研究方法

本 研 究 的 主 旨 為 探 討 葉綠素及其衍生物對於過氧化氫所誘導 的人類淋巴球細胞DNA 損傷的影響。由於過去研究顯示，銅鈉葉綠 素可以有效抑制DNA 的氧化損傷，因此本研究以 Chlin 為對照實驗，

與葉綠素的水萃取物作比較。

一、實驗材料

(一) 葉綠素水萃取物的製備 1.菠菜

葉綠素的水萃取物質是由中央研究院植物暨微生物學研究所楊 棋明博士提供。新鮮的菠菜購自台灣農家。於購買後立即進行冷凍 乾燥，並加入液態氮，以研缽磨成粉末狀後於-70℃下保存備用。

2.葉綠素萃取物的純化

首 先 利 用 膠 體 過 濾 法(CM-Sepharose CL-6B cation- exchange chromatography) 自菠菜中分離葉綠素 a、b。接著將 chlorophyllase 酵 素分別加入葉綠素 a、b 中，靜置反應 30 分中後脫去尾鏈的植醇鏈 而得到脫植醇葉綠素a 與 b。將脫植醇葉綠素 a 與 b 加醋酸後，靜

(二) 人類血液淋巴球細胞的分離

淋巴球細胞是白血球的一種，主要執行人體內的免疫功能。健 康的成年人白血球總數在4~10×10⁹/L 範圍內，其中嗜中性球最多，

淋巴球次之，約佔20-40%。淋巴球細胞主要來自骨髓幹細胞，當有 抗原入侵時，淋巴細胞會去對抗抗原的入侵；再者，此細胞取得容

易且細胞數多，因此本研究以淋巴球細胞作為氧化損傷保護的研究。

本實驗以真空採血管收集健康人體全血 2 毫升，並置於含有抗 凝劑之採血管中，利用磷酸緩衝食鹽溶液(phosphate buffered saline；

PBS)將全血做一比一的稀釋，以 Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech)密 度離心法，將轉速調整至 400G，離心 35 分鐘後分離出淋巴球並收 集。經過兩次的PBS 清洗後，加入適當的 RPMI1640 培養基調整細 胞數。

二、分析項目與測量方法

(一) 葉綠素萃取物的純度分析

利用逆相高效液相色層分析(Reserved Phase High Performance Liquid Chromatography ；RP-HPLC)，以醋酸胺作為移動相(A solvent) (Almela, et al., 2000)，分析系統如下：

分析管柱：Spherisorb ODS-2 (250×40 mm), particle 5 µm (C₁₈) 高壓幫浦：Waters Model 510

流速控制：Waters Model 680 自動梯度控制儀 注射器：Waters U6K

光譜偵測器：Fluorescence detection,

流動相 A：1M Ammonium acetate/methanol (2/8,v/v) 流動相 B：Acetone/methanol (2/8, v/v)

分析波長：激發波長440nm，放射波長 660nm

葉綠素水萃取物的純度分析是利用其留滯時間(retention time)及 光譜特性(visible absorption characteristics)確認。

(二) 細胞毒性實驗

本實驗是對淋巴球細胞添加不同濃度的葉綠素與 H2O2 作為氧 化損傷的保護作用探討，但在探討葉綠素的保護功能之前，必須先 進行細胞毒性試驗，以確保樣品在選取之反應條件（包括樣品濃度、

反應時間和溫度）下，不會造成細胞死亡。樣品的細胞存活率愈高 表示細胞毒性愈低，一般應於細胞存活率高於90%的條件下繼續進 行基因損傷之試驗。

本研究利用市售試劑組 CellTiter96^®Aqueous One solution Cell proliferation 試劑組來測定人類淋巴球細胞在不同濃度的葉綠素水 萃取物或過氧化氫下的存活率。利用[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium;MTS]

與 活 細 胞 共 同 培 養 時 ， 可 被 活 細 胞 內 具 有 活 性 的 粒 線 體 中 dehydrogenase 作用而切斷其 tetrazolium ring，形成 formazan，在 490nm 下可以測得最大吸光值(圖十四)。因此當吸光值較大時所代 表活細胞數量愈多，故可作為偵測活細胞的指標(Cory, et al., 1991)。

圖十四：MTS tetrazolium 與其 formazan 產物的結構式

Figure 14: Structures of MTS tetrazolium and its formazan product.

