結果與討論 - 開發「鎖相放大倍頻顯微技術」於肌纖維收縮之觀測

3-1 使用鎖相放大器技術對於影像的訊號雜訊比之影響

首先我們改變各種不同調變頻率，比較訊雜比的變化，並觀察使用鎖相放大器對於訊雜比的提升。實驗上選擇易測量訊號的螢光染劑-R6G (R634, Invitrogen, U.S.A.) 做為樣品，測量雙光子激發螢光的強度。螢光訊號強度即為光電倍增管測量之訊號強度扣除背景值所得。雜訊的部份以水做為樣品，水本身不含螢光訊號，所以測量到的強度為背景值，訊號的擾動量代表雜訊。實驗時將雷射的功率設定在 20 mW，測量訊號雜訊比。之後開啟電光調節器，調節頻率設定在 1 kHz

~ 2 MHz，工作週期為 50%，雷射平均功率同樣為 20 mW，鎖相放大器上時間常數的設定值為調控頻率倒數的 3~6 倍。取樣率在有使用鎖相放大器時設定為時間常數的 2 倍，未使用的情形下每秒取 5000 筆資料。結果顯示在表 3-1。

頻率 1 kHz ~ 20 kHz 使用的鎖相放大器 (SR830, Stanford Research Systems, U.S.A.) 與頻率 50 kHz ~ 2 MHz 使用的鎖相放大器 (SR844, Stanford Research Systems, U.S.A.) 不同，因為儀器上的限制所以必須使用兩種不同型號的鎖相放大器。從結果顯示，在設定調節頻率 20 kHz 與 50 kHz 之間有明顯訊雜比的差距，很有可能是因為使用不同儀器造成的結果。調節的頻率越高，訊雜比的值反而越低，此結果或許是儀器在如此高頻的情形下，電光調節器或是任意波形產生器產生額外的雜訊。儘管如此，使用鎖相放大器可以提升約 1127~11551 倍。

得到頻率與訊雜比的關係後，我們改變波形產生器的工作週期 (duty cycle)，觀察不同工作週期對於訊雜比的影響。如圖 (3-1)。脈衝持續時間會影響電壓功率放大器的運作，當波形產生器輸入的電壓值達到電壓功率放大器的閾值時它才會去控制電光調節器，調整雷射在電光調節器內穿透與反射的比例，造成不同輸出功率。實驗上以相同功率的雷射引進電光調節器，改變工作週期輸出不同雷射功率，在脈衝強度皆相同的情況下，觀察訊雜比的影響。最後由圖 3-2 顯

示工作週期設定在 40% 時，相同脈衝強度下以較短脈衝持續時間激發樣品，得到最佳的訊雜比，減少雷射對於樣品的破壞。

0.24

脈衝持續時間

50 % Duty Cycle

30 % Duty Cycle

(a)

(b)

方波週期

圖 3-1 工作週期

(a) 工作週期是指產生的脈衝訊號經歷高電壓的時間週期與脈衝週期的比例。(b) 相同頻率下不同的工作週期輸出的方波。

15.3

3-2 雷射光掃描技術技術與鎖相放大器技術之結合

要將兩種技術結合，首先要先了解各個參數設定代表的意義與使用上的限制。共焦顯微技術控制程式 “Fluoview” 有三種參數與掃描影像的面積或掃描時間有關，分別為像素面積 (scan size)、掃描速度 (scan speed) 與顯示放大 (zoom in)。像素面積代表一張影像由多少像素組合成，因掃描每單位相素需要花費的時間是相同的，所以越多像素組成的影像需要越久的時間。而像素面積與掃描所得的影像大小無關，但卻會影響最後取得影像的解析度，若像素面積越大則影像解析度越好。當每單位像素的面積大於光學解析極限時，影像的解析度即由單位像素的面積決定，反之則由光學解析度決定。

掃描速度會影響掃描每單位像素面積所需要的時間，掃描速度越快雜訊越高。如：一張像素面積為 512 × 512 的影像最快只需要 0.25 秒，最慢則需要 2.71 秒。

顯示放大跟掃描影像的實際範圍有關，範圍由 1 到 10。參數設定在 1 時掃描範圍最大，其餘的掃描面積大小依照最大面積除以設定的參數值。例如使用 60 倍物鏡，顯示放大設定為 1，得到一張影像邊長為 235 μm，若更改為 5，則影像的邊長為 47 μm。顯示放大會影響實際掃描的面積，因此也會影響像素的解析度。

