1-1 掃描式光學顯微影像技術
在生物醫學上雷射掃描式光學顯微影像技術，已經充分運用於細胞、組織甚 至生物個體的觀察。從細胞上抗體抗原的螢光辨識1、肝臟脂肪含量的定量分析
2以及活體內腫瘤周圍的膠原蛋白動態調節過程3，都顯示此技術運用於生醫研究 上的價值。
依照掃描樣品的方式，可分為兩類，一種是雷射光束掃描 (beam scanning)，
一 種 是 樣 品 移 動 式 掃 描 (sample scanning) 。 雷 射 光 束 掃 描 是 利 用 一 對 galvanometer mirror scanners，使雷射光點在樣品上做二維掃描。其中一個掃描器 以 57 Hz ~ 2 kHz 快速擺動，使雷射光點有規律性的來回移動。另一個掃描器以 0.02 Hz ~ 4 Hz 的速度擺動，將雷射光以另一個軸向量移動，使雷射光可以完整 的行經一個平面 (圖 1-1)。此種掃描方式的優點是可以在短時間內得到一張完整 的影像，掃描一張像素面積為 512 × 512 的影像只需要約 1 秒。由於快速掃 瞄，雷射在樣品的每個點停留時間極短，約數十微秒 (μs) 左右，訊號強度因此 很小。增強雷射的功率或者使用更高收光效率及更小背景雜訊值的偵測器，如：
雪崩光電二極管 (avalanche photodiode,APD)，此二種方式皆可提高影像的訊雜 比，然而增強雷射功率容易使樣品受到破壞，選用後者則價錢昂貴且訊號過大時 易壞損。因此雷射光束掃描式成像技術較不適合運用在訊號強度太微弱的樣品。
對於大部分應用螢光成像的研究，雷射光束掃描式成像技術卻可以在短時間內提 供大量的資訊，故絕大多數商品化的雷射掃瞄顯微影像系統即是使用雷射光束掃 描的方式。
樣品移動式掃描的特性在於雷射光點保持固定，測量的樣品透過三軸移動壓 電平台 (piezo scanning stage) 移動樣品，讓樣品的每一個位置依序受到雷射光的 激發釋放訊號。壓電平台每次移動所需的時間約數十至數百微秒，相較於雷射光
束式掃描，樣品移動式掃描需要的時間較長。雖然需要花費較多的時間，但也因 為掃瞄的速度較慢，樣品單位面積受到雷射光照射的時間長，訊號的強度也相對 增強。當遇到訊號強度微弱時，可以搭配鎖相放大 (lock-in amplification) 技術或 光子計數 (photon counting) 技術，增加訊號雜訊比值，大幅提高訊號影像強度。
以上兩種掃描的方式都適合用來研究生物相關的問題，對於不同研究的主題 選擇適合的方式。當實驗上需要好的時間解析時，快速掃瞄的雷射光束掃描會是 一項很有利的工具。而樣品移動式掃描則可以用於分析微弱的樣品訊號，還能配 合鎖相放大技術及光子計數技術一起使用達到更好的效果。
Fast scan
Slow scan
57 Hz ~ 2 kHz
0.02 Hz ~ 4 Hz
圖 1-1 雷射光束掃描示意圖
雷射光束掃描式 (beam scanning)成像是利用一對 galvanometer mirror scanners 各自以固定的頻率來回擺動，完成二維影像的掃描。
1-2 鎖相放大 (lock-in amplification) 技術
如上節描述，今天要掃描的樣品訊號強度很小時，就可以使用樣品移動式掃 描技術與鎖相放大器增大訊號與雜訊之間的比值 (signal-to-noise ratio)。鎖相放 大技術常被用來偵測極小的交流訊號，偵測極限可達數個 nV。甚至可以從千倍 大的背景雜訊中，得到正確訊號值。它的基本運作方式是擷取特定相位與頻率的 交流訊號，經由訊號處理，從中取出交流訊號的振幅。實驗上讓雷射通過光學截 波器 (optical chopper)，旋轉的扇葉會阻擋雷射即可讓雷射強度有規律性的變 化，嵌入一個特定的頻率 (ωR)。此過程稱之為調變 (modulation)。因為訊號是由
90° 的內部參考訊號