將細胞均勻分到 24 孔洞的培養皿(24-well plate，約 2×10⁵ cells/well)中，在 37℃下培養 24 小時後，再將各種的葉綠素水萃取 物加入共同培養30 分鐘；或是加入過氧化氫後培養 5 分鐘，同時利 用 RPMI1640 培養基作為實驗的控制組。待達到時間點後將細胞以 PBS 清洗後，在適當的濃度下取出 100 µL 的細胞液放到 96 孔洞的 培養皿(96-well plate)中，加入 20 µL 的 MTS 試劑，在 37℃下培養 4 小時，利用酵素免疫分析儀(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay；

ELISA)在 490 nm 測其吸光值，以檢測出細胞的存活率。當吸光值 愈高表示活細胞數量越多，細胞存活率(survival)的計算方式為：處

(三)清除 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)自由基能力的測定 一般抗氧化劑為氫原子供應者，在抗氧化的研究上可使用 DPPH 自由基來評估抗氧化物質提供氫原子的能力。因DPPH 是較為安定的 自由基，實驗上所採用的 DPPH 甲醇溶液為紫色，在 515 nm 下有強 的吸光值，若與抗氧化劑結合，將會降低吸光值，由此藉以判斷樣本 清除DPPH 自由基的能力，其吸光值愈低，表示樣本清除 DPPH 自由 基的能力愈強。本研究參考Shimada 的方法，測定清除 DPPH 自由基 的能力。 首先將葉綠素衍生物溶在乙醇溶液中，取出 0.4 mL 加入 0.8 mL 新鮮配置的 DPPH (10 mM)的甲醇溶液，均勻混合後靜置 30 分 鐘，使用分光光度計(Spectrophotometer U-2000 Hitachi)檢測 515nm 的 吸光值(Shimada, et al., 1992)。

清除率(scavenging effect)=[(控制組的吸光值 A515nm – 樣品組的吸

光值A515nm)/ 控制組的吸光值 A515nm]×100%

(四) H2O2誘導 DNA 氧化損傷以及葉綠素的抗氧化研究

H2O2 在人體的代謝過程中會自然產生，若是 H2O2 在人體中累 積到一定的量時，就會造成細胞 DNA 鹼基氧化作用而損傷，並造 成DNA 的斷裂(Wei, et al., 1999)，因此 H2O2一般常用作氧化性DNA 損傷的誘導劑(Halliwell and Gutteridge, 1999)。

取適量培養於 RPMI 1640 培養基之細胞懸浮液，置於微量離心 管中，在調整淋巴球細胞的數量後(2000 個 / mL) 分別加入不同濃 度(5、20、50 µM)的各種葉綠素水萃取物，於 37℃下反應 30 分鐘，

再加入H2O2使最後濃度成為10µM 或 50µM，於 37℃下反應 5 分鐘，

以離心的方式收集細胞，除去上層液，留下白色沉澱物，利用單細 胞膠體電泳分析(彗星試驗分析)，以及測量 8-OHdG 來評估 DNA 損 傷的程度。

(五) DNA 氧化損傷研究方法

目前有許多方法來量化 DNA 的氧化傷害，包括利用 HPLC 或 氣相層析/質譜法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry；GC-MS) 測量鹼基的氧化產物。因為最容易受到傷害的鹼基是 Guanine (Halliwell, 1998)，當 DNAGuanine 的 C8 位置受到活性氧分子的攻 擊而被氫氧化之後，即產生8-OHdG，因此測量 8-OHdG 可作為 DNA 氧化傷害的指標。但是一般認為此方法用在 DNA 氧化損傷程度較 低的情況，其正確性較高。此外，DNA 在萃取或水解的過程中，有 時也會造成 DNA 進一步的氧化，例如，利用公牛胸腺萃取出的 DNA，利用酸水解並以 GC-MS 來測量 8-OHdG，比起利用酵素性水 解後以HPLC 測量所得到的 8-OHdG 值高(Lunec, 1998)；再者，DNA 在萃取的過程中，以sodium iodide 來取代 phenol 會減少 8-OHdG 的

含量(Helbock, et al., 1998)。

為解決上述 DNA 在分離或水解過程中因氧化所造成測量

8-OHdG 含量的誤差，Ostling 和 Johnson (1984) 提出利用微小膠體 電泳法(microelectrophoresis)偵測單一細胞 DNA 的斷裂情形，其優 點是可以在螢光顯微鏡下直接觀察單一細胞 DNA 損傷的情況；

Singh 等 人 (1988) 建 立 鹼 性 微 小 洋 菜 膠 電 泳 法 (alkaline microgel electrophoresis) ， 即 所 謂 的 單 細 胞 膠 體 電 泳 法 (single cell gel electrophoresis；SCGE)，又簡稱為彗星分析(comet assay)，其中將 DNA 雙股解開的步驟在鹼性的環境中進行，因此可以偵測到細胞 DNA 的單股斷裂(single-strand breaks；SSBs)(圖十五)。其原理為細 胞 DNA 受到傷害而斷裂時，斷裂的片段因為分子較小，因而在電 泳槽中藉由正負極電流的牽引而移動，染色後顯現的量點如同彗星 般拖出長長的尾巴。相對於未受傷的 DNA 因為分子較大而在電泳 槽中不會移動，因此藉由移動的距離來評估 DNA 損傷的程度，目 前以利用尾動量(tail moment) 參數來評估 DNA 損傷最為普遍(Olive, et al., 1990)。

