第四章 葉綠素的水萃取衍生物對黃麴毒素所誘導肝細胞 DNA 損傷之
第三節 討論
一、植物性化學物質抗氧化性的比較
1954 年自由基的發現，證實與許多慢性疾病有關；長期暴露在含 氧的自由基環境中將導致氧化壓力。一般生物體內的抗氧化系統與活 性氧是維持在一個平衡的狀態，當體內活性氧分子多時，它們將破壞 細胞中的蛋白質、脂質甚至DNA，最後造成細胞的老化或死亡(Sies, 1986； Halliwell and Gutteridge, 1999)。
許多天然的植物性食物(phytochemicals)或維生素都是抗氧化物 的最佳來源。由於近年來，一些蔬果中的植物性化學物質，例如：葉 綠素、類胡蘿蔔素、維生素 C、維生素 A 以及維生素 E 等物質，在 正常的攝取下具有抗氧化、抗突變性等保健功能。Ong 等學者在 1989 年的研究發現在上述的這些植物性化學物質中，葉綠素能發揮最佳的 抗突變性表現。此外，Kamat 等學者(2000)的研究指出葉綠素的抗氧 化效果比維生素C、glutathione 或 mannitol 來的好。
二、葉綠素在體內的代謝
葉 綠 素 主 要 以 兩 種 形 式 存 在 於 新 鮮 的 蔬 菜 水 果 中 ， 分 別 是 chlorophyll a 與 b (Almela, et al., 2000)，以新鮮菠菜為例，chlorophyll a 與 b 的含量比約為 2.5：1 (Ferruzzi, et al., 2001) 。但是隨著綠色 蔬菜種植的老化，葉菜中的 chlorophyllase 的濃度隨之增加，使葉綠
素脫去非極性的植醇鏈而產生極性較高的脫植醇葉綠素(Chlide) (Trebitsh, et al., 1993)。此外，當它們在酸性環境下，例如葉菜類食 物在烹調、製備或加工等過程中加入酸性物質例如醋；或是攝取食糜 後進入胃與胃酸混合之後，會失去其葉綠素中心 porphyrin 環內的鎂 離子而轉變成脫鎂葉綠素(Phe)，或脫鎂脫植醇葉綠素(Pho)。Ferruzzi 等學者(2001) 利用模擬人體小腸 Caco-2 細胞模式的研究發現，Phe 可以經由人類體內的乳糜微粒吸收進入循環系統。動物的研究發現 (葉, 2003)，這些葉綠素的代謝產物透過門靜脈到達肝臟後，幾乎轉 變成 Chlide 或 Pho。因此本實驗以 Chlide 或 Pho 等葉綠素的代謝產 物來進行研究，除可以比較各種葉綠素衍生物之抗氧化能力外，還可 以藉此模擬葉綠素代謝物質對人體所發揮的抗氧化效力。
三、葉綠素含量對人體淋巴球細胞的影響
Frenzilli 等學者(2000) 曾針對銅鈉葉綠素(Chlin)以及過氧化氫等 18 種化合物，添加在人類淋巴球細胞後，探討劑量對其細胞存活率 的影響；研究顯示要達到 95％以上的細胞存活率時，添加於細胞中 的葉綠素或過氧化氫的最大濃度分別為200 µM 與 50 µM。此研究 結果與本實驗表三與表四所呈現細胞的存活率一致。此外，Frenzilli 等學者(2000)也分析淋巴球細胞 DNA 的損傷程度，發現 DNA 的氧化 損傷隨著細胞添加過氧化氫濃度增加而增加，此結果與本實驗中表五
DNA 氧化損傷的結果一致。
本實驗對人體淋巴球細胞(2000 個/毫升)所使用的葉綠素最高濃 度為50 µM。若是依據健康的人體中淋巴球細胞約有 1.5×107 個來換 算，約需要0.3 公克的葉綠素才能在血液中達到相對濃度。惟目前缺 乏葉綠素生體可利用率的相關資料。根據 Ferruzzi 等學者(2001) 的 研究指出：約有 5-10%經過乳糜化的葉綠素可以進入人類 Coca-2 小 腸細胞，估算人體約需從飲食中攝取3~6 公克的葉綠素。一般新鮮菠 菜中平均大約含有2% 的葉綠素(L´opez-Ayerra, et al., 1998），因此推 估在理想的狀態下至少需攝取約300 公克的新鮮菠菜。此項結果符合 行政院衛生署建議每日蔬菜攝取量。惟上述的推估是在最理想的轉換 率下計算而得，有關食物從攝取進而達到人體內細胞的實際含量，必 須經過更進一步研究，包括葉綠素的生體可利用率、或是葉綠素代謝 產物的轉換率等，才可確認。
四、銅鈉葉綠素的抗氧化作用
