的狀態 (圖 2-1(a))，以細胞密度 105 個 / ml 將細胞種植到玻璃式培養皿 (glass bottom culture dishes, P35GCol-1.5-14-C, MatTek Corporation, U.S.A.)。
步驟4：當細胞達到培養盤面積 60~70% 時 (約兩天) 將培養液置換成分化後的
培養液，刺激肌母細胞分化。之後每兩天需要更新分化後培養液，持續 5~7 天就會有肌管細胞的生成。圖 2-1 (b) 是分化 10 天後肌管細胞的形 貌。肌肉細胞會從單核的肌母細胞演變成多核的肌管細胞，細胞的形貌 也由紡錘狀轉為長柱狀。
(a) (b)
圖 2-1 骨骼肌細胞影像
(a) 肌母細胞。 (b) 肌管細胞。將肌母細胞培養在分化後培養液 10 天後的影 像。兩種時期細胞的個體大小差異很大，並且形貌上會從紡錘狀轉變成柱狀形。
2-2 雞胚胎心肌細胞 (chicken embryo cardiomyocyte) 之培養流程
實驗上使用的細胞為初代培養細胞 (primary cell culture)39。與細胞株不同的 地方在於初代培養細胞是直接從生物體中取出的細胞，他的形貌、狀態與活性更 接近活體但是缺點是細胞只能培養一小段時間，因此必須時常從生物體上取用。
步驟1：製備培養液 Barry’s salt solution。由五種不同的溶液混合成。以下為此 五種溶液的配方：
Solution A (500 ml): NaCl 33.895 g + KCl 440 mg + MgSO4 481.5 mg + NaH2PO4 600 mg + 500 ml H2O
Stock solution (50 ml):
1. KCl (2.0 M) : 7.45 g 2. CaCl2 (0.2 M) : 1.11 g 3. Glucose (10X) : 5 g 4. NaHCO3 (7.5 %) : 3.75 g
最後將 50 ml Solution A + 12.34 ml solution 4. + 0.33 ml solution 1. + 5 ml solution 3. + 380 ml H2O 混合均勻，再將 2.175 ml solution 2.加入 50ml H2O，緩緩滴入上述溶液，配出 500 ml 的 Barry’s salt solution。
步驟2：由雞蛋尖端處敲碎蛋殼，倒出受精後第 11 天的雞胚胎於 10 cm 的培養 皿 (cell culture dish, 430167, Corning, USA)中，使用剪刀與聶子取出心臟 後移除週邊的組織，將心臟至於 Hanks’ balanced salt solution (HBSS, 14175, Invitrogen, U.S.A.) 的培養皿中，破壞細胞間的聯結，使細胞各自 分離。
步驟3：將心臟用剪刀剪至 1~2 mm 小塊後， 置入 50 ml 離心管，加入 8~10 ml TS，接著拿到 37oC 水浴槽加熱 8 分鐘。
步驟4：將上層懸浮液移至另一個 50 ml 離心管，加入 15 ml TSS (trypsin stop solution, Invitrogen, U.S.A.)後，在 1200 rpm、4 oC 的條件下離心 5 分 鐘，移除上清液，在加入 5 ml TSS，重複上述步驟 5 次。最後一次離 心之後，再加入 5 ml TSS，接著用 70 μm 的濾膜 (strainer, 352350, BD Falcon, U.S.A.) 濾至 50 ml 離心管。
步驟5：同樣的條件離心 5 min 後，移除上清液，用 20 ml 培養液回溶，接著 倒入 10 cm 培養皿中，將培養皿放入培養箱 45 min 。
步驟6：將靜待 45 min 後的培養皿取出，吸取懸浮液並將液體移至 50 ml 離心 管離心 5 min 後，移除上清液，再加入 3 ml 培養液，分裝至數個玻璃 式培養皿，置入細胞培養中培養。
步驟 7：經 12~18 小時後更換新的培養液。之後每三天換一次培養液。實驗上 使用的細胞約在此階段後的 4~6 天，細胞密度與個體的大小都如圖 2-2 所示。
100 μm
圖 2-2 雞胚胎心肌細胞影像
由受精後 11 天的雞胚胎取下的心肌細胞，以細胞密度 105 cells/ml 種在培養皿 4 天後的情形。
2-3 二倍頻 (second-harmonic generation, SHG) 系統的架設與調整方 式