圖十五：在螢光顯微鏡下所觀察到 DNA 未損傷(左圖)，以及 損傷(右圖)的情形，並以尾動量(Tail Moment)來表示 受損傷程度

Figure 15 : Under a fluorescence microscope, the comet-like images resulting from the extension of DNA were scored as a reflection of the single-strand breaks.Tail moment was defined as follows: TM = TL × % DNA

(六) 單細胞膠體電泳法(彗星分析) 1. 電泳膠片製備

取正常溶點的洋菜膠溶液(normal melting gel agarose)，注入玻片 上，立即蓋上蓋玻片置於4℃ 5 分鐘，待凝固後移除蓋玻片，此為第 一層。

取出先前於 37℃下反應的各實驗組細胞溶液，加入低溶點的洋 菜膠溶液(low melting gel agarose, LMA)，趁凝固以前快速注入玻片 上，立即蓋上蓋玻片置於4℃ 5 分鐘，待凝固後移除蓋玻片，此為第 二層，此時細胞已經存在於此層中。

將製備好的玻片浸入細胞水解液（2.5 M NaCl, 100 mM Na-EDTA, 10mM Tris, pH=10, 1% sodium sarcosinate, 1% Triton X-100 及 10%

DMSO），於 4℃下反應 1 小時使細胞膜破裂。

2. DNA 解雙股以及電泳

將玻片由水解液中取出，以二次水清洗後，置於水準式電泳槽 中 ， 加 入 電 泳 液 使 玻 片 於 鹼 性 的 電泳液中 解開雙 股螺旋的結 構 (unwinding)。待 20 分鐘後，開啟電泳電源，調整電流為 300 mA，電 壓保持在25V 左右，時間為 30 分鐘。電泳結束後以 Tris buffer 中和。

3. DNA 氧化損傷分析

玻片以ethidium bromide 染色後，使用螢光顯微鏡，在 400 放大

倍率下觀察，以彗星分析系統VisCOMET^®分析，每個葉綠素純化物 質濃度做二重複，每個玻片分析 20 個細胞 Comet 圖案亮度，以尾 動量(Tail Moment)來表示 DNA 受損傷程度。有關利用彗星分析 DNA 損傷的流程圖如圖十六。

圖十六：彗星分析的流程圖

Figure 16：Protocol of comet assay

(六) 8-氫氧 2'-去氧鳥糞核糖核苷(8-hydroxy-2- deoxyguanosine；

8-OHdG)測定

1. DNA 的抽取分離

為保持 DNA 的完整性，在低溫且避光線的環境下進行 DNA 的 抽取分離，以避免 DNA 斷裂或降解。DNA 的分離是利用 Genomic DNA-purification kit (Bertec Enterprise, Taiwan)。各實驗組的淋巴球細 胞經過不同葉綠素濃度的處理，以及被 H2O2所誘導氧化損傷後，分 裝在1.5 mL 的微量小管中， 離心收集下層的細胞。接著以 100 µL 的 PBS 將細胞洗出，隨後加入 700 µL extraction solution 將細胞溶出。

加入4 µL proteinase K，置於 56℃水浴機中直到細胞完全破裂(約 1-3 小時)，之後移至室溫。加入 700 µL 的 DNA binding buffer，搖晃均 勻5 分鐘使雜物凝集。

將所有的溶液倒入spin column， 再將 spin column 套入 collection tube，以 12-14000 rpm 離心 1 分鐘。將洗下來在 collection tube 中的 液體倒掉，在spin column 中加入 700µL 的 wash solution 清洗（此步 驟重複二至三次），此時DNA 仍存在於 spin column 的膜層中。將 spin column 套在新的無菌微量小管，置入 60℃的烘箱約 5-10 分鐘，讓 Ethanol 蒸發。加入 50 µL，60-70℃的 elution solution 到 spin column，

停留約2-3 分鐘，讓 DNA 溶出，再以 6000 rpm 離心 2 分鐘，並重複

2 次收集所有的 DNA，保存 DNA 於-20℃備用。

2. DNA 的定量

DNA 在 260nm 處有最大的吸光值，蛋白質則在 280nm 處有 最大的吸光值。因此，可以用 260nm 波長進行分光測定 DNA 濃度，

1 OD 約為 50 µg/mL 的雙股 DNA。取出 50 µL DNA 溶液稀釋於理 想 的 濃 度 後 放 入 比 色 管 中 ， 使 用 分 光 光 度 計(Spectrophotometer U-2000 Hitachi)檢測 260 nm 的吸光值即可計算出樣品稀釋前的濃 度：

DNA（µg/mL）=50×OD260 讀數×稀釋倍數

為確認 DNA 的純度是否受到蛋白質的殘留，而影響實驗，同時

為確認 DNA 的純度是否受到蛋白質的殘留，而影響實驗，同時