銅鈉葉綠素廣泛的用於各種的成藥、食品中，因此與其相關的抗 氧化、抗腫瘤研究亦是備受注目。Kumar 等學者在 1999 年第一位提 出Chlin 抗氧化的量化研究；發現當 plasmid DNA 暴露在 6 Gy 的 γ 輻射線照射下會產生氧化傷害而造成單股斷裂，若DNA 在照射前先 添加不同濃度的Chlin (10µM~100µM) ，其 DNA 的氧化傷害保護效
果隨著 Chlin 劑量的增加而有顯著的效果 (22.6~68.1%的抑制 DNA 單股斷裂) ，接著利用 pulse radiolysis 來實際測量 Chlin 捕捉自由基 的能力亦發現：這些自由基 (hydroxyl radical、deoxyribose peroxyl radical、singlet oxygen) 與 Chlin 結合的比例隨著劑量的增加而提高，
且具有相當高的反應常數 (rate constant) (Kumar, et al., 1999；Kamat, et al., 2000) 。
此外，利用 Electron Spin Resonance (ESR)來分析 Chlin 與 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 以及 5,5-dimethyl-1- pyrrolidine-N-oxide with hydroxyl radical 等自由基的化學反應能力 時，証實 Chlin 具有捕捉各種自由基的能力(Kumar, et al., 2001)，此 結果與本實驗中葉綠素清除 DPPH 自由基的結果是一致的，惟過去 學者主要是針對 Chlin 的抗氧化性，本研究更進一步的探討其他存 在自然界中葉綠素的水萃取衍生物清除自由基的能力，發現 Pho a 及 b 的效果比 Chlin 強。
在活體外(ex vivo)的研究上發現：Chlin 可以抑制老鼠肝臟粒線體 中放射現所誘導的脂質過氧化情形；研究顯示 50µM 的 Chlin 的添加 抑制了 53% 的 thiobarbituric acid reactiove substance (TBARS) 與 30.6% 的 lipid hydroperoxides 等自由基的產生；同時其抗氧化酵素 SOD 與 GSH 的含量也相對的比未添加 Chlin 時來的高；若是以相同
濃度的 Chlin 與維生素 C、mannitol 以及 tert-butanil 來比較對老鼠肝 臟粒線體的抗氧化能力時，Chlin 的抗氧化能力最強，且幾乎是維生 素C 的 2 倍。由此可知 Chlin 可以保護粒線體的細胞膜來對抗放射線 所造成的氧化傷害(Kamat, et al., 2000)。
五、吡碄類(porphyrins)的抗氧化作用
葉綠素的基本結構為四個 pyrrole 所組成的吡碄環(porphyrins)，
其中共有 11 個共軛雙鍵(conjugated double bounds)。若與類胡蘿蔔素 相比較，植物黃體素(lutein)與玉米黃素(zeaxanthin)含有 9 個共軛雙 鍵；茄紅素與胡蘿蔔素含有 11 個共軛雙鍵，隨著共軛雙鍵數目增加 其抗氧化性隨之增加，吡碄環中共有 11 個共軛雙鍵，因此具有極佳 的 singlet oxygen 或自由基反應結合能力。
從脂質自動氧化(autoxidation)的研究中亦發現：將葉綠素添加在 油脂中，其過氧化價(peroxide value, POV)明顯的比未添加葉綠素低；
且由 ESR 的分析證實有葉綠素 π 陽離子自由基(π-cation radical)的存 在，顯示葉綠素在油脂氧化反應中容易失去電子而形成 tetrapyrrole radical cation，同時這些電子可以提供給自由基來終止連鎖的過氧化 作用(Endo, et al., 1985)。
除了葉綠素之外，其他吡碄環結構的化合物也被證實可以形成π 陽 離 子 自 由 基 ， 例 如 tetraarylporphyrin (Borg, et al., 1970) 、
bacteriochlorophyll 、bacteriopheophytin (McElroy, et al., 1974)、鐵離 子或是銅離子的吡碄環 (Ravikanth, et al., 1994)、鎳離子的吡碄環 (Renner and Fajer, 2001)以及其他類吡碄環結構的化合物等(Jayaraj, et al., 1996 ；Scheidt, et al., 1996)，因此可以合理的去證實葉綠素的代 謝產物中，只要具有吡碄環結構都可以藉由以下的反應機制來達成安 定自由基目的(Endo et al. 1985)：