與選擇的過慮器值有關，在此先不考慮 a 值的影響。從關係式可以得知時間常 數值設定越高，低通濾波器的寬度越窄，能通過濾波器的雜訊比例越低，因此訊 雜比越高。除了上述的方法可以提高訊雜比外，也可以增加光學截波器調節的頻 率，將大部分的雜訊移至高頻，遠離直流訊號，此時儘管使用寬度較寬的低通濾 波器，同樣也可以提高訊雜比。
實驗室使用「同調反史托克拉曼散射顯微技術」的研究中，為了讓低通濾波 器有效分離訊號與雜訊，光學截波器頻率設定為 2670 赫茲，時間常數設定在 3~10 ms，以得到高訊雜比的影像。
光學截波器產生的參考訊號
內部參考訊號 交流訊號
θ
Iθ
R圖 1-2 光學截波器產生之參考訊號與調變訊號、鎖相放大器內部參考訊號之時 間關係
(a) 光學截波器產生的參考訊號。由光學截波器產生，雷射光在經過截波器後會 帶有相同的頻率。(b) 交流訊號。當樣品受到雷射光激發後，產生的訊號也會有 相同的頻率。(c) 內部參考訊號。解頻的過程中鎖相放大器會依照外部參考頻率 產生相同頻率的訊號。訊號彼此間會有固定相位差，使解頻後的訊號強度受影響。
0.0 0.2 0.4
signal+AC noise+random noise
0.0 0.2 0.4
Modulated signal 200 Hz
0.0 0.2 0.4 Ideal signal
0.0 0.2 0.4
random noise
0.0 0.2 0.4
0 200 400 0.0
0.2 0.4 0.6
Amplitude
Frequency / Hz
DC Component
200-60 Hz
200 Hz
200+60 Hz
200+200 Hz
圖 1-4 經由傅立葉轉換得到訊號頻率的分布
由圖 1-3 (g) 的訊號經過傅立葉轉換，在 0 赫茲的地方會有最初的直流訊號，
經過低通濾波器(橘色區域代表)，擷取直流訊號。
1-3 肌肉簡介與相關文獻回顧
肌肉組織中單一肌肉細胞稱為肌纖維 (muscle fiber)，肌纖維內有許多排列 整齊的肌原纖維 (myofibril)。構成肌原纖維的主要成分為 myosin, actin 與 Z-line (圖 1-5)，他們依照固定的排列方式重複出現在肌原纖維內，我們稱此結 構單位為肌小節 (sarcomere)。肌小節長度判斷的方式為 Z-line 到 Z-line 之間 的距離。在 1958 年 Huxley 與 Taylor4 發現在偏光顯微鏡下，肌肉影像有明帶 (isotropic) 與暗帶 (anisotropic) 的區分，因此 myosin 與 actin 重疊的區域也稱 為 A band，而單獨只有 actin 的位置則稱為 I band。肌肉收縮的過程中，myosin 上的 myosin head 會牽動 actin，使 myosin 與 actin 的重疊部分增多，肌小節 的長度縮短。另外，在 1997 年 Geo5 首次利用二倍頻影像系統對骨骼肌進行低 解析的掃描，發現肌小節有二倍頻訊號。經過幾年的研究，目前已經確定二倍頻 影像訊號是由 myosin 產生6。
以下將會討論肌小節長度的測量方式與收縮-放鬆過程中力和鈣離子濃度的 測量方式，以及二倍頻影像技術。
肌小節長度的測量方式
光學繞射技術(diffraction techniques) 早在 1874 年 Ranvier7 就使用單色 光照射青蛙與兔子的肌肉，並且得到繞射條紋。繞射條紋是由 A-I band 交叉排 列產生，所以由繞射條紋可以知道A-I band 之間的距離，得到肌小節的長度。
也可以動態的監測肌肉的運動，所以有許多學者用此技術觀察分離的心肌細胞
8,9。在 1994 年 Lieber10 將此技術利用在人類身上。實驗上自願者將手臂表皮 切開露出肌肉，接著利用稜鏡將雷射光以一個角度引入照射肌肉，產生的繞射光 會以另一個角度散出，不受入射光的干擾，最後藉由繞射的結果，得到肌小節的