整套系統的設置如圖 2-3。我們使用鈦藍寶石脈衝雷射 (Ti-Sapphire laser, Tsunami broad band fs, Spectra-Physics, U.S.A.) 做為激發光源。鈦藍寶石脈衝雷射 由 一 台 最 大 功 率 為 10 W，雷射波長為 532 nm 的固態雷射(Millennia X, Spectra-Physics, U.S.A.) 做為驅動光源 (pump source)。鈦藍寶石脈衝雷射的波長 可在 700~1000 nm 之間調節，調整的方式是藉著改變光程與狹縫的位置選取出 我們所需的波長。鈦藍寶石脈衝雷射有兩組藍色與綠色旋鈕，分別可以改變正下 方鏡面架水平與垂直傾斜的角度。裝設在此鏡架上的高反射係數鏡面，會反射共 振腔內所有的光源，包含雷射與螢光。轉動旋鈕改變鏡面的角度，會造成來回穿 梭的光路徑長度改變 (圖 2-4 (a))。而鈦藍寶石晶體產生的螢光，在共振腔內會 經過由4 個稜鏡組成的稜鏡對壓縮器 (prism-pair compressor) ，雷射光通過第一 面稜鏡會有散色現象，延伸成一條垂直於行徑方向的線前進，到達第二面稜鏡時 散色的光源受到補償，形成一條不再發散的光，並且會照著波長依序排列 (圖 2-4 (b))。利用一組可調位置的狹縫做篩選，挑出我們需要的波長，之後光源又依 照相反的方式由直線變成點光源前進。在此選用 810 nm 最為激發光源。調整雷 射輸出波長的方式如下：
1. 首先在雷射出口處放置雷射功率計並反射部份雷射光引入光譜儀 (USB2000, Ocean Optics, U.S.A.) 的光纖。
2. 以有輸出雷射脈衝為前提下，調控狹縫的位置使輸出的雷射波長靠近我們所 需要的波長。
3. 轉動 Tsunami 上方的調節器。每次僅調整單一方向(相同顏色的調節器)讓雷 射功率上升。在此過程中雷射波長也會有所改變。
4. 不斷的重複步驟 2、3 一直到雷射輸出最大功率。
5. 最後按下 Model 3930 上的 Lock 鍵，發光二極體指示燈固定在一點定點上不 隨意移動即可。
鈦藍寶石脈衝雷射產生的雷射引進 FV 300 共焦顯微鏡前會先經過電光調 製器(electro optical modulator, EOM, 360-80, Conoptics, U.S.A.)。在此使用電光調 製器的目的和使用光學遮斷器的功能相似，藉由改變雷射的極化方向，讓特定極 化方向的雷射通電光調製器，使雷射強度有規律性的變化，過這個動作我們稱為 調變 (modulate)。電光調製器在使用上先將它固定在自製的固定座，固定座上有 兩組固定環可以調整電光調製器頭尾的擺設方向、傾斜角以及 Z 方向的旋轉角 度 (圖 2-5 (a,b))。這裡需要特別注意，電光調製器上有一個開口 (圖 2-5 (c))，
用來反射不同極化方向的雷射光，因此在調整的過程中要避免反射的光直射眼 睛。調整的方式如下：
1. 降低雷射功率，在校正過程中雷射的能量要控制在 200 mW 以下，因為過高 的雷射功率在調整的過程中很有可能讓儀器內部光學元件受損。
2. 在電光調節器後架設功率計測量通過後雷射的功率。
3. 調整固定夾的位置與 Z 方向的旋轉角度，讓輸出的雷射功率達到最大值。
4. 轉動電光調製器約 45°旋轉角後即完成。
連接電光調製器上的 REF IN、REF OUT 與 Volt. 到電壓功率放大器 (high voltage power amplifier, Model 25D, Conoptics, U.S.A.) ，連接方式如圖 2-6。電 壓功率放大器最多可以同時與兩台電光調製器一起使用，Volt. 選擇任何一個 Bias 連 結 即 可 。 接 著 設 定 任 意 波 型 產 生 器 (arbitrary waveform generator, AFG3022B, Tektronix, U.S.A.) ，它可以同時輸出兩組訊號。其中一個通道設定脈 衝頻率為 1.3~1.6 MHz ，最高電壓值設定在 3.5 V，最低電壓值設定在 0 V，之
後接到電壓功率放大器的 “VIDEO INPUT”。另一通道脈衝頻率設定相同，電壓 最高值設定在 0.5 V，最低設定在 0 V，之後接到鎖相放大器上的 “reference input”。電壓功率放大器主要有兩個調節環(圖 2-6 )：驅動電壓 (drive voltage) 與 偏壓電壓 (bias voltage)。轉動「偏壓電壓」調節環使雷射經過電光調節器後輸出 最低功率。接著再調整驅動電壓，設定實驗需要的雷射功率即可。電壓功率放大 器輸入的電壓閥值為 3 V，當輸入電壓低於 3 V 時，驅動電壓將不會影響雷射 通過電光調節器的功率。
最 後 雷 射 會 經 過 四 分 之 ㄧ 相 差 板 (quarter wave plate, WPQ05M-808, Thorlabs, U.S.A.)，將線性偏極光轉換成橢圓偏極光。因為產生倍頻訊號分子的 偶極方向與雷射極化方向的夾角，會影響二倍頻訊號的強度，因此我們將雷射的 極化方向由線性轉成圓形，避免此因素的影響。