ROO
·
+ Chlorophyll → ROO：
(－) Chlorophyll·
(+)ROO
：
(－) Chlorophyll·
(+) + ROO·
→ Inactive products (ROO·
; peroxyl radical)六、天然葉綠素代謝產物的抗氧化比較
從上述的討論中發現，帶有吡碄環結構是葉綠素最主要抗氧化的 位置，不過其餘部分的化學結構的差異亦會對葉綠素的抗氧化性產生 影響。Lanfer-Marquez 等學者(2005)利用β-胡蘿蔔素顏色消失的速度 (β-carotene blenching method)，來測定葉綠素代謝產物的抗氧化能 力。結果發現：帶有醛基 (-CHO) 的葉綠素代謝產物 Phe b 比帶有甲 基 (-CH3) 的 Pho a 更有較強的抗氧化能力)。這樣的結果與本實驗利 用DPPH 自由基的清除效果相比是一致的。
在本研究中，更進一步的探討各種葉綠素代謝產物在細胞內的抗
況，亦或是測量氧化傷害的代謝產物8-OHdG 時，Chlide a 與 b 之間，
以及 Pho a 與 b 之間是沒有顯著的差異的，是否 a 、b 結構在體內 的細胞穿透力上不同，或是在細胞中代謝的途徑不同，則需進一步的 研究來證實。
在葉綠素的吡碄環結構中，是否有螯合離子或是不同種類的離子 螯合在其中間，亦會對葉綠素的抗氧化性產生影響，從本研究中發 現：所有葉綠素的衍生產物對低濃度的 H2O2都具有保護的效果，但 對於高濃度下的 H2O2 則僅 Pho 仍能抵抗細胞的氧化傷害；且從 DPPH 的實驗中也證實 Pho 的抗氧化作用最強，其次是 Chlin，最後 是Chlide。若從這些葉綠素代謝產物的化學結構來分析：Chlide 含有 鎂離子；Chlin 含有銅離子而 Pho 的結構中是不含任何金屬離子。過 去的研究發現：吡碄環結構中具有螯合離子的能力(Longo, et al., 1973)；過去在中研院植物所的研究中，曾對其他四種極性較低的葉 綠素衍生物在螯合亞鐵離子的能力上做比較時發現：與Pho 同樣未帶 有鎂離子的脫植醇葉綠素(Phe)，在螯合亞鐵離子的能力表現上比帶 有鎂離子的葉綠素高(unpublished data)。推測在本研究中，淋巴球細 胞在添加 Pho 之後，除了吡碄環結構可安定細胞中 H2O2 自由基之 外，還具有較佳的能力去螯合亞鐵離子，進而減少亞鐵離子在細胞中 產生Fenton 作用(圖二)，使金屬離子誘導的氧化傷害降到最低。
第四章 葉綠素的水萃取衍生物對黃麴毒素所誘導肝細胞 DNA 損傷 之影響
第一節 研究方法
本 研 究 的 主 旨 為 探 討 葉綠素及其衍生物對於黃麴毒素所誘導 的肝臟細胞DNA 損傷的影響。由於過去研究顯示，含銅鈉葉綠素可 以有效的抑制DNA 突變，因此本研究以 Chlin 為對照實驗，與其他 的葉綠素水萃取物作比較。
一、實驗材料
綠素水萃取物的製備：同前述 二、分析項目與測量方法
(一) 細胞株的選取
本研究以 Hepa-1c1c7 (Hepa-1)細胞作為研究對象，細胞株來自於 食品工業研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Centre Taiwan).。Hepa-1 細胞為小鼠肝腫瘤細胞(mouse hepatoma)，可培養在 90% Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 與添加10% 胎牛血清的培養基中，並培養在 37 °C 溫度與 5%
CO2/95% 的空氣中。相關的研究指出，此細胞株能穩定的表現細胞 色素P450-1A 的活性，且對於 AFB1有高度敏感的細胞毒性
(Karenlampi, 1987)。
(二) 黃麴毒素的來源與濃度的選擇
黃麴毒素 B1(AFB1)購自 sigma 公司，將購得之黴菌毒素，配置的 方法是將適量的dimethyl sulfoxide (DMSO)溶劑注入 AFB1的商品瓶 中，搖晃使黴菌毒素的結晶溶解成50 mg/mL 的濃度，之後再以蒸餾 水稀釋，並以微量離心管分裝，置於-20℃冰箱保存備用。
由於 Hepa-1 細胞株對 AFB1有高度敏感的細胞毒性，在培養 48
由於 Hepa-1 細胞株對 AFB1有高度敏感的細胞毒性，在培養 48