長度為 2.6 ~ 3.4 μm，肌小節收縮量最大值為 0.15 μm。 (charge coupled device single-line) 截取肌肉細胞收縮放鬆的一維影像，得到肌小 節的長度為 1.818 ~ 1.928 μm。1982 年 Roos14 使用自掃描式電荷耦合元件 (self-scanning charge coupled device) 觀測收縮的動態過程。此實驗使用之細胞取 自成熟大鼠的心臟，利用酵素破壞細胞外基質的連結取出心肌細胞，成熟心肌細
性，會使繞射條紋受到干擾。所以此技術不適合用在外觀排列不均勻的樣品，或 有功能性的合體細胞(functional syncytium)。
細胞力量的測量在 2000 年 Velden18 嘗試測量。作者使用捐贈者的心肌細 胞作為樣品，將萃取出來的細胞移至玻片上，利用倒立式顯微鏡觀察心肌細胞在 鈣離子濃度的變化下，對於肌小節長度的影響。並在細胞兩端黏上不繡鋼針，偵 測細胞的收縮力。不同長度的肌小節產生的力也不盡相同，長度為 2.2 μm 的肌
小節在鈣離子濃度為 3.16 × 10-5測得力為 22 μN，1.8μm 的肌小節在鈣離子濃 度為 3.16 × 10-5 測得力為 15 μN。在 2001 年 Shevchuk19 將掃描離子電導顯 微術 (scanning ion conductance microscopy, SICM) 與雷射掃瞄顯微鏡結合，在樣 品中加入 Fluo-3 發光物質偵測鈣離子濃度變化，SICM 測量細胞收縮時向上振 動的幅度，達到同時測量心肌細胞的跳動與鈣離子的變化。2002 年 Stehle20 在 顯微鏡上加裝原子力懸臂系統，利用鈣離子濃度的變化讓肌原纖維收縮，測量肌 肉收縮時產生的力量。並且觀察移除鈣離子後肌原纖維回到放鬆狀態所需要的時 間，最後還有比較磷酸根的濃度對於收縮的力量與放鬆的時間做探討。2006 年 Telley21 使用螢光抗體染色技術在蛋白質 α-actinin 的位置標記螢光訊號，使 Z-line ( α-actinin 含量較多，螢光強度較強) 與 M-band ( α-actinin 含量較少，
螢光強度較弱) 產生螢光訊號。此外作者在顯微鏡上架設原子力懸臂系統，將探 針接在肌原纖維的一端，肌原纖維的另一端固定在物台上，當肌肉在收縮時會去 拉動探針，改變探針的位置，推得力的大小。藉由螢光訊號的間隔得知肌小節的 長度、探針的移動量測量收縮力的大小，得知多組肌小節相互的化學與機械力的 相關性。
最後，我們將對本文中使用的實驗技術做相關的文獻回顧與使用在肌肉組織 的探討。
二倍頻顯微技術
二倍頻顯微技術為非線性光學的應用之ㄧ。因為雷射波長選用紅外光或近紅 外光，所以對於樣品的破壞性較小，在掃描易造成散射的樣品時，雷射在聚焦的 過程中損失的能量較少，因此可以掃描較深層的影像22。二倍頻訊號在 1961 年 由 Franken23 發現。在 1978 年 Sheppard24 將二倍頻顯微技術與光學顯微鏡結 合。2002 年 Campagnola25 發展出掃描式二倍頻顯微影像系統，可以快速得到 一張三維影像。有些非中心對稱的生物分子會產生此訊號，如細胞外基質富含的
膠原蛋白26，肌纖維27。
在得知肌纖維會產生二倍頻訊號後，科學家對於訊號是從哪裡產生的開始感 到興趣。在 2003 年 Both28 提到 actomyosin 為訊號來源。同年 Mohler29 則提 出 myosin heavy chain 為訊號來源。2006 年 Plotnikov30 將 myosin head 移除 後二倍頻訊號的強度沒有受到影響，證實訊號的來源不是由 myosin head 產生。
在得知肌纖維會產生二倍頻訊號後，科學家對於訊號是從哪裡產生的開始感 到興趣。在 2003 年 Both28 提到 actomyosin 為訊號來源。同年 Mohler29 則提 出 myosin heavy chain 為訊號來源。2006 年 Plotnikov30 將 myosin head 移除 後二倍頻訊號的強度沒有受到影響，證實訊號的來源不是由 myosin head 產生。