共焦倒立式顯微系統 (FV300, Olympus, Japan) 裡使用雙色性濾光鏡 (780 DCSPXR, AHF, Germany)，搭配物鏡為 60 倍水鏡 (UPLSAPO 60XW, N.A. = 1.20, Olympus, Japan)。產生的二倍頻訊號由 N.A. 0.55 的聚光鏡 (condenser) 收 集訊號後經過雙色性濾光鏡 (HQ560LP, Chroma, U.S.A.) 讓波長大於 560 nm 的光穿透，反射二倍頻的訊號到光電倍增管 (PMT, H7422-40, HAMAMATSU, Japan)，光電倍增管前方裝有濾片 (SP01-785RU, and FF01-405/10, Semrock, U.S.A.) ， 收 光 的 波 長 在 400~410 nm 。 偵 測 到 的 訊 號 先 經 過 訊 號 放 大 器 (pre-amplifier, DHPCA-100, Femto, Germany)將光電倍增管輸出的電流轉換成電 壓並且放大訊號，接著傳送至鎖相放大器 (lock-in amplifier, SR844, Stanford Research System, U.S.A.) 將得到的訊號解調 (demodulate) 後，傳送至電腦軟體 (Fluoview, Olympus, Japan) 繪製出影像。
實驗上的參數設定統整在表 2-1。
EOM Ti:sapphire laser (810 nm, rep rate = 76 MHz, pulse
EOM: electro optical modulator. QP: quarter wave plate. OBJ: microscopic objective.
CL: condenser lens. DM: dichroic mirror. BP: band-pass filter. SHG:
second-harmonic generation. PMT: Photomultipliers.
(a)
(b)
Pump beam Ti:Sapphire crystal FM
CFM
HR
CFM
AOM
HR
slit
圖 2-4 鈦藍寶石脈衝雷射 (Tsunami) 內部光路圖
(a) FM: focus mirror. CFM: cavity focus mirror. HR: high reflector. AOM:
acousto-optical modulator. (b) 譜帶較寬的光源經過稜鏡，因不同波長的折射率不 同，因此點光源就被發散成線光源。在經過另一個稜鏡將發散的光矯正回平行 光。由狹縫選擇通過的波長，再縮成點光源。
(a) roll
pitch (b) yaw
(c)
圖 2-5 電光調製器 (electro optical modulator)
(a) 電光調製器自製固定座。前後各有三個懸軸支撐。(b) 在調整電光調製器的 過程中，必須要注意到的三種旋轉向量。(c) 反射不同極化方向的窗口。內有偏 光晶體。
REF IN REF OUT Volt
Arbitrary waveform generator
圖 2-6 電光調節器與電壓功率放大器
上層為電光調節器，中、下層是電壓功率放大器的背面與正面圖。電壓功率 放大器 VIDEO INPUT 的位置有描述限制電壓大小在 1 Vp.p。這是與同步計數 系統 (synchronous countdown system) 一併使用時，需要注意輸入的類比訊號 值，與本次實驗無關。
表 2-1 實驗參數
Arbitrary waveform generator Channel 1 connect to high voltage power amplifier
Frequemcy 1.3 ~ 1.6 MHz Voltage 0 ~ 3.5 V Channel 2 connect to lock-in amplifier
Frequemcy 1.3 ~ 1.6 MHz
Lock-in amplifier
Time constant 100 ms
Sensititity 10 mV
Laser power
Millennia 7 W
Output power (810 nm) 350 ~ 410 mW Before EOM 350 ~ 410 mW After EOM (bias voltage) 3 ~ 4 mW After EOM ( bias voltage + drive voltage ) 176~207 mW
Before objective 16 mW
2-4 電刺激的裝置設計
骨骼肌細胞株不會有自發性收縮，為了使細胞有收縮現象，我們對細胞施加 固定頻率的脈衝電壓。當細胞受到電的刺激後會造成細胞膜內外電位差的改變，
刺激肌質網釋放鈣離子使細胞質中鈣離子濃度上升，鈣離子將會與 myosin 鍵結 改變構形，讓肌動蛋白上的結合位置露出使肌凝蛋白可以銜接，進行橫橋週期 (cross-bridge cycle) 一連串的肌肉動作。
刺激肌質網釋放鈣離子使細胞質中鈣離子濃度上升，鈣離子將會與 myosin 鍵結 改變構形，讓肌動蛋白上的結合位置露出使肌凝蛋白可以銜接，進行橫橋週期 (cross-bridge cycle) 一連串的肌肉動作。