鎖相放大器的時間常數值會影響到數據的處理時間。時間常數值設定為 100 μs, 12 dB 的條件下，訊號更新速率大約 12-24 kHz，大約 50 μsec 改變一次，

對於共焦顯微技術而言，若以像素面積: 512 × 512，顯示放大: 1.0，掃描速度: 慢，

60X 物鏡，一張 235 μm × 235 μm 影像為實驗條件下，鎖相放大器輸出一個訊號的間隔時間，影像已經掃描 2.22 μm，從影像上觀察會有 5 組相鄰的像素顯示相同的訊號強度，也代表此時解析度為 2.22 μm。在這種實驗條件下得到的影像，它的訊號雜訊比跟未使用鎖相放大器的共焦顯微影像，其值較大，但是因為

解析度的關係影像看起來卻較為模糊。若是將像素面積的大小調整成 2048 ×

強度的分析，沒有使用鎖相放大技術的分析結果顯示二倍頻訊號的強度幾乎比雜訊還小，訊號上下擾動的起伏已經嚴重影響對於二倍頻訊號強度的判斷。使用鎖相放大技術後的結果顯示真正的二倍頻訊號經由鎖相放大器的放大後，已比雜訊來的大。由以上的結果很清楚的說明使用鎖相放大技術對於訊雜比的提升。

(a)

(b)

(c)

(d) (f)

(e)

圖 3-2 不同的參數掃描同一個樣品得到的二倍頻影像

樣品使用含有豐富膠原蛋白的老鼠尾巴組織切片進行掃描 (Laser power: 7 mW;

scan speed: slow; time constant: 100 μm; sensitivity: 10 mV)。(a) 像素面積：512 × 512，顯示放大：1，影像大小：235 μm。(b) 像素面積：2048 × 2048, 顯示放大：

1，影像大小：235 μm。(c) 將圖 (a) 的影像放大 10 倍後，觀察正中間 23.5 μm 的影像。(d) 將圖 (b) 的影像放大 10 倍後，觀察正中間 23.5 μm 的影像。(e) 像素面積： 512 × 512，顯示放大：10，影像大小：23.5 μm。(f) 像素面積：2048 × 2048, 顯示放大：10，影像大小：23.5 μm。相同影像大小，像素越多解析度越高，

得到的影像越清晰。

0 1 2 3 4 5 6 7

Normalized intensity

Length / μm

scan size: 2048 × 2048; zoom in: 10; scan speed: slow; time constant: 100 μm;

sensitivity: 10 mV; PMT: H7827-012 (HAMAMATSU, Japan); gain: 0.9)

3-3 骨骼肌細胞之二倍頻影像及三維組圖

在掃描初代心肌細胞之前，先嘗試以肌肉細胞作為樣品進行掃描。在高解析度的掃描下，可以清楚看到 myosin 一節一節的排列，並藉由二倍頻訊號來判斷肌小節的長度。肌小節的判定方式是從影像上取一條垂直的線，依強度與距離作圖，波谷到波谷的距離即為肌小節的長度 (圖 3-4 )。得知肌小節的長度 2.711±0.084 μm。另外，因為二倍頻訊號有很高的空間解析度，因此也可掃描 XYZ 三軸影像後，再組成三維圖，觀看肌小節在空間上的分布情況 (圖 3-5 )。

藉由掃描不同Z 軸影像，我們可以推估細胞的厚度。本次實驗 Z step size 為 0.5 μm，共有 8 張影像有二倍頻訊，得知細胞厚度大約 3.5 μm。

0 5 10 15 20 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Norma lized intensity

Length /

m

10 μm 10 μm

(a) (b)

(c)

圖 3-4 骨骼肌細胞二倍頻影像

分化第10 天後的肌管細胞進行二倍頻影像掃描 (laser power: 16 mW; scan size:

2048 × 2048; zoom in: 5; scan speed: slow; time constant: 100 μm; sensitivity: 10 mV;

PMT: H7422-40; PMT gain: 0.8)。SL：sacromere length。(a) 穿透影像。(b) 二倍頻訊號影像。(c) 由圖 (b)紅線位置的訊號強度對距離作圖，得到八組肌小節長度。經過平均後得到肌小節的長度為 2.711±0.084 μm。

Z: 3 μm Z: 2.5 μm

Z: 2 μm

Z: 1.5 μm

Z: 3.5 μm Z: 1 μm

Z: 0.5 μm Z: 0 μm

圖 3-5 骨骼肌細胞二倍頻訊號三維影像

Laser power: 16 mW; scan size: 2048 × 2048; zoom in: 5; scan speed: slow; Z step:

0.5 μm; time constant: 100 μm; sensitivity: 10 mV; PMT: H7422-40; PMT gain: 0.8。

由8 張影像組合成的立體圖。影像長寬分別為 47.104 μm，厚度為 3.5 μm。

3-4 骨骼肌細胞收縮與放鬆之二倍頻動態影像

目前已確認在靜止的肌肉細胞我們可以得到清晰的二倍頻影像，並且可以分析肌小節的長度與空間上的分布。接下來將試著對細胞進行電脈衝的刺激，觀察收縮放鬆過程中肌小節的變化。細胞表面的離子通道受到電流的刺激下，鈉鉀離子通道將逐一開啟，生成一個動作電位由細胞膜往細胞內傳遞。此動作電位將會刺激細胞內鈣離子濃度的變化，促使肌肉細胞收縮。實驗上我們改變電流的頻率，觀察細胞的收縮與放鬆過程。

任意波型產生器設定頻率為 1~2 Hz，脈衝寬度為 30 ms，電壓值為 5 V。

經由電壓放大器放大至 53 V 後再導入培養液。首先，先掃描一張 2D 影像 (scan size: 2048 × 2048, zoom in 10)，選取一段有二倍頻訊號的區域進行一維掃描 (圖 3-6 (a))，得到二倍頻訊號位置與時間的關係圖 (圖 3-6 (b))。二倍頻訊號的位移量代表肌小節 myosin 的移動量，是所有肌小節收縮或放鬆過程的總和。過程中改變電脈衝頻率，由初始設定的 2 Hz 降為 1 Hz。為了進行分析，必須先將影像轉換為數據資料，步驟如下：

1. 將每一條一維掃描影像轉換為強度對位置關係圖 (圖 3-6 (c))。

2. 記錄每個波峰位置。

3. 找出各波峰對應到不同時間的位置。

4. 重新繪製位移對時間的關係圖。

最後我們選取其中一條二倍頻影像 (圖 3-6 (d)) 進行分析。在改變脈衝頻率時，肌肉會有一小段時期跳動不規律，因此數據分析上選取 0~5 秒與 10~20 秒進行傅立葉轉換 (圖 3-6 (e))。得到二倍頻訊號的變化頻率與電脈衝設定頻率相同。另外也可藉由繪製強度、時間、與距離的 3D 影像圖，找出各波峰對應到不同時間的位置，方便我們判斷每一組肌小節的位置 (圖 3-7)。

試著改變電壓的脈衝寬度與電壓值的大小，在亮視野上觀察細胞的變化。電

壓值在小於 53 V 之前細胞沒有收縮與放鬆的行為，施加的電壓大於 100 V 後，細胞膜會開始出現氣泡最後破裂。當施加電壓的脈衝寬度越寬，細胞收縮的速度越快。

0 1 2 3 4 5

Displacement / μm

0.0

Displacement / μm

Time / sec power: 16 mW; scan size: 2048 × 2048; zoom in: 5; scan speed: slow; time constant:

100 μm; sensitivity: 10 mV; PMT: H7422-40; PMT gain: 0.8)

2 4 0

4 2 0

Time / sec

Position / μm

圖 3-7 強度對位置與影像作圖

由 3D 影像可以判斷肌小節的長度與相對應 double peaks 的二倍頻訊號，並且受到電壓調控而造成排列疏密不等的波形。

3-5 雞胚胎心肌細胞自主性收縮過程之量測

測量骨骼肌細胞動態收縮過程的結果，顯示細胞的收縮頻率會受到刺激頻率的調控，也顯示此系統在追蹤肌小節長度變化的過程中，影像上可以準確的測量肌肉細胞的收縮過程，且經由分析二倍頻訊號的移動量，得到訊號改變的頻率與刺激頻率完全相同。在此，我們已可確定系統運用在觀察心肌細胞自主性收縮的可行性。以下實驗將會掃描雞胚胎分離出的心肌細胞。

首先，先掃描一張二維的影像。因為心肌細胞正處於跳動的狀態，所以二維影像可以觀察到二倍頻訊號有拖尾的痕跡 ( 圖 3-8 (a)) ，由透射影像 (transmission image) 也可以看到規律性的位移軌跡。穿透影像不適合使用在這次實驗中，因為我們使用的心肌細胞，細胞外觀沒有清楚的 A-I band 間隔¹²，只能得到細胞內胞器的輪廓 (圖 3-8 (b))。取二維影像時，先使用像素面積為 512 ×

在文檔中開發「鎖相放大倍頻顯微技術」於肌纖維收縮之觀測 (頁 45-72)